Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une technique basée sur la PCR afin de quantifier l'engraftement des cellules donneuses dans un modèle compétitif de transplantation de moelle osseuse chez la souris. Cette approche consiste d'abord à effectuer une transplantation de moelle osseuse chez des souris receveuses femelles à l'aide de cellules donneuses mâles. Ensuite, du sang périphérique est prélevé chez les souris receveuses à différents intervalles de temps, et l'ADN génomique est isolé. Les échantillons sont ensuite préparés pour établir une courbe standard.

Enfin, une PCR en temps réel est réalisée avec des échantillons standards et des échantillons à tester. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'attecement de cellules provenant de donneurs mâles chez des souris receveuses femelles, grâce au calcul par rapport à une courbe standard avec un pourcentage connu d'ADN mâle par rapport à l'ADN femelle. L'avantage du sexe mâle dans cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la cytométrie en flux, est qu'elle est plus sensible, plus économique et que les échantillons peuvent être conservés longtemps.

Plus important encore, notre technique est très peu dépendante de la souche et peut être utilisée avec n'importe quel fonds génomique de souris, comme un marqueur de surface cellulaire bien défini permettant de distinguer les cellules donneuses des cellules receveuses. Après euthanasie des souris mâles donneurs et des souris femelles FVB nj sous une hotte à flux laminaire, utiliser de petites ciseaux et une pince pour disséquer les os du fémur et du tibia et les placer dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres contenant six millilitres de RPMI 1640 glacé avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur. Utiliser un essuie-tout Kim pour enlever les muscles et autres tissus, puis couper les deux extrémités de chaque diaphyse dans la boîte. Ensuite, relier l'extrémité des os à une aiguille de 23 gauge fixée à une seringue de 3 cm³ remplie de RPMI 1640 avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur, et rincer la moelle osseuse.

Utilisez la même aiguille pour désagréger le tissu de moelle osseuse par des aspirations répétées. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 400 ×g. Après avoir retiré le surnageant, resuspendez les cellules dans un millilitre de tampon de lyse des érythrocytes à température ambiante, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes avant d'ajouter de cinq à dix millilitres de RPMI 1640 contenant 5 % de FBS inactivé par la chaleur. Faites passer les cellules à travers un filtre cellulaire et récupérez le flux sortant dans un nouveau tube. Après avoir centrifugé les cellules pendant cinq minutes à 400 ×g et avoir éliminé le surnageant, le culot ne doit plus présenter de couleur rouge, ce qui indique une élimination complète des globules rouges. Resuspendez-le alors dans 10 millilitres de RPMI 1640 contenant 5 % de FBS inactivé par la chaleur. Après un vortexage doux, ajoutez une petite aliquote à un hémocytomètre et comptez les cellules.

Calculez le volume de cellules nécessaire à mélanger avec les cellules femelles compétitrices dans un rapport de cinq à deux pour la transplantation de moelle osseuse. Comme étape finale de préparation des cellules pour injection, mélangez les cellules donneuses et compétitrices, centrifugez les cellules, lavez-les avec du PBS et resuspendez-les dans du PBS à une concentration finale de 5 × 10⁶ cellules par millilitre pour les cellules donneuses et de 2 × 10⁶ cellules par millilitre pour les cellules compétitrices, quatre à six heures avant la transplantation de moelle osseuse. Irradiez les souris femelles receveuses avec un rayonnement gamma au césium 137 à une dose unique de 11 grays.

Placer les souris femelles irradiées dans un dispositif de contention pour souris et injecter, par la veine de la queue, un volume total de 0,1 millilitre du mélange de cellules donneuses et compétitrices, de sorte que chaque souris reçoive cinq fois 10 à la puissance 5 cellules donneuses et deux fois 10 à la puissance 5 cellules de moelle osseuse compétitrices afin de prélever des échantillons sanguins. Après anesthésie, prélever environ 50 microlitres de sang dans des tubes revêtus d’EDTA par saignement rétro-orbitaire. Prélever également des échantillons chez des souris mâles et femelles appariées par âge.

Ensuite, isoler l'ADN génomique à partir de souris sujettes et de souris. Pour la courbe standard, ajouter environ 200 microlitres de tampon de lyse des globules rouges à température ambiante à chaque échantillon de sang et incuber pendant cinq minutes. Ajouter un millilitre de PBS et centrifuger pour éliminer la majorité des globules rouges lysés.

Ensuite, utilisez un kit d'extraction de l'ADN sanguin pour isoler l'ADN en préchauffant le tampon d'élution à 37 degrés Celsius. Pour améliorer le rendement, mesurez la concentration en ADN de chaque échantillon. Ceux dont le rapport OD 260/280 se situe entre 1,8 et 2,0 sont utilisés pour des analyses supplémentaires.

Pour établir une courbe standard, diluez l'ADN mâle et l'ADN femelle à une concentration de quatre nanogrammes par microlitre et préparez le mélange d'ADN selon ces consignes. Préparez la plaque de réaction PCR en mélangeant le réactif cyber green super mix avec les amorces indiquées ici et l'ADN génomique. Chaque réaction de 20 microlitres contient 400 nano molar de chaque amorce et cinq microlitres d'ADN génomique de cellules sanguines, réalisée en triple exemplaire.

Réaliser la PCR selon les conditions indiquées dans le protocole écrit et obtenir les valeurs de seuil de cycle ou CT. Calculer le delta CT comme la quantité CT élevée à la puissance ZY1 moins CT élevée à la puissance BCL2, puis les niveaux d'expression de ZY1 ou 2 élevée à la puissance moins delta CT. Générer des courbes standards en traçant la moyenne des valeurs de 2 élevée à la puissance delta CT réalisées en triplicat en fonction du pourcentage connu d'ADN masculin dans le mélange, avec un ajustement par régression linéaire. Voici des exemples de courbes standards tracées avec les valeurs moyennes de 2 élevée à la puissance delta CT en fonction des pourcentages d'ADN masculin.

Ce graphique inclut une température de fusion spécifique pour les amplicons BCL deux et ZFY un, localisées à 78,5 et 88,5 degrés Celsius respectivement. BCL deux est utilisé comme gène de référence pour normaliser la quantité totale d'ADN chargée dans chaque réaction de PCR. Les courbes d'amplification de BCL deux pour chaque échantillon standard se superposent indépendamment de la concentration d'ADN masculin, indiquant des quantités équivalentes d'ADN chargées.

Cependant, les courbes d'amplification de ZFY ont migré vers la gauche avec l'augmentation des quantités d'ADN masculin dans l'échantillon. Les cellules souches hématopoïétiques provenant de souris PIM TKO présentent des défauts dans la reconstitution de souris soumises à une irradiation létale, et comme prévu, les souris receveuses transplantées avec des cellules PIM TKO avaient un pourcentage nettement plus faible de cellules mâles comparé aux souris transplantées avec des cellules de type sauvage. Afin de valider notre méthode, nous avons testé l'engraftement des cellules donneuses mâles chez des souris femelles transplantées, recevant des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage par rapport à des souris PIM triple invalidées (TKO) à différents moments après la transplantation, tant au niveau du sang périphérique à six semaines qu'au niveau des échantillons de moelle osseuse à 16 semaines. Ces échantillons ont été analysés après visionnage de cette vidéo.

Vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode basée sur la PCR pour quantifier l'engraftement des cellules donneuses dans un modèle de transplantation compétitive de moelle osseuse chez la souris.