Name: Chromosome Préparation partir des cellules cultivées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Apprenez à préparer des chromosomes à partir de cellules cultivées pour la cytogénétique. Cette méthode permet le G-banding et la FISH pour analyser les réarrangements chromosomiques chez l'humain et la souris.

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Travaux décrits dans ce manuscrit a été rendue possible grâce au financement de la Fondation Patrick F. Taylor.

Une. Chromosome récolte de cellules adhérentes <ol><li> Protocole standard <ol><li> Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (80% de confluence), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules. Un minimum de 2 x 10 6 cellules est recommandée. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 45 min. En utilisant une pipette stérile, transférer médias de cellules dans un tube de 15 ml conique. Mettre de côté. </li><li> Lavez délicatement les cellules en ajoutant 2 ml de HBSS tampon dans le flacon. Tampon tourbillon puis retirez à l&#39;aide d&#39;une pipette. Jeter. </li><li> Ajouter 1 ml de trypsine, en veillant à ce qu&#39;il couvre toute la surface du flacon. Ne laisser que les cellules de la trypsine pendant environ 2 min. Une fois que la majorité des cellules ont détaché, la pipette les médias dans le tube conique en arrière sur les cellules. </li><li> Transférer la suspension cellulaire en aliquotes de 10 ml dans des tubes de 15 ml coniques.Centrifuger à 200 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et remettre le culot. </li><li> Ajouter 10 ml de 0,075 M de KCl, qui a été préchauffée à 37 ° C et le culot restant dans le tube conique. Vortex à vitesse moyenne pour mélanger KCl et cellules. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 min. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 25 ° C. Retirer le surnageant (jusqu&#39;à environ 0,5 ml restes) et remettre le culot. </li><li> Ajouter avec précaution 5 ml de fixateur de Carnoy frais (3:1 de méthanol: acide acétique glacial) pour les cellules tout en vortex. Ajouter ensuite 5 ml de fixateur sans plus de vortex pour un total de 10 ml. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension. Ajouter 5 ml de fixateur dans chaque tube. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension. Ajouter 5 ml de fixateur dans chaque tube. Les cellules peuvent à présent être stockées dans le 4 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li></ol></li><li> Modification du protocole: harvesti chromosomiquesng de lignées de cellules lymphoblastoïdes <ol><li> Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. (Utilisez le flacon approprié pour la quantité de cellules mises en culture). Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (environ 2 jours après les cellules sont split), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules. </li></ol></li><li> Modification du protocole: Chromosome récolte du sang total Phytohémagglutinine (PHA), un dérivé de la lectine de haricot rouge, est un puissant agent mitogene pour les cellules T humaines 16. 72 h après l&#39;addition de PHA à la culture, environ 45% des cellules sont en phase S. Cela représente le pic d&#39;activité mitotique, et est le point optimal pour la récolte pour les études de chromosomes. D&#39;autres agents mitogènes tels que la phytolaque (1-10 pg / ml) peuvent être utilisés dans l&#39;analyse de cellules B 17,18. <ol><li> Prélever au moins 1 ml de sang total dans un tube à héparine de sodium top vert. Utiliser dans les 3 jours suivant la collecte. sang de magasin à la température ambiante nontil prêt à l&#39;emploi. </li><li> Aliquote de 0,25 ml de sang total dans 10 ml de milieu RPMI complet contenant de la L-glutamine (sérum de veau fœtal à 20%, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% de fungizone et 1% de PHA). Culture à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Modification du protocole: Chromosome récolte de moelle osseuse L&#39;analyse cytogénétique de la moelle osseuse est utile dans de nombreux troubles hématologiques malignes comme l&#39;observation d&#39;un clone de chromosome anormal peut être de diagnostic pour un type spécifique de la leucémie. Des études chromosomiques sont également utilisés pour évaluer la progression de la maladie telle que l&#39;apparition d&#39;une crise blastique et la réponse au traitement. Comme les cellules de la moelle osseuse se divisent activement, aucune stimulation mitogène est nécessaire 9,19. Pour les leucémies aiguës 24 et 48 h cultures sont également mis en place. <ol><li> Prélever au moins 1 ml de moelle osseuse dans un tube à héparine de sodium top vert. Aliquote de 0,25 ml de la moelle osseuse dans 10 ml de milieu RPMI complet contenant de la L-glutamine (20% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% Fungizone). Culture à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Glisser Préparation et coloration solide Une évaluation rapide d&#39;une diapositive représentant fournira des informations sur la qualité de la récolte avant de continuer à d&#39;autres procédures telles que G-banding, FISH, CGH, ou SKY. Certains laboratoires préfèrent tache solide, les cellules de récolte rapide et de l&#39;évaluation de chromosome. En variante, un microscope à contraste de phase peut être utilisé pour cette analyse. Les lames sont préparés au mieux lorsque le taux d&#39;humidité est d&#39;environ 50% et la température ambiante de (20 à 25 ° C). <ol><li> Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à 25 ° C. Retirer le surnageant jusqu&#39;à seulement 0,3-0,5 ml restes. </li><li> Après remise en suspension doucement la pastille, pipettes trois gouttes de la suspension de cellules à partir d&#39;une distance d&#39;environ 2 à sur une lame qui est incliné à un angle d&#39;environ 45 ° et permettre à la suspensionà rouler à travers la diapositive. Ajoutez une grosse goutte de fixateur de Carnoy frais à la diapositive. </li><li> Sécher le dos de la lame sur une serviette en papier, puis reposer la diapositive à sécher pendant au moins 10 min. La lame doit être complètement sec. </li><li> Préparer une nouvelle solution de coloration Giemsa (3:1 ratio de tampon Gurr et Giemsa). Placer les lames sur un support de coloration. Couvrir l&#39;ensemble de la diapositive dans la solution de coloration de Giemsa. Que les glissières restent dans la solution de coloration pendant 5 min. Rincer les lames avec de l&#39;eau distillée, les égoutter et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Ajouter 4 gouttes de Permount et une lamelle sur la lame. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles sous la lamelle. L&#39;excédent Permount peut être enlevé avec une serviette en papier. </li><li> Analyser les cellules avec un microscope optique à 10X et 100X. Si les cellules en métaphase sont abondants et bon étalement, les lames restantes peuvent être utilisées pour d&#39;autres procédures expérimentales. </li></ol> 3. G-baguage utilisant de la trypsine et Giemsa (GTG) &lt;p&gt; La trypsine est une enzyme protéolytique qui dénature euchromatiques histones dans des régions d&#39;ADN avec une activité transcriptionnelle plus élevée qui en résulte. Après Giemsa, ces régions apparaissent comme des bandes claires. Chromatine fortement condensée avec l&#39;activité transcriptionnelle peu ou pas (hétérochromatine) aura une grande partie de ses histones protégées à partir de la trypsine et ne sera donc tache sombre suivant la coloration de Giemsa. Il est essentiel de d&#39;abord la bande G une diapositive à surveiller les conditions et ajuster le calendrier de la trypsine si nécessaire pour les diapositives suivantes. <ol><li> Ajouter les solutions suivantes pour 4 jarres de Coplin. Pot # 1 = 30 ml de HBSS 1x et 4 ml de 10x la trypsine (0,5%) Pot n ° 2 = 50 ml de HBSS 1x Pot n ° 3 = 45 ml de HBSS 1x et 5 ml de sérum foetal bovin Pot n ° 4 = 50 ml de HBSS 1x </li><li> Plongez chaque diapositive dans le pot n ° 1 pendant 5 sec, rinçage rapide dans le pot n ° 2, laisser chaque diapositive dans le pot n ° 3 pendant au moins 30 secondes, rinçage rapide dans le pot n ° 4 puis laissez lames sécher. </li><li> Préparer fresh Giemsa Solution (3:1 de tampon Gurr et Giemsa). Placer les lames sur un support de coloration. Couvrir l&#39;ensemble de la diapositive dans la solution de coloration de Giemsa. Que les glissières restent dans la solution de coloration pendant 5 min. </li><li> Rincer les lames dans de l&#39;eau distillée dans le même ordre qu&#39;ils ont été colorées. Laisser les lames sécher pendant environ 10 min. La lame doit être complètement sec. </li><li> Ajouter 4 gouttes de Permount et une lamelle sur la lame. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles sous la lamelle. L&#39;excédent Permount peut être enlevé avec une serviette en papier. </li><li> Analyser les cellules avec un microscope optique à 10X et 100X. Ajuster la trypsine synchronisation du reste des diapositives sur la base des résultats de la première glissière. </li></ol>

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</ol>

Nous avons utilisé la présente procédure pour l&#39;isolement du chromosome à partir de cellules de différents organismes, y compris divers types de cellules obtenues à partir de l&#39;homme, les macaques rhésus, les rats, les souris et les 11,20-22. Le protocole standard est fourni, mais peut être ajustée pour ces divers types de cellules certaines étapes et variables clés. Plusieurs mesures spécifiques sont indispensables à la fois dans la préparation chromosomique et G-bandes pour assurer la meilleure qual...

L&#39;analyse des chromosomes est une technique classique utilisée dans le monde entier pour diagnostiquer l&#39;instabilité chromosomique et réarrangements conduisant à des troubles génétiques et cancer 1,2,8,9. En outre, une résolution plus élevée pour le diagnostic et la recherche d&#39;anomalies génétiques constitutionnels et cancer acquis peut être réalisé avec la combinaison des procédures cytogénétique classique et des méthodes de cytogénétique moléculaire telles que l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), l&#39;hybridation génomique comparative (CGH) , et le caryotype spectral (SKY) 14,15. Plus récemment, ces techniques ont été utilisées pour l&#39;évaluation de l&#39;instabilité chromosomique associée à la recherche sur les cellules souches. Anomalies caryotypiques telles que l&#39;aneuploïdie des cellules en culture à long terme embryonnaires (ES) et des cellules souches adultes de divers organismes ont été rapportés par plusieurs laboratoires. Les données récentes confirment que certaines lignées cellulaires sont par nature plus enclins à chromosome instabilité, indépendamment des conditions de culture. Pour cette raison, lors de l&#39;établissement et / ou le maintien de lignées de cellules souches rhésus humain, une souris ou, une analyse chromosomique est recommandé dans le cadre du processus de contrôle de la qualité. De nombreux rapports décrivent l&#39;intérêt croissant pour l&#39;utilisation de la cytogénétique et moléculaire de routine pour surveiller la stabilité chromosomique de cellules souches et de cellules malignes ou de divers organismes en culture de 10 à 13. Ces protocoles sont de plus en plus utilisés par des laboratoires non génétiques pour l&#39;évaluation chromosomique rapide de leurs cellules en culture 13. Nous présentons nos procédures de base pour la préparation des chromosomes de différents types de cellules, qui peuvent être appliquées à des fins et des cellules cliniques et de recherche provenant de divers organismes.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Tampon Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Comprimés « GURR"</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>Référence 11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosome préparation partir des cellules cultivées

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogénétique) analyse est largement utilisée pour la détection de l&#39;instabilité chromosomique. Lorsque suivi par G-banding et techniques moléculaires tels que l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), ce test a l&#39;avantage de pouvoir analyser des cellules individuelles pour les aberrations qui impliquent des gains ou des pertes de portions du génome et des réarrangements impliquant un ou plusieurs chromosomes. Chez l&#39;homme, des anomalies chromosomiques surviennent chez environ 1 pour 160 naissances vivantes 1,2, 60-80% de toutes les fausses couches 3,4, 10% des mortinaissances 2,5, 13% des personnes ayant une maladie cardiaque congénitale 6, 3-6% des cas d&#39;infertilité 2, et chez de nombreux patients atteints de déficience intellectuelle et des malformations congénitales 7. L&#39;analyse cytogénétique des tumeurs malignes est couramment utilisé par les chercheurs et les cliniciens, comme il a été démontré observations d&#39;anomalies chromosomiques clonales à avoir à la fois une signification diagnostique et pronostique 8,9.60, l&#39;isolement de chromosomes est inestimable pour la thérapie génique et les cellules souche d&#39;organismes y compris les primates non humains et les rongeurs 10-13. Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules de tissus vivants, notamment des lymphocytes de sang, les fibroblastes de la peau, les cellules amniotiques, le placenta, la moelle osseuse, et des échantillons de tumeur. Les chromosomes sont analysées au stade de la métaphase de la mitose, quand ils sont les plus condensées et donc plus visible. La première étape de la technique d&#39;isolement du chromosome implique la rupture des fibres du fuseau par incubation avec Colcemid, pour empêcher les cellules de passer à l&#39;étape ultérieure de l&#39;anaphase. Les cellules sont ensuite traitées avec une solution hypotonique et conservés dans leur état gonflé, avec le fixateur de Carnoy. Les cellules sont ensuite déposés sur de diapositives et peuvent ensuite être utilisés pour une variété de procédures. G-banding implique un traitement à la trypsine suivie d&#39;une coloration au Giemsa à créer de la lumière caractéristique et bandes sombres. Le même procedure pour isoler les chromosomes peuvent être utilisés pour la préparation de cellules pour des procédures telles que l&#39;hybridation in situ par fluorescence (FISH), l&#39;hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotypage spectral (SKY) 14,15.

Métaphase écarts de qualité sont essentiels pour l&#39;analyse des chromosomes. Un test réussi donne chromosomes qui sont bien répartis et de la morphologie des chromosomes approprié. Chromosomes correctement G-bagués contiennent la lumière caractéristique et profils de bandes sombres. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Figure 1. Un é...

Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules vivantes telles que des lymphocytes ou des fibroblastes de la peau, et à partir d&#39;organismes, y compris les humains et les souris. Ces préparations de chromosomes peuvent en outre être utilisés pour G-banding routine et les procédures de cytogénétique moléculaire telles que l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), l&#39;hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotype spectral (SKY).

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

L'objectif général de cette procédure est de récolter et de préparer des chromosomes pour le banding GB et les tests de cytogénétique moléculaire. Dans un premier temps, cultivez les cellules en phase logarithmique. Ensuite, récoltez les chromosomes à l'aide de smid, d'un hypotonique et d'un fixateur.Déposer la suspension cellulaire sur des lames. Colorer une lame. En tant que contrôle de la préparation chromosomique, procéder au banding GB ou à des techniques moléculaires sur les lames restantes.En tant qu'étape finale du banding GB, analyser les chromosomes par microscopie optique et caryotypage. En fin de compte, les chromosomes et les noyaux seront disponibles pour un caryotypage ou un test FISH (hybridation in situ par fluorescence). J'ai eu pour la première fois l'idée de publier cette méthode en raison de la forte demande d'autres chercheurs sollicitant une assistance pour la détection de l'instabilité chromosomique dans différents types de cellules provenant de divers organismes, ainsi que pour des tests cytogénétiques moléculaires ultérieurs.Cette technique est essentielle pour le diagnostic et, en fin de compte, le pronostic de nombreuses affections génétiques congénitale

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Caryotype est une technique simple et utile largement utilisé pour détecter les altérations génétiques. Nous décrivons ici une étape par étape pour la préparation du protocole propagation de chromosomes de cellules souches embryonnaires humaines pour la surveillance du statut chromosomique de ces cellules maintenues en culture.

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Procédé pour l'analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l'incorporation de BrdU en combinaison avec...

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Voies de réparation d'ADN sont essentielles pour le maintien de l'intégrité du génome et la prévention de la mutation et le cancer. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique par l'observation directe des aberrations chromosomiques en métaphase se propage à partir de cellules B de souris en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH) pour les répétitions d'ADN télomérique dans.

Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

Les mécanismes moléculaires de la décondensation de la chromatine mitotique hautement compactée sont mal définis. Nous présentons un test acellulaire basé sur des amas de chromatine mitotique isolés de cellules HeLa et d’extrait d’œuf de Xenopus laevis qui reconstitue fidèlement le processus de décondensation in vitro.

A Cell Assay libre d&#39;étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

Un protocole est décrit pour la préparation de disséminations de chromosomes végétaux mitotiques de haute qualité par une méthode de largage rapide à sec à l’air adaptée à la détection FISH de sondes d’ADN à copie unique et à copie élevée.

Un air sec Chromosome Dropping rapide Méthode de préparation adéquate pour les poissons dans les usines

Ce protocole décrit des techniques pour la quantification et la caractérisation des aberrations chromosomiques in vitro dans les macrophages murins RAW264.7 après le traitement avec la matière particulaire de l' air ambiant.

Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; système

Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.

Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

La combinaison de préparations de halo d’ADN avec l’hybridation in situ par fluorescence permet une analyse à haute résolution des interactions génomiques avec le nucléosquelette. Le génome attaché conduit à des signaux fluorescents hybridés situés dans les noyaux extraits résiduels, tandis que le génome non attaché est dans le halo d’ADN entourant les noyaux résiduels.

Hybridation in situ par fluorescence sur des préparations de halo d’ADN pour révéler des chromosomes entiers, des télomères et des loci de gènes

Hi-C 3.0 est un protocole Hi-C amélioré qui combine des agents de réticulation du formaldéhyde et du glutarate de disuccinimidyl avec un cocktail d’enzymes de restriction DpnII et DdeI pour augmenter le rapport signal sur bruit et la résolution de la détection des interactions chromatines.

Capture de la conformation chromosomique à travers les échelles de longueur

Ce protocole décrit la méthode Capture Hi-C utilisée pour caractériser l’organisation 3D de régions génomiques ciblées de taille mégamétrique à haute résolution, y compris les limites des domaines topologiquement associés (TAD) et les interactions chromatines à longue distance entre les éléments de séquence d’ADN régulateurs et autres.

Déchiffrer l’organisation de la chromatine 3D haute résolution via Capture Hi-C

Apprenez à préparer des chromosomes à partir de cellules cultivées pour la cytogénétique. Cette méthode permet le G-banding et la FISH pour analyser les réarrangements chromosomiques chez l'humain et la souris.

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

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