Rapid tests colorimétriques de vue qualitatif Distinguer l'ARN et de l'ADN dans les échantillons biomoléculaires

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer si un échantillon potentiellement hétérogène de biomolécules contient des acides nucléiques et/ou des sucres réducteurs. Et si c’est le cas, faites la distinction entre l’ARN et l’ADN en fonction de la réactivité différente de leurs fractions sucrées. Ceci est réalisé en appliquant d’abord le test de Bénédicte pour déterminer si le mélange biomoléculaire contient des sucres réducteurs libres.

Dans un deuxième temps, on utilise des limes, des arsen ou des dosages, qui permettent d’établir si les composants du sucre contiennent ou non des anneaux de pento. Le réactif de diphénylamine est utilisé pour déterminer si le sucre pento est un désoxyribose comme dans l’ADN ou non comme dans l’ARN. Les résultats montrent le type de biopolymère basé sur des produits de couleur facilement distingués formés par les réactivités différentielles des composants à base de sucre dans l’échantillon, qui peuvent être analysés par rapport à des courbes standard à l’aide de mesures spectrophotométriques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’électrophorèse à l’aide de colorants fluorescents, le vert pico ou le cyber-or, est qu’il n’y a pas de limitation basée sur la taille, la charge ou le composant du sucre, et qu’elle est efficace en termes de temps et de coût pour tester la réduction des sucres. Préparez un volume approprié de six réactifs de Benedict composés de 940 millimolaires anhydres, de carbonate de sodium 588 millimolaires, de citrate de sodium dihydraté et de 68 millimolaires de cuivre. Deux sulfates penta hydratés.

Pour chaque échantillon à analyser, ajoutez 100 microlitres du réactif six x Benedict dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ajoutez entre 10 et 500 microlitres d’échantillon dans chaque tube et ajoutez de l’eau distillée deux fois pour porter le volume final à 600 microlitres vortex ou pipette. Pour mélanger la solution.

Incuber les échantillons dans un bain-marie bouillant pendant 20 minutes, puis laissez-les refroidir pendant 10 minutes avant de les centrifusionner à environ 10 000 tr/min pendant cinq minutes. Pour sédimenter toute matière particulaire, transférez le supinate dans un récipient propre après avoir effacé le spectrophotomètre UV avec de l’eau à 475 nanomètres.

Mesurez l’absorbance de l’échantillon pour détecter les sucres pento. Préparez un réactif frais à deux x BAL avec du chlorure d’hydrogène de 24,2 millimolaires, six molaires de chlorure d’hydrogène et 0,025 poids par volume de chlorure ferrique hexahydraté conformément au protocole de texte. Pour chaque échantillon, ajoutez 500 microlitres de réactif biliaire dans un microtube à centrifuger.

Ajoutez entre 10 et 500 microlitres d’échantillon dans chaque tube et ajoutez de l’eau distillée deux fois pour porter le volume final à un millilitre. Un mélange. Faites bouillir les échantillons pendant 20 minutes, puis refroidissez-les à température ambiante pendant 10 minutes après avoir fait tourner l’échantillon pour sédimenter la matière particulaire, mesurez l’absorbance à 660 nanomètres en utilisant de l’eau comme blanc.

Préparez deux plats de réactif de diphénylamine composé de 60 millimolaires de diphénylamine, de sept molaires d’acide acétique glacial, de 179 millimolaires d’acide sulfureux et de 62 % de volume par volume. Éthanol. Pour chaque réaction, combinez 500 microlitres de réactif, l’échantillon et de l’eau distillée deux fois pour porter le volume total à un millilitre. Après avoir fait bouillir les échantillons pendant 20 minutes, refroidi à température ambiante et essoré, mesurez l’absorbance à 600 nanomètres.

On voit ici ses données qualitatives représentatives pour l’arsenal et les plats de Benedicts Biles, les dosages de diphénylamine pour les composés de référence connus. Les panneaux de gauche montrent les contrôles positifs et négatifs, et les panneaux de droite affichent la plage de détection visible des tests. Ce panneau illustre la robustesse des tests en montrant la réaction de la boîte avec des échantillons d’hétérogénéité variable.

Par exemple, l’ADN avec de l’ARN ou de l’ADN avec des protéines. Notez que les résultats positifs du test de la parabole sont conservés pour les échantillons contenant de l’ADN même en présence d’ARN ou de protéines contaminants. Les plages de dilution dans les échantillons précédents varient car chaque réaction a une limite de détection visuelle distincte.

Selon le type de sucre analysé, des spectres photométriques plutôt que visuels peuvent être utilisés pour améliorer les plages de mesure, comme le montre cette courbe standard. Pour le test Benedict, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 30 minutes si elle est correctement exécutée.