Name: Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez l'isolation des mitochondries associées aux membranes ER (SMMA) et des microdomaines enrichis en glycosphingolipides (GEM) à partir de cerveau de souris adulte. Cette méthode optimise la recherche en neurobiologie cellulaire.

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Nous reconnaissons la contribution de Renata Sano à concevoir le protocole initial. Ad&#39;A. détient les bijoutiers pour les enfants (JFC) de la chaire de génétique et thérapie génique. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH GM60905, DK52025 et CA021764, et les américains libanais syriens Associated Charities (ALSAC).

<html> Le protocole suivant est destiné à l&#39;isolation et la purification de MMA propres et de pierres précieuses du cerveau de souris Solutions nécessaire pour l&#39;isolement des mitochondries, MMA propres et de pierres précieuses Fractionnement pour obtenir brut préparation mitochondriale: Solution A: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2 + inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, le cas échéant) Solution B: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO 3 + inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, le cas échéant) Isolation MMA propres: Moyen d&#39;isolement: 250 mM, HEPES 5 mM mannitol à pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% de BSA Tampon gradient: 225 mM, HEPES 25 mM mannitol à pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% de BSA (concentration finale) Isolation GEM: contenu &quot;&gt; GEM tampon d&#39;extraction: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 1% Triton X-100 + inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, le cas échéant) Tampon de solubilisation GEM: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, EDTA 5 mM, SDS 1% + Inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, au besoin). 1. Le fractionnement subcellulaire Première étape: suppression des noyaux des cellules, non lysées et les débris cellulaires <ol><li> Euthanasier de la souris dans la chambre de CO 2. </li><li> Retirer immédiatement du cerveau, réduire de moitié, placez-le dans tubes de 2 ml sur de la glace et peser. </li></ol> Remarque: Conservez moitiés du cerveau séparé pendant toute la procédure. Ce qui suit s&#39;applique au traitement d&#39;une moitié du cerveau unique. <ol start="3"><li> Placer la moitié du cerveau dans un pré-broyeur réfrigéré 2 ml en verre Dounce tissus contenant 1 ml de solution froide A. Homogénéiser avec 15 coups au total d&#39;un pilon jeu important. </li><li> Transférer dans un tube de 15 ml faucon, sur la glace, et diluerhomogénats jusqu&#39;à 10 volumes p / v, par exemple 0,225 g à 2,25 ml. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 1400 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirez délicatement le surnageant et transférer dans un 30 ml à fond rond tube à centrifuger en verre, sur la glace. Assurez-vous de ne pas perturber le culot. </li><li> Remettre en suspension le culot dans les mêmes 10 volumes de la solution A. Homogénéiser même dans le broyeur, avec 3-6 coups de pilon faible jeu, 1 ml à la fois. </li><li> Transférer dans un nouveau tube Falcon de 15 ml et centrifuger à 710 xg pendant 10 min à 4 ° C. Cela se traduit par une pastille de noyaux et les débris cellulaires. </li><li> Retirez délicatement le surnageant et la piscine avec le surnageant enregistré à l&#39;étape 1.6. </li></ol> 2. Deuxième étape: Isolement brut Mitochondries <ol><li> Centrifuger surnageants à 13800 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube Ultra-Clear Centrifugeuse Beckman, sur la glace </li><li> Resuspendre le culot dans 10 volumes de solution A. Homogénéiser même dans le broyeur, avec 3-6 coups de pilon faible jeu, 1 ml à la fois. </li><li> Centrifugeuse étape 2,1. </li><li> Répétez les étapes 02.02 à 02.04. </li><li> Le culot résultant est une fraction enrichie mitochondrial. Réunir les fractions surnageantes (cytosol et ER), couvrir avec du parafilm et garder sur la glace. </li><li> Remettre en suspension le culot avec 6 coups de pilon faible jeu, dans 4,8 ml / g (g est renvoyé au poids du cerveau d&#39;origine) de la solution B, dans un homogénéisateur frais. </li><li> À l&#39;aide de pipettes Pasteur en verre, préparer un gradient de saccharose discontinu dans un tube ultra-centrifugeuse Beckman dégagé, en ajoutant ensuite à la partie inférieure du tube de la manière suivante, soigneusement, en veillant à pas de bulles sont formées: Resupended Pellet (0,32 M saccharose) 3 mM Saccharose ml 850 (dans 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1 M de saccharose (dans 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1,2 M de saccharose (dans 1 mM NaHCO3) </li><li> Centrifuger à 82500 g pendant 2 h à 4 ° C. La séparation résulte à la fin de la pente se produire trois bandes et un culot: 1) la myéline et autres contaminants membranaires (0,32 M - 0,85 M d&#39;interface), 2) ER, Golgi, membranes plasmiques (0,85 M - 1 M d&#39;interface); 3) synaptosomes (1 M - 1,2 M d&#39;interface), 4) les mitochondries brut (pastille) qui est utilisé pour les étapes de purification ultérieures </li></ol> 3. Isolement des mitochondries associée à membrane du RE, MMA propres <ol><li> Reprendre le brut fraîchement mitochondries isolées à partir de la moitié du cerveau, en 2 Medium Isolation ml contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés. </li><li> Préparer un gradient de Percoll 30% avec le tampon Gradient 8 ml par demi-cerveau, et placer dans un tube Ultra-Clear Centrifugeuse Beckman. </li></ol> * Remarque: Assurez-tampon en gradient plus concentrée (1,43 fois) pour obtenir une concentration finale correcte après diluting Percoll à 30%. <ol start="3"><li> Suspension mitochondriale couche sur le dessus du gradient préparé lentement pour éviter les bulles. </li><li> Centrifuger à 95000 g pendant 30 min, 4 ° C </li><li><ol class="lroman"><li> Retirez la fraction lourde (bande inférieure) d&#39;abord avec une pipette Pasteur en verre et transférer dans un tube en verre à fond rond de frais, sur glace. </li><li> Retirer la fraction légère (bande supérieure) DEUXIÈME avec une autre pipette Pasteur en verre et transférer dans un tube séparé en verre à fond rond de frais, sur glace. </li></ol></li><li> Diluer les deux fractions collectées à l&#39;étape 3.5 avec 10 ml d&#39;isolation moyen et centrifuger à 6300 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant de la fraction lourde obtenue à l&#39;étape 3.6, remettre en suspension le culot avec un autre moyen d&#39;isolation 10 ml et centrifuger à nouveau, comme à l&#39;étape 3.6. Le culot résultant sera la fraction pure mitochondriale. </li><li> Transférer le surnageant du Frac Lumièretion obtenue à l&#39;étape 3.6 à un tube Ultra-Clear Centrifugeuse Beckman, sur la glace. Jeter le culot. </li><li> Ajouter milieu d&#39;isolement suffisante pour le surnageant obtenu à l&#39;étape 3.8 à remplir le tube et centrifuger à 100.000 xg pendant 1 h à 4 ° C. Le culot résultant sera la fraction la SMMA. Retirez délicatement et jeter le surnageant. </li></ol> Remarque: A ce stade, vous pouvez également centrifuger à 100.000 xg pendant 1 h à 4 ° C, le surnageant sauvegardé à l&#39;étape 2.6. Le culot sera la fraction ER et le surnageant de la fraction cytosolique. 4. Extraction de glycosphingolipide enrichis en microdomaines GEM <ol><li> Lyse pures fractions mitochondries et / ou MAM dans 500 pi-1 ml de tampon d&#39;extraction pendant 20 min sur la glace. </li><li> Centrifuger lysats à 15.300 xg pendant 2 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir des surnageants (Triton X-100 matières solubles) et re-centrifuger pelletspendant 2 min pour enlever les matières solubles. (Triton X-100 extrait Mitochondries et / ou Triton X-100 MMA propres extraits). </li><li> Solubiliser granulés à solubiliser tampon. Ce matériau solubilisé représente les fractions GEM et peut être utilisé pour une analyse ultérieure. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
<li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+%28SOCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li>
<li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum%3A+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li>
<li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca%282%2B%29-dependent+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li>
<li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot%3A+The+mitochondria-associated+membrane+%28MAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li>
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<li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li>
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<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
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<li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+interface%3A+the+social+network+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
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</ol>

Aucun des auteurs n&#39;a de conflit d&#39;intérêt à déclarer.

Les sites de contact entre les membranes intracellulaires ou organites entre la membrane plasmique des cellules plates-formes représentent dynamiques de signalisation pour les processus cellulaires de base. La caractérisation précise de leur fonction et la composition dans les deux conditions physiologiques et pathologiques nécessite des protocoles de purification fiables et reproductibles. Les méthodes décrites ici ont été spécifiquement optimisés par notre laboratoire pour l&#39;isolement et la purification des MMA et...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIFS </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fractionnement </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium, hexahydrate </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de calcium dihydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Fraction V, choc thermique, lyophilisat </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Base de tris </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Commun </td></tr><tr><td> Comprimés inhibiteurs de la protéase, Complete EDTA-libres </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> 2 ml Meuleuses Douce tissus tout en verre </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polypropylène Tubes à centrifuger coniques, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml à fond rond Tubes à centrifuger en verre </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml à fond rond en verre CentriTubes Fuge </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes d&#39;ultracentrifugation, Ultra-Clear, à paroi mince, 14x89 mm </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Disposable Pipettes Pasteur en verre borosilicate, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

les mitochondries associées à membranes er (smma) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (gem): isolement à partir de cerveau de souris

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Organites intracellulaires sont des structures très dynamiques avec plus ou moins de forme et de composition, qui sont soumis à des cellules spécifiques indices intrinsèques et extrinsèques. Leurs membranes sont souvent juxtaposées à des sites de contact définies, qui deviennent des plaques tournantes pour l&#39;échange de molécules de signalisation et des composants membranaires 1,2,3,4. Les microdomaines membranaires inter-organites qui sont formées entre le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries lors de l&#39;ouverture de l&#39;IP3 Ca 2 sensible à canal + sont connus comme les mitochondries associé-ER membranes ou SMMA 4,5,6. La composition en protéines / lipides et les propriétés biochimiques de ces sites de contact membranaire ont été étudiés en particulier par rapport à leur rôle dans la régulation intracellulaire de Ca 2 + 4,5,6. L&#39;ER sert le magasin principal de la concentration intracellulaire de Ca 2 +, et à ce titre régit une multitude de processus cellulaires en aval de Ca 2 + signalisation, y comprisuding pliage post-traductionnelle de protéine et protéine maturation7. Mitochondries, d&#39;autre part, maintenir l&#39;homéostasie du Ca 2 +, par mise en mémoire tampon Ca 2 + concentration en empêchant ainsi l&#39;ouverture de voies de l&#39;apoptose en aval du Ca 2 + 4,8 balourd. La nature dynamique des MMA rend sites idéaux pour disséquer les mécanismes de base cellulaires, y compris le Ca 2 + signalisation et la réglementation des mitochondriale de Ca 2 + de survie biosynthèse des lipides concentration, et le transport, le métabolisme énergétique cellulaire et 4,9,10,11,12. Plusieurs protocoles ont été décrits pour la purification de ces microdomaines de tissus du foie et des cellules cultivées 13,14. Les méthodes de prise en compte précédemment publiées, nous avons adapté un protocole pour l&#39;isolement des mitochondries et des MMA propres du cerveau de souris adulte. Pour cette procédure, nous avons ajouté une étape de purification supplémentaire, à savoir une extraction Triton X100, qui enables de l&#39;isolement du glycosphingolipide enrichi microdomaine (GEM) fraction des MMA. Ces préparations GEM partager des composants de plusieurs protéines avec des radeaux lipidiques et cavéoles, dérivées de la membrane plasmique ou d&#39;autres membranes intracellulaires, et sont proposés à fonctionner comme des lieux de rencontre pour le regroupement des protéines réceptrices et des interactions protéine-protéine 4,15.

Basé sur notre expérience avec l&#39;utilisation de ce protocole, nous pouvons en toute sécurité le recommande pour l&#39;isolement et la purification de la SMMA, les pierres précieuses et les fractions mitochondriales de cerveau de souris. La procédure décrite est hautement reproductible et cohérente. Dans la figure 1, nous montrons une image représentative de la façon dont la couche mitochondries et MMA propres pure sur un gradient Percoll (étape 3.4). Une définie, bande laiteuse contenant des mitocho...

Cette procédure illustre comment isoler du cerveau de souris adulte les membranes des mitochondries associées à l&#39;urgence ou la SMMA et les glycosphingolipides-fractions enrichies en microdomaines de MMA propres et préparations mitochondriales.

Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les mitochondries, la membrane du réticulum endoplasmique, les microdomaines ou les MAM (mitochondria-associated membranes) à partir du cerveau de souris. Les MAM purifiées sont ensuite extraites afin d'obtenir les fractions de microdomaines enrichies en lipides glyco-finger ou « gems ». Cette isolation est réalisée en premier lieu par la dissection du cerveau de souris, qui est ensuite homogénéisé dans un tampon spécifique à l’aide d’un homogénéisateur Dounce. L’homogénat obtenu est centrifugé à basse vitesse afin d’éliminer les noyaux, les cellules intactes et les débris cellulaires.La deuxième étape consiste à préparer une fraction mitochondriale brute. Par une centrifugation supplémentaire du surnageant, le culot obtenu est mis en suspension et séparé davantage à l'aide d'un gradient discontinu de saccharose. Ensuite, la fraction mitochondriale brute est appliquée sur un gradient Percoll.Après une centrifugation et plusieurs étapes de lavage, on obtient la fraction mitochondriale purifiée et les MAM. La dernière étape consiste à traiter les MAM avec une solution contenant du TRITON X-100 afin d'extraire la fraction microdomania

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Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Un protocole a été mis au point pour la préparation de mitochondries purifiées à partir de cellules microgliales, l’isolement de protéines mitochondriales pour la libération de N-glycanes et la détection rapide de glycanes mitochondriaux subcellulaires à l’aide d’une désorption laser assistée par une matrice infrarouge couplée à une spectrométrie de masse précise à haute résolution.

Préparation mitochondriale à partir de microglie pour l’analyse des glycanes

Découvrez l'isolation des mitochondries associées aux membranes ER (SMMA) et des microdomaines enrichis en glycosphingolipides (GEM) à partir de cerveau de souris adulte. Cette méthode optimise la recherche en neurobiologie cellulaire.

Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal

Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris

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