Introduction à la membrane solide étayée par électrophysiologie

L’électrophysiologie membranaire a donc été abrégée en électrophysiologie basée sur SSM. Il s’agit d’une nouvelle approche électrophysiologique. Il offre pour un certain nombre d’applications une amélioration significative par rapport aux méthodes conventionnelles.

L’outil principal de l’électrophysiologie conventionnelle est l’électrode de microparticules remplie d’électrolyte, tandis que son électrophysiologie à base de M détecte la translocation de charge via une électrode à membrane solide. Il est extrêmement utile dans les cas où l’électrophysiologie conventionnelle ne peut pas être utilisée, comme dans le cas des transporteurs bactériens, qui, à quelques rares exceptions près, ne peuvent pas être étudiés par des méthodes de pince de tension ou de caméra de brassage. Dans de tels cas, l’électrophysiologie basée sur le SSM s’est avérée très efficace.

Il peut également être utilisé pour étudier les transporteurs eucaryotes physiologiquement pertinents dans les membranes intracellulaires. Il existe de nombreuses façons de réaliser des expériences d’électrophysiologie basées sur le SSM. Dans la recherche fondamentale, il peut être appliqué pour déterminer les paramètres cinétiques et clarifier le mécanisme de transport, mais sa robustesse et son potentiel d’automatisation le rendent idéal pour les applications de criblage dans la découverte de pistes.

L’électrode SSM porte un système de membrane composé composé du SSM sous-jacent et de l’adoption de protéasomes ou de fragments de membrane contenant votre protéine de transport d’intérêt. Les propriétés électriques de la membrane composée peuvent être décrites par un circuit équivalent dans lequel les membranes forment un système à couplage capacitif. Notez que le comportement électrique du système est essentiellement le même, que des fragments de membrane ou des liposomes de protéa soient utilisés.

Le déplacement de charge dans la protéine de transport est transmis au circuit de mesure via la capacité de la membrane de la vessie. Un principe de détection appelé couplage capacitif. Dans une expérience typique, l’échange rapide de solution au VSSM fournit le substrat pour la protéine de transport V. L’activité de transport électrogénique de la protéine génère un courant, qui est couplé au système de mesure via la capacité SSM.

Dans le même temps, l’activité de la protéine électrogène charge progressivement la membrane liposomale, conduisant à une inhibition de la protéine de transport et à la diminution du courant dans le circuit d’enregistrement, le courant mesuré est le résultat de réactions de transport simultanées de millions de liposomes de protéa absorbés à l’Enzo. Chacun contenant environ 100 transporteurs. La configuration se compose d’une cage de Faraday avec une voie de solution, de circuits externes pour le contrôle des vannes, l’amplification du signal, ainsi que l’acquisition et l’analyse des données.

La cage EC comprend des récipients, des vannes et des tubes nécessaires au contrôle du débit de la solution, ainsi qu’une coudée avec une puce XOR. La puce XOR porte l’électrode SSM et les liposomes de protection absorbés. Le vete est connecté à l’amplificateur et au générateur de fonction du circuit électrique externe.

Les mesures SSM, provoquent un feu, deux solutions, l’une activatrice et l’autre non activante en dehors du substrat, qui n’est présent que dans la solution d’activation. Les deux solutions ont la même composition dans la configuration d’un seul échange. Deux vannes à deux voies contrôlent le débit des solutions non réactives et des solutions d’activation.

La vanne terminale, une vanne à trois voies couplée mécaniquement, est utilisée pour basculer entre les solutions non activatrices et activatrices, en dirigeant l’une des solutions vers le conteneur à déchets et l’autre solution vers le qve. Lorsque la vanne terminale est commutée, le flux de la solution non activante est réacheminé vers les déchets et la solution d’activation s’écoule vers le qve. Cette configuration permet un flux continu simultané des deux solutions.

À tout moment pendant le protocole de flux, le chemin d’écoulement peut être optimisé en fonction des besoins. Cependant, il faut garder à l’esprit que la distance entre le MSS et la jonction des solutions non activatrices et activatrices doit être aussi courte que possible. Puisqu’il détermine la solution de minuterie de l’échange de solution.

L’amplificateur de courant à l’extérieur de la cage de la platine d’alimentation est connecté à une puce de capteur. En règle générale, il est réglé sur une amplification de 10 à la puissance huit à 10, à la puissance neuf volts par ampère et un temps de repos de un à 10 millisecondes. Un générateur de fonctions est connecté à l’électrode de référence et un ordinateur avec un logiciel de contrôle de vanne et d’acquisition de données ainsi qu’un boîtier d’interface complètent le système.

Le boîtier d’interface contient l’acquisition des données des pilotes de vanne et le flux de la solution matérielle de sortie numérique est maintenu par de l’air sous pression de oh 0,22. La pression d’une barre est surveillée à l’aide d’un millimètre numérique. Il peut être entretenu en remplissant un récipient en acier installé entre l’alimentation en air et les récipients de solution dans la cage EC via une vanne à pointepoint.

Le CVIC se compose de quatre parties. La puce zen est prise en sandwich entre la base du vétérinaire et la tête du vétérinaire. Un connecteur de sortie cylindrique est vissé sur la tête du vétérinaire et porte l’ensemble d’électrodes de référence.

L’électrode de référence est constituée d’un fil d’argent chloré avec un connecteur SMC miniature et est isolée de la voie d’écoulement par un pont de sel de gel de polyacry. Lorsqu’il n’est pas utilisé, l’ensemble de pont de gel est stocké dans une solution de phosphate de potassium de 100 millimolaires de pH sept contenant 100 millimolaires de chlorure de potassium. Tout d’abord, l’électrode de référence doit être montée dans l’ensemble d’électrode de référence contenant le pont géo.

Il est important d’éviter les bulles d’air lors de l’installation de l’électrode de référence. Maintenant, cette partie du vete est fixée au connecteur de sortie, qui a été pré-rempli de solution tampon. Toutes les connexions doivent être scellées avec des joints toriques.

Ce SM est formé sur une puce zor, une lampe en verre structurée recouverte de chèvre. Cette route sémantique mesure un millimètre et un diamètre et est reliée à la plaque de contact par une bande de contact blanche de 0,2 millimètre. Une goupille de contact à ressort crée un contact avec l’amplificateur.

La puce zen est stockée dans l’obscurité dans une solution d’éthanol thiol 10 LAR Okta Deccan. Pour conserver sa couche arcanique afin d’éliminer les molécules virales d’Okta deccan, qui n’ont pas été absorbées, l’électrode est rincée à l’éthanol pur et l’électrode séchée dans de l’azote gazeux. Maintenant, la monocouche de phosphocholine peut être assemblée.

La solution lipidique contient 15 milligrammes par millilitre de choline DFI et 250 microgrammes par millilitre. Okta deux Une mine en décomposition et est stockée à moins 20 degrés. L’électrode est maintenant placée avec précision sur la base de la coudée SA.

Un microlitre de la solution est ajouté à l’électrode SSM sans toucher la couche d’or. Immédiatement après l’ajout de la solution lipidique, le vete peut être assemblé. Le volume vete scellé par un joint torique est cylindrique avec un volume interne de 17 microlitres lorsqu’il est monté.

Le SSM doit être centré sous l’alésage d’entrée. Avant de connecter le vétérinaire, le système de fluide doit être pré-rempli d’une solution tampon de phosphate de potassium de 100 millimolaires. Il est important de s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les tubes et les vannes.

Maintenant, le vétérinaire peut être monté dans la cage diurne thyroïdienne, connecter l’amplificateur, l’entrée et la sortie de la voie d’écoulement de la solution et le générateur de fonctions. Enfin, la coudée peut être rincée avec un tampon de phosphate de potassium de 100 millimètres. Cela conduit à la formation spontanée d’un MSU pour vérifier la qualité du MSU.

La capacité et la conductance sont mesurées à l’aide du générateur de fonctions pour mesurer la conductance 100 millivolts DC voltage est utilisée. La décroissance du courant indique la charge du condensateur à membrane une fois que le condensateur est complètement chargé. Le courant mesuré donne la conductance membranaire selon la loi M’S.

Ici, nous observons une conductance de oh 0,17 nano Siemens. La capacité peut être mesurée à l’aide d’une tension alternative triangulaire de 50 millivolts d’amplitude crête à crête et d’une fréquence de oh 0,5 hertz. L’amplitude du courant d’onde carrée résultant représente le courant de jugement du condensateur.

La capacité est égale à la charge transférée divisée par la tension imposée. Cette membrane présente une capacité de 2,3 nano, une conductance élevée et une faible capacité indique que le SSM n’est pas correctement formé. Dans ces cas, la membrane doit être jetée et un autre SSM préparé à l’aide d’une nouvelle puce d’électrode.

Habituellement, les liposomes prot sont conservés congelés à moins 80. La sonication de l’échantillon sur glace est essentielle car un échantillon agrégé absorbe la poulie vers le SSM pour obtenir une suspension homogène de liposomes protégés. Trois cycles de sonication de dix secondes sont alternés avec des intervalles de refroidissement de dix secondes sur glace.

Rincez leur SSM avec une solution non activante. Dévissez ensuite le connecteur de sortie avec l’échantillon d’électrode de référence. À l’aide d’une pipette, injectez 30 microlitres de l’échantillon de protéines par la sortie du vete dans le volume de l’ette.

Montez d’abord la pointe de la pipette sur l’alésage de sortie. Ouvrez ensuite le manuel ci-dessus dans la voie non activatrice et injectez les liposomes de protéa. Avant de rétrograder la pointe de la pipette.

Fermez le manuel ci-dessus pour éviter tout écoulement ultérieur de la solution. Laissez les liposomes de protéa être absorbés par le SSM pendant un temps d’incubation d’une à deux heures. Utilisez la fenêtre du protocole de débit du logiciel de contrôle de vanne et d’acquisition de données pour définir votre protocole de débit.

Si vous souhaitez effectuer des mesures dans des conditions symétriques, par exemple pour déterminer la spécificité du substrat, la valeur KM ou la dépendance au pH, choisissez le protocole d’échange de solution unique. Réglez la durée d’écoulement de chaque solution sur oh 0,5 à une seconde. Le courant est enregistré tout au long du protocole d’écoulement.

L’amplification est généralement réglée sur 10 à la puissance neuf, et pour la fréquence d’échantillonnage, nous choisissons 2000 points de données par seconde. Enfin, enregistrez votre nouveau protocole sous l’intitulé NA a et a. Dans le deuxième clic de la fenêtre du protocole de flux, vous pouvez définir l’état ouvert ou fermé de vannes spécifiques pour contrôler le débit de la solution non activante ou activante via le qubit.

Ici, nous démontrons la mesure des liposomes de protéa, l’importation de proton de sucre comme Y à partir d’E coli. La solution activatrice contient le substrat transporté du lactose, tandis que la solution non activatrice contient la même quantité de glucose non transporté qu’un composé compensatoire. En plus des sucres, les solutions contiennent 100 millimolaires de phosphate de potassium à pH 7,6 et un millimolaire de DTT.

Après avoir changé les solutions, utilisez la vanne manuelle pour vous assurer que les bulles d’air sont éliminées. Avant de commencer un protocole de débit, ajustez la pression juste avant de commencer la mesure. Nous utilisons régulièrement la pression de Ø 0,6 bar, ce qui, dans notre configuration spécifique de vannes et de tubes, donne un débit d’environ un millilitre par seconde.

Sélectionnez ensuite un protocole de flux sécurisé ici, le protocole NAA, et appuyez sur le bouton de démarrage pour démarrer chaque mesure. Au cours des premières mesures faiblement absorbées, les liposomes de protéa sont éliminés et le courant de crête peut donc diminuer. Répétez la mesure jusqu’à ce que le courant de crête reste constant.

Au cours de la première phase de l’écoulement de la solution non activante, le courant est nul. L’échange d’une solution non activante à une solution activatrice, qui contient du lactose, induit l’activité de transport électrogénique de la membrane. La charge positive protéique s’accumule à l’intérieur des liposomes protes et l’amplificateur détecte un courant transitoire positif dû au couplage positif via le SSM.

Ce courant positif couplé positivement est appelé échange sur le signal V de la solution d’activation. Le retour à la solution non activatrice induit le transport du code du sucre proton hors des liposomes. Dans ce cas, un courant couplé LY négatif est affiché le signal dit off pour l’analyse cinétique des protéines.

Seul le signal activé est utilisé, car le signal d’arrêt est mal défini en raison de l’état de charge de la commutation de la vanne à membrane qui crée des artefacts mécaniques et électriques. Heureusement, ceux-ci sont limités à une plage de temps avant que les signaux induits par les protéines ne soient observés. Notez que le délai de 50 millisecondes entre les artefacts de commutation de vanne et les signaux de transporteur est le temps dont la solution a besoin pour se propager de la vanne terminale à la surface de l’échange rapide de solution SSM, comme celui effectué sur le SSM représente une expérience de relaxation typique.

Dans de telles expériences, le courant se détend à travers une phase pré-stationnaire dépendante du temps jusqu’à un état stationnaire constant. Les détails cinétiques du cycle de réaction peuvent être déduits de la forme et de l’amplitude du courant à l’état stationnaire. Alors que le courant à l’état stationnaire fournit des informations sur le renouvellement continu des protéines membranaires.

Dans le système couplé où les liposomes de protéa sont absorbés à leur SSM, les courants à l’état préstationnaire sont pratiquement inaltérés. Bien qu’un courant constant à l’état stationnaire ne soit jamais obtenu, en raison de la charge des liposomes, le courant mesuré diminue progressivement. Le courant du transporteur peut être calculé à partir du courant couplé mesuré au moyen de l’analyse du circuit.

Ici, nous démontrons des résultats représentatifs en utilisant le co-transporteur de protons de sucre, comme Y dans la gamme PA entre 8,5 et 7,6. Le courant du transporteur est dominé par une réaction électrogène à la fin du cycle de réaction. Dans ces conditions, la face pré-stationnaire consiste en une simple élévation du courant jusqu’à sa valeur d’état stationnaire.

Celui-ci se dégrade ensuite en raison du couplage capacitif. Nous nous intéressons au courant de transport à l’état stationnaire. En l’absence d’un potentiel membranaire, celui-ci est représenté à une bonne approximation par le courant de crête.

La cinétique d’Ali Mein peut donc être analysée en épongeant les courants de crête pour différentes concentrations de substrat, mais considérez que les amplitudes de courant de crête ne peuvent être comparées rigoureusement que si elles sont obtenues à partir d’un seul capteur dans une seule expérience. L’une des raisons est la variabilité de l’efficacité d’absorption. Lorsque le pH est encore réduit, le signal monophasique devient biphasique.

Et enfin, un transitoire rapide reste pour le mutant Y à retard de transport. Le transitoire rapide est suivi d’une petite composante négative plus lente. La composante négative est caractéristique des courants transitoires rapides mesurés dans les systèmes à couplage linéaire et est causée par la décharge de capacité membranaire.

Ici, le courant de crête ne représente pas le transport à l’état stationnaire, mais plutôt une confirmation électrogénique de la transition au début du cycle ionique, ce qui devient apparent parce que un mutant y ne montre aucun transport à l’état stationnaire, et pour un décalage de type sauvage, le transport à l’état stable y est inhibé par un pH faible. Les preuves expérimentales fournissent une interprétation mécaniste de la translocation de charge dans le cycle réactionnel du décalage y, qui est illustrée dans le modèle cinétique. Le transitoire rapide observé pour le mutant déficient en transport, ou dans le cas d’un décalage de type sauvage Y dans des conditions acides, est dû à une réaction électrogénique hebdomadaire rapide après liaison du lactose à des valeurs de pH plus élevées, le signal est dominé par la réaction électrogénique principale à la fin du cycle de réaction, qui a été proposée pour représenter la libération de protons pseudoplasmiques dans le système à couplage capacitif.

Cela conduit à des courants transitoires représentant le transport à l’état stationnaire de Lag y en raison de la forte interaction des Utes. Avec le SSM, des artefacts électriques sont générés lorsque des solutions de composition différente sont échangées. Assurez-vous que les solutions non activantes et activatrices sont aussi similaires que possible, en particulier en ce qui concerne leur pH et leurs forces ioniques.

Un contrôle doit être effectué car les substrats peuvent également produire des artefacts. Testez toujours votre système de tampon spécifique et votre protocole de flux pour détecter les artefacts à l’aide du SSM nu avant d’ajouter l’échantillon de protéine. Après l’ajout de l’échantillon de protéines, les mesures de contrôle peuvent être effectuées avec des solutions contenant des non-substrats, qui sont structurellement similaires au substrat.

De plus, il est possible de tester le substrat pour des artefacts à l’aide de liposomes ou de fragments de membrane sans la protéine d’intérêt. Vous pouvez également ajouter des inhibiteurs à vos solutions ou les pipeter. Après l’expérience directement à la sortie du vétérinaire pour mesurer l’inhibition du signal du transporteur, les signaux spécifiques à la protéine disparaîtront alors, ne laissant que des artefacts d’échange de solution.

Le signal protéique peut alors être facilement corrigé. Assurez-vous que la perte de prot absorbé, les liposomes ou la dégradation des protéines n’affectent pas votre mesure. En effectuant des mesures de contrôle répétées dans des conditions identiques, une réduction du signal allant jusqu’à 20 % est acceptable et peut être corrigée en supposant une dépendance temporelle linéaire de la descente au sol.

Cette configuration est le résultat de 20 ans de développement technique dans notre laboratoire. De plus, il existe des systèmes spécialisés avec une solution de temporisation plus élevée pour l’analyse cinétique et une consommation de solution plus faible pour les substrats coûteux. Pour le dépistage de drogues, nous utilisons des configurations entièrement automatiques avec un débit plus élevé.

À ce jour, plus de 20 transporteurs ont été caractérisés à l’aide de cette méthode. Il s’agit notamment des APA de transport, des complexes de chaînes respiratoires, des transporteurs de froid, des échangeurs et même des canaux de fer. Ainsi, lorsque vous ne parvenez pas à résoudre votre problème par l’électrophysiologie standard, envisagez d’utiliser l’électrophysiologie SS Mase à la place.