Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

L’objectif global de cette procédure est de récolter et de préparer les chromosomes pour les bandes GB et les tests cytogénétiques moléculaires. Tout d’abord, cultivez les cellules jusqu’à la phase logarithmique. Récoltez ensuite les chromosomes avec un smid, un hypotonique et un fixateur.

Déposez la suspension cellulaire dans des lames. Teignez une diapositive. En tant que moniteur de la préparation chromosomique, passez à l’étiquetage GB ou aux techniques moléculaires des lames restantes.

Comme dernière étape du baguage GB, analysez les chromosomes par microscopie optique et caryotype. En fin de compte, les chromosomes et les noyaux seront disponibles pour le caryotype ou le poisson. J’ai d’abord eu l’idée de publier cette méthode en raison de la forte demande d’autres chercheurs demandant de l’aide pour la détection de l’instabilité chromosomique dans différents types de cellules de divers organismes et pour les tests cytogénétiques moléculaires ultérieurs.

Cette technique est essentielle dans le diagnostic et le pronostic de nombreuses maladies génétiques congénitales, y compris le cancer, car elle permet de visualiser les réarrangements chromosomiques, qui sont diagnostiques. Pour ces troubles, bien que cette méthode puisse donner un aperçu des réarrangements chromosomiques trouvés dans divers types de cellules humaines. Il peut également être appliqué sur des cellules d’autres organismes tels que Resus Maca, rats et souris Culture.

2 millions de cellules adhérentes à 80 % de fluidité et ajoutez 10 microlitres de 10 microgrammes par millilitre. Col par millilitre de cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 45 minutes.

Ensuite, à l’aide d’une pipette stérile, transférez le milieu de la culture dans un tube conique de 15 millilitres et réservez-le pour plus tard. Pour laver les cellules, ajoutez deux millilitres de HBSS dans le ballon, agitez et retirez le tampon. Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine en vous assurant qu’elle couvre toute la surface du ballon. Une fois que la majorité des cellules se sont détachées, pipetez le support dans le tube conique sur les cellules.

Aliquote 10 millilitres de la suspension cellulaire dans des tubes coniques de 15 millilitres. Centrifuger à 200 Gs pendant 10 minutes. Retirez le supernat.

Suspendez à nouveau la pastille dans 10 millilitres de chlorure de potassium de 75 millimolaires, qui seront préchauffés à 37 degrés Celsius après une incubation de 10 minutes à 37 degrés Celsius. Centrifuger à 200 G pendant cinq minutes. À 25 degrés Celsius, retirez tout le surnageant sauf 0,5 millilitre et remettez la pastille en suspension avec précaution.

Ajoutez cinq millilitres de fixateur de bruit de voiture frais dans les cellules. Ajoutez ensuite cinq millilitres, plus de fixateur et de centrifugeuse vortex à 200 G pendant cinq minutes. Resus, suspendre chaque pastille cellulaire dans cinq millilitres de fixateur.

Stockez les cellules à quatre degrés jusqu’à un an. Centrifugez les cellules à 200 G pendant cinq minutes. À 25 degrés Celsius.

Retirez le supnatant jusqu’à ce qu’il ne reste plus que 0,3 à 0,5 millilitres après la suspension douce de la pastille. Pipetez trois gouttes de la suspension cellulaire à une distance d’environ deux pouces sur une lame inclinée à un angle d’environ 45 degrés. Et laissez la suspension rouler sur le toboggan.

Ajoutez une grosse goutte de bruit de voiture frais, fixateur à la glissière. Enfoncez l’arrière du toboggan sur une serviette en papier, puis asseyez le toboggan pour qu’il sèche complètement. Préparez une solution fraîche de maintien du gim.

Placez les lames sur une grille de coloration. Couvrez toute la lame dans la solution de maintien gim. Après cinq minutes, rincez les lames avec une vidange d’eau distillée et laissez sécher à l’air.

Ajoutez quatre gouttes de support permanent à la glissière et placez une lamelle en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles sous la lamelle. Retirez l’excédent par support avec une serviette en papier. Analysez les cellules avec un microscope optique sous un grossissement de 10 x et 100 x.

Si les cellules en métaphase sont abondantes et bien réparties, les lames restantes peuvent être utilisées pour d’autres procédures expérimentales. Ajoutez 50 millilitres de solutions de traitement dans quatre bocaux Copeland. Plongez chaque diapositive dans le bocal numéro un pendant cinq secondes après.

Rinçage rapide de la lame dans le bocal numéro deux. Laissez-le dans le bocal numéro trois pendant au moins 30 secondes. Rincez dans le bocal numéro quatre, puis laissez sécher les lames.

Préparez une solution fraîche de maintien GIM. Placez les lames sur une grille de coloration. Couvrez toute la lame dans la solution de maintien gim pendant cinq minutes.

Rincez les lames et l’eau distillée dans le même ordre qu’elles ont été tachées. Ensuite, séchez pendant au moins 10 minutes. Placez une lamelle à l’aide d’un support permanent comme indiqué précédemment.

Analysez ensuite les cellules au microscope optique pour les lames restantes. Ajustez le temps d’incubation des voyages. D’après les résultats de la première diapositive.

Un test réussi donne des chromosomes bien répartis et d’une morphologie chromosomique appropriée. Convenablement. Les chromosomes à bandes GB contiennent les motifs caractéristiques de bandes claires et foncées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récolter les chromosomes pour le bandage GB et d’autres tests cytogénétiques moléculaires dans l’élucidation de l’instabilité chromosomique.

Une fois maîtrisée, cette technique de récolte peut se faire en trois heures environ si elle est bien exécutée. Pour la procédure de bande GB, il est important de tester d’abord le temps d’incubation tripsin sur une lame avant de passer à la bande GB. Le reste des diapositives.