Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d'analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

L'objectif général de cette procédure est de réaliser et d'évaluer des expériences de transfert génique en utilisant des nanoparticules polymériques non virales. Cela est réalisé en transfectant d'abord des cellules avec des particules de transfert génique. L'efficacité de la transfection est ensuite évaluée par microscopie et par analyse en cytométrie en flux à haut débit.

Ensuite, la concentration de la distribution de la taille des nanoparticules et le nombre de plasmides par particule sont déterminés à l'aide d'un instrument d'analyse de suivi des nanoparticules. En définitive, cette méthode permet la caractérisation de la taille des nanoparticules et l'évaluation de l'efficacité de transfection à l'aide de nanoparticules. Le principal avantage de l'utilisation de nanoparticules polymériques biodégradables pour la livraison de gènes est qu'elles peuvent être plus sûres et plus efficaces que d'autres méthodes de transfert de gènes.

L'avantage principal de l'analyse de suivi des nanoparticules par rapport aux méthodes existantes telles que la diffusion dynamique de la lumière est qu'elle fournit directement la distribution en nombre moyen et la concentration des particules. Cette méthode permettrait de répondre à des questions clés dans le domaine de la délivrance génique non virale, comme le nombre de plasmides par particule, ce qui est important pour les études de co-expression. Le protocole suivant est démontré en utilisant des cellules endothéliales rétiniennes humaines ou hre comme cellules modèles et des poly(bêta amino esters) ou PBA AEs comme polymères modèles.

Remarquez que les conditions de culture et les solvants peuvent nécessiter des ajustements selon les cellules et les polymères utilisés 24 heures avant la transfection. Utilisez une pipette multipuits pour ensemencer les hre dans des plaques de culture de tissus transparentes à fond plat, de 96 puits, à une concentration de 25 à 50 cellules par microlitre.

Cela permettra d'obtenir une confluence de 70 à 80 % le jour de la transfection. Préparez et étiquetez des plaques claires de 96 puits, non traitées pour la culture cellulaire, afin de les utiliser comme plaques maîtresses pour préparer et diluer le PBA et l'ADN. Deux plaques identiques seront préparées.

Un pour évaluer la toxicité et un pour évaluer l'efficacité de transfection. Suivez le poly beta amino ester ou polymère PVAE et les solutions mères de P-E-G-F-P-N 1D NA à température ambiante. Une fois décongelé, utilisez une pipette à 12 canaux pour préparer un puits contenant 50 microlitres de 0,06 milligramme par millilitre d'ADN dans un tampon d'acétate de sodium 25 millimolaire pour chaque condition.

Ensuite, sur la même plaque, diluer les polymères PBAE à 10 milligrammes par millilitre dans du tampon d'acétate de sodium. Puis diluer davantage les polymères PBAE selon des rapports pondéraux polymère sur ADN de 30 et 60, dans 50 microlitres de tampon d'acétate de sodium. Pour la formation des nanoparticules, utiliser une pipette à 12 canaux afin de combiner les 50 microlitres de PBAE dilué avec les 50 microlitres d'ADN plasmidique dilué, en mélangeant vigoureusement par aspiration et expulsion répétées.

Ensuite, laissez le mélange incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre l'auto-assemblage. Après l'auto-assemblage, utilisez une pipette à 12 canaux pour ajouter goutte à goutte 20 microlitres de la solution de nanoparticules dans chaque puits des cellules ensemencées contenant du milieu, en transfectant quatre puits par condition, comme indiqué sur ce diagramme. Pour chaque plaque, réservez au moins quatre puits pour chacun des contrôles négatif et positif.

Le témoin négatif est constitué de cellules non traitées et les témoins positifs, de cellules transfectées avec un réactif disponible dans le commerce tel que le lipo 2000 ou le Fuge hd. Incuber les plaques contenant les cellules transfectées à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Après l'incubation, utiliser la pipette à 12 canaux pour retirer le milieu des cellules et le remplacer par 100 microlitres par puits de milieu hre frais. Poursuivre l'incubation pendant 24 à 48 heures supplémentaires.

Le lendemain, retirez une plaque de l’incubateur. Évaluez la transfection cellulaire et la toxicité par microscopie à fluorescence, et quantifiez la toxicité cellulaire à l’aide du test Cell Titer 96 Aqueous One, comme décrit dans le texte accompagnant. Après 48 heures, retirez l’autre plaque de l’incubateur.

Évaluer l'efficacité de la transfection par fluorescence, microscopie et cytométrie en flux comme décrit dans le texte accompagnant. Utiliser les données de toxicité et de transfection obtenues ici pour déterminer les concentrations optimales de PBAs à utiliser dans les expériences futures. Le nano site NS 500 est un instrument d'analyse de suivi de nanoparticules qui peut fournir des informations sur la distribution de taille d'un échantillon de nanoparticules en suivant la diffusion des nanoparticules individuelles ; avant utilisation, amorcer le système fluidique du nano site dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre.

Préparez le PBA et l'ADN plasmatique pour l'analyse comme précédemment, aux mêmes concentrations utilisées dans la section précédente de cette vidéo. Après l'auto-assemblage, diluez la solution de nanoparticules 100 fois dans du PBS dans un nouveau tube de 1,5 millilitre afin d'obtenir un volume final d'au moins 500 microlitres. Cela permettra d'obtenir une concentration de nanoparticules dans la plage appropriée pour l'analyse de suivi des nanoparticules.

Ensuite, chargez l'échantillon dans le site nano. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air et vérifiez visuellement qu'il y a entre 20 et 100 particules à l'écran. Un nombre idéal pour le suivi de nanoparticules est d'environ 50 particules.

S'il y a trop ou pas assez de particules, rincez le NS 500, ajustez la dilution dans du PBS et rechargez l'échantillon. Si le nombre de particules à l'écran se situe entre 20 et 100, enregistrez des vidéos. Une fois les vidéos capturées, passez à l'étape de traitement en ouvrant un fichier vidéo dans le même logiciel.

Ensuite, une fois le fichier ouvert, augmentez le gain de l'écran. Sélectionnez l'ajustement automatique des paramètres d'image en cliquant sur les cases appropriées. Si une particule à l'écran est reconnue par le logiciel, elle sera marquée d'une croix rouge.

Une fois que toutes les particules sont marquées, cliquez sur le bouton de traitement dans le logiciel pour traiter le fichier vidéo. La taille des particules, les moyennes de la distribution de taille et la concentration en particules seront alors affichées afin de vérifier que le décompte des particules est précis. Répétez cette procédure en utilisant le même échantillon dilué par deux et par quatre.

Les cellules en milieu PBS ont été transfectées avec des nanoparticules E-G-F-P-P-B-A-E, comme illustré dans cette vidéo. Afin d'évaluer visuellement l'efficacité du transfection, une imagerie par microscopie à fluorescence a été réalisée. Ces images montrent les champs clair, la fluorescence et les images fusionnées des cellules transfectées. Comme on peut le voir sur l'image fusionnée, la majorité des cellules expriment la EGFP et conservent une morphologie normale.

Pour quantifier l'efficacité de transfection, une cytométrie en flux a été réalisée, comme illustré sur cette figure après sélection de la population vivante. La population non résectée ne contenait aucune cellule positive pour EGFP. Toutefois, 71,6 % des cellules traitées étaient positives pour EGFP. Une analyse de suivi des nanoparticules a ensuite été utilisée pour déterminer la distribution de taille et la concentration des nanoparticules.

Pour cette analyse, il est important que la distribution de la taille des particules soit monodispersée. À l’aide de ces informations, le nombre moyen de plasmides par particule peut être calculé en divisant la concentration de plasmides en solution par la concentration de particules déterminée par le NS 500. Le nombre de plasmides par particule suit une distribution qui reflète la distribution de la taille des particules.

Dans l'échantillon, il y aura des particules plus grandes dont la valeur de plasmides par particule est supérieure à la moyenne, ainsi que des particules plus petites dont la valeur de plasmides par particule est inférieure à la moyenne. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas laisser les polymères dégradables trop longtemps dans un solvant aqueux avant d'ajouter les nanoparticules aux cellules ; pour l'utilisation en ncy, ajustez la dilution appropriée pour le calibrage. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transfecter des types cellulaires adhérents à l'aide de polymères non viraux de transfert génique, ainsi que mesurer l'efficacité de la transfection et la distribution de la taille des particules.

N'oubliez pas que le travail avec des cellules humaines présente un risque biologique. Portez toujours des équipements de protection individuelle et travaillez dans une hotte de sécurité biologique lors de la réalisation de cette procédure.