Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d'analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

L’objectif global de cette procédure est de réaliser et d’évaluer des expériences d’administration de gènes à l’aide de nanoparticules polymères non virales. Ceci est accompli en transectant d’abord les cellules avec des particules de livraison de gènes. L’efficacité de la transfection est ensuite évaluée par microscopie et analyse par cytométrie en flux à haut débit.

Ensuite, la distribution granulométrique, la concentration et les plasmides par particule sont déterminés à l’aide d’un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules. En fin de compte, cette méthode permet de caractériser la taille des nanoparticules et l’efficacité de la transfection à l’aide de nanoparticules. Le principal avantage de l’utilisation de nanoparticules polymères biodégradables pour l’administration de gènes est qu’elles peuvent être plus sûres et plus efficaces que les autres méthodes de transfert de gènes.

Le principal avantage de l’analyse de suivi des nanoparticules par rapport aux méthodes existantes telles que la diffusion dynamique de la lumière est que l’analyse du suivi des nanoparticules donne directement la distribution moyenne du nombre et la concentration des particules. Cette méthode aiderait à répondre à des questions clés dans le domaine de l’administration de gènes non viraux, telles que le nombre de plasmides par particule, ce qui est important pour les études de co-expression. Le protocole suivant est démontré en utilisant des cellules endothéliales rétiniennes humaines ou hre comme cellules modèles et des esters poly bêta-aminés ou PBA AE comme polymères modèles.

Notez que les conditions de culture et les solvants peuvent devoir être ajustés en fonction des cellules et des polymères utilisés 24 heures auparavant. Transfection. À l’aide d’une pipette multicanaux, semez l’hre dans une culture de tissus clairs traitée à plat. Plaques inférieures de 96 puits à une concentration de 25 à 50 cellules par microlitre.

Cela donnera une fluidité de 70 à 80 % le jour de la transfection, préparera et étiquetera des plaques claires non traitées par culture tissulaire. Plaques à 96 puits pour servir de plaques maîtresses pour préparer et diluer le PBA et l’ADN. Deux plaques identiques seront préparées.

L’un pour évaluer la toxicité et l’autre pour évaluer l’efficacité de la transfection. Suivez les solutions mères d’ester polybêta-aminoïde ou de polymère PVAE et P-E-G-F-P-N 1D NA à température ambiante. Une fois haché, utilisez une pipette à 12 canaux pour préparer un puits contenant 50 microlitres de 0,06 milligramme par millilitre d’ADN dans un tampon d’acétate de sodium de 25 millimolaires pour chaque condition.

Ensuite, sur la même plaque, diluez les polymères PBAE à 10 milligrammes par millilitre dans un tampon d’acétate de sodium. Ensuite, diluez davantage les polymères PBAE dans des rapports poids/poids d’ADN de 30 et 60 et 50 microlitres de tampon d’acétate de sodium. Pour la formation de nanoparticules, utilisez une pipette à 12 canaux pour combiner les 50 microlitres de PBA dilué avec les 50 microlitres d’ADN plasma dilué mélangés vigoureusement en pipetant de haut en bas.

Laissez ensuite incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre l’auto-assemblage. Après l’auto-assemblage, à l’aide d’une pipette à 12 canaux, ajouter goutte à goutte 20 microlitres de solution de nanoparticules à chaque puits des cellules ensemencées contenant du milieu transfectent quatre puits par condition, comme le montre ce schéma. Pour chaque plaque, réservez au moins quatre puits pour chacun des témoins négatifs et positifs.

Le contrôle négatif est constitué de cellules non traitées et les témoins positifs sont constitués de cellules transfectées avec un réactif disponible dans le commerce tel que lipo 2000 ou Fuge hd. Incuber les plaques avec les cellules transfectées à 37 degrés Celsius pendant quatre heures Après l’incubation, utilisez la pipette à 12 canaux pour retirer le milieu des cellules et le remplacer par 100 microlitres par puits de hre frais. Incuber à moyen pendant 24 à 48 heures supplémentaires.

Le lendemain, retirez une assiette de l’incubateur. Évaluer la transfection cellulaire et la toxicité par microscopie à fluorescence, et quantifier la toxicité cellulaire à l’aide du test aqueux du titre cellulaire 96, comme décrit dans le texte ci-joint. Après 48 heures, retirez l’autre plaque de l’incubateur.

Évaluez l’efficacité de la transfection par fluorescence, microscopie et cytométrie en flux, comme décrit dans le texte d’accompagnement. Utilisez les données de toxicité et de transfection acquises ici pour déterminer les concentrations optimales de PBA à utiliser pour les expériences futures. Le nanosite NS 500 est un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules qui peut fournir des informations sur la distribution granulométrique d’un échantillon de nanoparticules en suivant la diffusion de nanoparticules individuelles avant de les utiliser pour amorcer le système fluidique du site nano dans un tube à centrifuger de 0,5 millilitre.

Préparez le PBA et l’ADN plasmatique pour l’analyse comme précédemment aux mêmes concentrations que celles utilisées dans la section précédente de cette vidéo. Après l’auto-assemblage, diluez la solution de nanoparticules 100 fois dans du PBS dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pour obtenir un volume final d’au moins 500 microlitres. Cela permettra d’obtenir une concentration de nanoparticules dans la plage appropriée pour l’analyse de suivi des nanoparticules.

Ensuite, chargez l’échantillon dans le site nano. Assurez-vous de ne pas introduire de bulles d’air vérifiées visuellement pour vous assurer qu’il y a entre 20 et 100 particules à l’écran. Un nombre idéal pour le suivi des nanoparticules est d’environ 50 particules.

S’il y en a trop ou pas assez, rincez le NS 500, ajustez la dilution dans le PBS et rechargez l’échantillon. Si le nombre de particules à l’écran est compris entre 20 et 100, capturez des vidéos. Une fois les vidéos capturées, passez à l’étape de traitement en ouvrant un fichier vidéo dans le même logiciel.

Ensuite, une fois le fichier ouvert, augmentez le gain de l’écran. Sélectionnez l’ajustement automatique des paramètres de l’image en cliquant sur les cases appropriées. Si une particule à l’écran est reconnue par le logiciel, elle sera marquée d’une croix rouge.

Une fois que toutes les particules sont marquées, cliquez sur le bouton de traitement dans le logiciel pour traiter le fichier vidéo. La taille des particules, les moyennes de taille de distribution et la concentration des particules seront alors affichées pour vérifier que le nombre de particules est exact. Répétez cette procédure en utilisant le même échantillon dilué par deux x et quatre.

Le Forex dans PBS a été transfecté avec les nanoparticules E-G-F-P-P-B-A-E comme le montre cette vidéo. Pour évaluer visuellement l’efficacité de la transfection, une imagerie par microscopie à fluorescence a été réalisée. Ces images montrent la fluorescence en fond clair et les images fusionnées des cellules transfectées comme on le voit dans l’image fusionnée, une majorité des cellules expriment l’EGFP et maintiennent une morphologie normale.

Pour quantifier l’efficacité de la transfection, une cytométrie en flux a été effectuée, comme on peut le voir sur cette figure, après le contrôle de la population vivante. La population non réséquée ne contenait pas de cellules positives à l’EGFP. Cependant, 71,6 % des cellules traitées étaient positives pour le nanosite EGFP L’analyse de suivi des nanoparticules a ensuite été utilisée pour déterminer la distribution granulométrique et la concentration des nanoparticules.

Pour cette analyse, il est important que la distribution granulométrique soit monodispersée. À l’aide de ces informations, le nombre moyen de plasmides par particule peut être calculé en divisant la concentration de plasmides en solution par la concentration de particules déterminée par le NS 500. Le nombre de plasmides par particule est une distribution qui reflète la distribution granulométrique.

Dans l’échantillon, il y aura des particules plus grosses avec une valeur de plasmides par particule supérieure à la moyenne, ainsi que des particules plus petites avec une valeur de plasmides par particule inférieure à la moyenne. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas laisser les polymères dégradables rester trop longtemps dans le solvant aqueux avant d’ajouter des nanoparticules aux cellules pour l’utilisation, ajustez la dilution appropriée pour le dimensionnement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter des types de cellules d’adhérence avec des polymères de libération de gènes non viraux, ainsi que de mesurer l’efficacité de la transfection, ainsi que la distribution de la taille des particules.

N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines est biodangereux. Portez toujours un équipement de protection individuelle et travaillez dans une enceinte de biosécurité pendant que vous effectuez cette procédure.