Name: Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca 2 + Transitoires et courants membranaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez l'isolation des myocytes auriculaires humains pour mesurer simultanément les transitoires calciques et les courants membranaires. Cette méthode combine digestion enzymatique, marquage fluorescent et patch clamp pour étudier la physiologie cardiaque.

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En outre, nous remercions les chirurgiens cardiaques de l&#39;Université de Heidelberg pour la fourniture de tissu auriculaire humain et Claudia Liebetrau, Katrin Kupser et Ramona Nagel pour leur excellent soutien technique. Un merci spécial aussi à Andy W. Trafford pour ses suggestions et ses conseils lors de la mise en place des mesures transitoires 2 + Ca utiles. Les auteurs tiennent à exprimer leur profonde gratitude aux membres du Département de pharmacologie et de toxicologie (tête: Ursula Ravens) de l&#39;Université de technologie de Dresde pour l&#39;occasion ils nous ont offert d&#39;apprendre les techniques de base et des compétences en électrophysiologie cellulaire et l&#39;isolement des cardiomyocytes. Les recherches des auteurs est soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (Do769/1-1-3), le ministère fédéral allemand de l&#39;éducation et de la recherche à travers le réseau de compétence de la fibrillation auriculaire (01Gi0204) et le Centre allemand de recherche cardiovasculaire, l&#39;Union européenne par le biais l&#39;EuRéseau péenne pour la recherche translationnelle sur la fibrillation auriculaire (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, le projet d&#39;intégration à grande échelle, la proposition n ° 261057) et la fibrillation auriculaire Research Alliance Europe-Amérique du Nord (ENAFRA) subvention de la Fondation Leducq (07CVD03). La vue d&#39;ensemble schématique montré dans le fichier vidéo a été produite utilisant l&#39;art médical Servier.

Les protocoles expérimentaux doivent être approuvés par le comité d&#39;éthique local et tous les patients ont besoin de donner un consentement éclairé écrit. Notre recherche a été approuvé par le comité d&#39;éthique de la Faculté de médecine de Mannheim, Université de Heidelberg (# 2011-216N-MA) et a été réalisée en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé. 0. L&#39;obtention de tissu auriculaire humain Pendant les procédures de cathétérisme routine chez les patients subissant une chirurgie à coeur ouvert pour la circulation extracorporelle greffe, la pointe de l&#39;appendice auriculaire droit est habituellement retiré et peut être utilisé pour l&#39;isolement des cardiomyocytes auriculaires. Après l&#39;excision de l&#39;échantillon de tissu est transféré immédiatement dans un tube Falcon de 50 ml avec du Ca 2 + libre stérile solution de transport contenant la 2,3-butanedione monoxime (tableau I; BDM, inhibiteur contractile, ce qui empêche des myocytes contracture). Avec des temps de transport entre 30 et 45 min, nous n&#39;avons pas reconnu un net avantage de refroidissement ou d&#39;oxygénation par rapport à la fois le nombre et la qualité des cardiomyocytes auriculaires isolées. Dans les transports en général au laboratoire doit être aussi rapide que possible. Toutefois, si le temps de transport plus ne peut être évitée, transport à 4 ° C dans une solution oxygénée pourrait être avantageux. 1. Préarrangements <ol><li> Allumez le thermocirculator, qui contrôle la température du récipient à double enveloppe (tableau II). Assurez-vous que la température dans le bécher est égal à 37 ° C. Recouvrir d&#39;un couvercle en verre pour maintenir une température constante à l&#39;intérieur du récipient à travers le processus d&#39;isolement ensemble. </li><li> Peser la collagénase I et protéase XXIV dans trois récipients en verre et stocker à température ambiante. Les enzymes seront dilués juste avant utilisation. </li><li> Magasin 20 ml de Ca 2 + solution libre dans une boîte de Petri à 4 ° C. </li><li>Magasin 250 ml de solution de Ca 2 + libre dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li></ol> 2. Nettoyage du tissu <ol><li> Transférer l&#39;échantillon de tissu avec la solution de transport dans une boîte de Pétri (~ 10 cm de diamètre) et enlever les tissus adipeux grossièrement avec des ciseaux. </li><li> Peser l&#39;échantillon de tissu. Entre 200 et 600 mg sont utilisés pour l&#39;isolement de cellules. Le tissu restant peut être congelé dans l&#39;azote liquide pour une analyse ultérieure biochimique. </li><li> Transférer l&#39;échantillon de tissu dans la boîte de Petri contenant 20 ml de Ca 2 + solution à 4 ° C (voir l&#39;étape 1.3) et hacher l&#39;échantillon de tissu en petits morceaux d&#39;environ 1 mm 3 dans la taille. </li><li> Les étapes suivantes doivent être exécutées à 37 ° C et sous gazage continu avec 100% d&#39;O 2. Un embout de pipette peut être placé sur le tube d&#39;oxygène pour éviter la formation de bulles et de forte générer un flux d&#39;air continu. </li><li> Transférer les morceaux de tissu avec la solution sans Ca + 2 endans le bécher enveloppe et mélangez soigneusement pendant environ 3 min avec un agitateur magnétique. </li><li> Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s&#39;installer pendant quelques secondes. Filtrer soigneusement le surnageant à l&#39;aide d&#39;un filet de nylon (200 um, tableau II). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher aide d&#39;une pince. </li><li> Remplir le bécher avec Ca 2 + solution libre et répéter l&#39;étape de lavage 2.4 et 2.5 deux fois. </li></ol> 3. Première digestion enzymatique <ol><li> Re-suspendre les morceaux de tissus avec 20 ml Enzyme solution E1 (tableau I) contenant de la collagénase et la protéase et mélangez soigneusement pendant 10 min. </li><li> Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +. </li><li> Après filtrer le surnageant 35 min soigneusement à travers un tamis en nylon (200 um, Tableau II) de façon que la majeure partie des morceaux de tissu restent dans le bécher. Retour reposplu morceaux de tissus provenant de la maille dans le bécher. </li></ol> 4. Deuxième digestion enzymatique <ol><li> Reprendre les morceaux de tissus de nouveau avec 20 ml enzyme E2 solution contenant de la collagénase I seulement (tableau I). Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution immédiatement pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +. </li><li> Au cours de la deuxième utilisation des ciseaux de digestion de couper davantage caillots de tissus parfois. </li><li> Après 5 minutes, prendre un échantillon à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur pour vérifier la dissociation des cellules. Répétez cette opération tous les 2-3 min jusqu&#39;à ce que la tige en forme de cardiomyocytes striés apparaissent. </li><li> Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s&#39;installer pendant environ 20-30 secondes. </li><li> Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, Tableau II) dans un tube de 50 ml Falcon (Tube A). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher. </li><li> Re-suspendre les morceaux de tissus dans le bécher avec 20 ml Storasolution GE (tableau I) 10 et plus dissocier les cellules par trituration mécanique douce à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique de 20 ml avec distributeur. Essayez d&#39;éviter la formation de bulles depuis bulles sont préjudiciables à la survie et la qualité cellulaire. </li><li> Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, tableau II) dans un ml Tube Falcon 50 (tube B). </li></ol> 5. Préparation finale et d&#39;adaptation de Final concentration de Ca2 + <ol><li> Centrifugeuse deux Falcon tubes A et B (voir l&#39;étape 4.5 et 4.7) à 95 g pendant 10 min. </li><li> Eliminer le surnageant de deux tubes soigneusement par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot. Jeter le surnageant. </li><li> Re-suspendre les boulettes dans une solution de stockage de 1,5 ml (tableau I) chacune (température ambiante). </li><li> Ajoutez deux fois 7,5 pi de solution à 10 mM CaCl2 à chaque Falcon et mélangez soigneusement. Incuber pendant 10 minutes après chaque étape. </li><li>Ajouter 15 ul d&#39;une solution à 10 mM CaCl 2 pour obtenir une finale Ca 2 + concentration de 0,2 mM. </li></ol> 6. Chargement des myocytes avec le Ca 2 + Fluorescent indicateur Fluo-3 AM (Figure 1) <ol><li> Transférer 1,5 ml de suspension cellulaire (tube A et / ou du tube B) dans un microtube de 2 ml (tube Eppendorf). </li><li> Les étapes suivantes doivent être exécutées à l&#39;étude de la sensibilité à la lumière du Ca 2 + indicateur fluorescent Fluo-3. </li><li> Dissoudre 50 mg du dérivé d&#39;ester acétoxyméthylique perméable de la membrane de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tableau III) dans 44 pl de la Pluronic F-127 (tableau III) solution (20% p / v dans du DMSO anhydre) pour obtenir ± 1 mm Fluo-3 heures solution mère, qui peut être conservé à -20 ° C pendant au maximum 1 semaine. </li><li> Ajouter 15 ul du Fluo-3 heures solution stock à la microtube contenant 1,5 ml de suspension cellulaire (voir l&#39;étape 6.1) et agitersoigneusement. </li><li> Incuber la suspension de cellules pendant 10 min dans une boîte optiquement opaque. </li><li> Centrifuger brièvement à environ 6000 rpm. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans une solution de bain de 1,5 ml (Tableau IV). </li><li> Laisser la suspension cellulaire pendant environ 30 min pour désestérification avant le début des expériences. </li></ol> 7. Simultanés patch-clamp et épifluorescence Ca 2 + Mesures Puisque les mesures de patch-clamp sont pas le sujet principal de cette étude, nous renvoyons le lecteur intéressé à d&#39;autres publications fournissant une description plus détaillée de cette technique. 11-14 Par souci d&#39;exhaustivité, nous donnons un bref résumé d&#39;un protocole pour mesurer potentiels d&#39;action ou de courants Ca 2 + de type L, les deux avec 2 enregistrements +-transitoires simultanées ca. Au cours d&#39;expériences myocytes sont perfusées à 37 ° C avec baignoire solutisur (Tableau IV) en utilisant un système de perfusion rapide (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Pour les expériences de potentiel imposé, courants K + sont bloquée par addition de 4-aminopyridine (5 mmol / L) et de BaCl 2 (0,1 mmol / L) à la solution du bain. Microélectrodes de verre borosilicate sont utilisés et auraient dû faire pencher résistances de 2-5 MQ quand il est rempli avec une solution pipette (Tableau V). En plus du Fluo-3 heures Chargement de la myocytes (voir l&#39;étape 6), Fluo-3 est également inclus dans la solution pipette (Tableau V). La fluorescence est excitée à 488 nm et la lumière émise (&lt;520 nm) converti en [Ca 2 +] i en supposant <img alt="Équation 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> où k d = constante de dissociation de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescence;. Fmax = Ca2 +-fluorescence saturée obtenue à la fin de chaque expérience 12 Les deux signaux électriques et épifluorescence Ca 2 + signaux sont enregistrés simultanément. Les potentiels d&#39;action sont stimulés à 0,5 Hz en mode courant-clamp avec 1 ms impulsions de courant de la force de seuil 1.2x. De type L de Ca 2 +-courants sont mesurés en mode voltage-clamp à l&#39;aide d&#39;un potentiel de maintien de -80 mV et une de 100 msec rampe impulsion à -40 mV à inactiver la Na +-courant rapide, suivie d&#39;une 100 msec test d&#39;impulsion de 10 mV à 0,5 Hz.

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</ol>

Worthington Biochemical Corp a soutenu cette publication en couvrant les coûts de production du fichier vidéo. Les bailleurs de fonds n&#39;a eu aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains des appendices auriculaires droit obtenus à partir de patients subissant une chirurgie à cœur ouvert. Pour utiliser ces myocytes pour les mesures de Ca 2 + cytosolique nous avons adapté une méthode décrite précédemment 4-11 en omettant EGTA à partir de la solution de stockage. Déjà en 1970, il a été observé que, bien que les myocytes se dissocient en présence de Ca 2 + au cours de la digestion, ils étaient tous dans contracture et non-viable. 16,17 conséquent, l&#39;isolement cellulaire est réalisée en Ca 2 + sans solution. Cependant, la réintroduction des concentrations physiologiques de Ca 2 + a entraîné rapide influx de Ca2 + et la mort cellulaire. Cela a été décrit comme le 2 + phénomène de paradoxe Ca qui a été initialement observée dans les coeurs perfusés par Zimmerman et Hulsman. 18 Des modifications des milieux d&#39;isolement, y compris la réduction du pH à 7,0, &lt;sup&gt; 19 plus de 20 taurin ou de petites quantités de Ca 2 + (voir l&#39;étape 3.2 et 4.1), 21 ainsi que le stockage des myocytes isolés dans EGTA contenant stockage solution 22 ont été suggérées pour éviter le Ca 2 + paradoxe. 17 Cependant, il est bien connu que Ca 2 + tampon par EGTA réduit l&#39;amplitude de type L Ca 2 + induite par le courant Ca 2 + amplitudes et les résultats dans une décroissance biphasique des transitoires de Ca2 transitoires. 23 Par conséquent, nous avons omis EGTA tout au long du processus d&#39;isolement ensemble afin d&#39;obtenir Ca 2 + transitoires avec des propriétés typiques et se désintègre monophasique. Afin de protéger les cellules du Ca 2 + paradoxe, nous avons augmenté la finale Ca 2 + concentration de la solution de stockage de manière progressive jusqu&#39;à 0,2 mm. Le choix de la collagénase est probablement l&#39;étape la plus critique pour la réussite de l&#39;isolement des myocytes. Coll conventionnelagenases sont des préparations brutes obtenues à partir de Clostridium histolyticum et contiennent collagénase en plus d&#39;un certain nombre d&#39;autres protéases, lipases et polysaccharidases. Sur la base de leurs collagénases générales de composition sont subdivisées en différents types. 24 Worthington collagénase de type I et II ont été utilisés avec succès pour l&#39;isolation des myocytes auriculaires humains. 4-10,15,25-30 Dans notre protocole décrit ici nous recommandons l&#39;utilisation de la collagénase Type I, mais nous avons également pu obtenir des quantités acceptables de cellules viables en utilisant la collagénase de type II. Cependant, même au sein d&#39;un seul type de collagénase il ya une variation de lot à lot significatif sur les activités enzymatiques. Ces variations nécessitent la sélection des lots attention et les essais des différents lots afin d&#39;optimiser la procédure d&#39;isolement. L&#39;outil disponible lots sélection en ligne de Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) peut être utilisé pour trouver des lots disponibles avec une composition qui a été montré pour être adapté à l&#39;isolation des myocytes auriculaires humains. Actuellement, nous utilisons la collagénase de type I avec 250 activité U / mg de collagénase, l&#39;activité 345 U / mg caséinase, activité 2,16 U / mg clostripaïne et 0,48 U / mg activité tryptique (lot # 49H11338). Les cellules obtenues en utilisant la procédure décrite dans ce manuscrit peuvent être utilisés dans les 8 h pour les études de patch-clamp, 2 + mesures transitoires de CA et une combinaison des deux. 15 En outre, ces cellules permettent des mesures de contraction cellulaire en réponse à une stimulation de champ électrique ou la stimulation électrique à l&#39;aide de la pipette de patch-clamp (observations non publiées).

L&#39;étude des propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques cardiaques avec la technique de patch-clamp et l&#39;exploration de Ca 2 + cellulaire anomalies de manutention nécessitent cardiomyocytes isolés. Ils sont généralement obtenus à la suite de l&#39;exposition à in vitro d&#39;échantillons de tissus cardiaques aux enzymes digestives (collagénase, hyaluronidase, peptidase, etc.) Depuis le premier rapport de l&#39;isolement des myocytes cardiaques viables en 1955 2 une grande quantité de protocoles a été développé dans le but de récolter des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires simples de différentes espèces, y compris souris, rat, lapin, chien, cochon Guinée et humain. Dans cette revue, nous nous concentrons sur l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains. En ce qui concerne les procédures d&#39;isolement des myocytes d&#39;autres espèces que nous appelons le &quot;Guide de Worthington Tissue dissociation» fourni par Worthington Biochemical Corp, USA ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 Ici nous fournissons une description étape par étape, d&#39;une technique, qui est une adaptation d&#39;une méthode publiée précédemment, afin de obtenir myocytes auriculaires appropriés non seulement pour les expériences de patch-clamp, mais aussi pour Ca2 + intracellulaire mesures simultanées. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 1 %</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 30</td></tr><tr><td>DL-b-hydroxybutyrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>Acide L-glutamique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 100</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>Collagénase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protéase XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : 7,40</td></tr><tr><td>ajusté avec</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solution de transport&lt;/em&gt; : NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution sans Ca2+&lt;/em&gt; : NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solutions enzymatiques E1 et E2&lt;/em&gt; : NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solution de stockage&lt;/em&gt; : KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">Concentrations en mM sauf indication contraire. BDM, monooxime de 2,3-butanédione. *La protéase XXIV est incluse uniquement dans la solution enzymatique E1.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau I. Solutions.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maille en nylon (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Allemagne</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Bécher à réaction à double enveloppe</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau II. Équipement spécifique.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (conditionnement spécial)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronique F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau III. Substances pour le chargement des myocytes avec Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 0,1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 140</td></tr><tr><td>Probenécide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : 7,35</td></tr><tr><td>ajusté avec</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solution bain&lt;/em&gt; : HCl 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau IV. Solution bain pour le patch-clamp.&lt;/strong&gt; *Le 4-aminopyridine et le BaCl2 sont inclus uniquement pour les expériences en voltage-contrôle.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 0,02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 0,1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Solution de pipette&lt;/em&gt; : 0,1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7,20</td></tr><tr><td>ajusté avec</td><td></td><td></td><td>KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau V. Solution de pipette pour le patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*Les jours d'expérience, la solution de pipette est conservée sur glace jusqu'à utilisation. **Le Fluo-3 est ajouté à partir d'une solution mère à 1 mM les jours d'expérience.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; transitoires et courants membranaires

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

L&#39;étude des propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques cardiaques avec la technique de patch-clamp et l&#39;exploration de l&#39;cardiaque Ca 2 + cellulaire anomalies manipulation nécessite cardiomyocytes isolés. En outre, la possibilité d&#39;enquêter sur les myocytes de patients utilisant ces techniques est une condition indispensable d&#39;élucider les bases moléculaires des maladies cardiaques telles que la fibrillation auriculaire (FA). 1 Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains qui sont adaptés à la fois études de patch-clamp et des mesures simultanées des concentrations de Ca 2 +. Tout d&#39;abord, appendices auriculaires droit obtenus à partir de patients subissant une chirurgie à cœur ouvert sont coupés en petits morceaux de tissus («méthode du morceau&quot;) et lavées dans Ca 2 + sans solution. Puis les morceaux de tissus sont digérés dans la collagénase et la protéase contenant des solutions avec 20 uM Ca 2 +. Par la suite, les myocytes isolés sont harvested par filtration et la centrifugation de la suspension de tissu. Enfin, la concentration en Ca2 + dans la solution de stockage de cellules est ajusté par paliers de 0,2 mM. Nous discuterons brièvement le sens de Ca 2 + et Ca 2 + en mémoire tampon au cours du processus de séparation et aussi fournir des enregistrements représentatifs de potentiels d&#39;action et des courants de la membrane, à la fois simultanée avec Ca 2 + mesures transitoires, réalisée dans ces myocytes isolés.

La figure 2A montre trois exemples représentatifs de droits de myocytes oreillette droite isolés. Pour quantifier le rendement cellulaire nous pipette 10 ul de la suspension cellulaire (étape 5.5) sur une lame de microscope CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Les rendements des cellules moyennes dans la figure 2B indiquent clairement qu&#39;il ya une tendance à la baisse des rendements des cellules en chronique AF (CAF) des échantillons de patients (d&#39;un tube: 16,5 ± 3,1 cellules/10 pi (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 cellules/10 ul (n = 10) SR et de la CAF, respectivement, p &lt;0,05; Tube B: 17,9 ± 3,9 cellules/10 ul (n = 29) vs 5,9 ± 2,0 cellules/10 ul (n = 9) SR et de la CAF, respectivement, p = 0,107). Des exemples représentatifs de mesures d&#39;action potentiels et des enregistrements simultanés de Ca 2 + cytosolique transitoires sont donnés dans la figure 3. Dans environ 90% des cellules étudiées, tIl potentiel d&#39;action déclenché par Ca 2 + provoque des contractions de cellules claires et régulières. Comme indiqué précédemment, le potentiel de membrane au repos, ce qui est un indicateur reconnu pour l&#39;intégrité des cellules, en moyenne de -73.9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocytes / patients) et -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocytes / patients ) en SR et de la CAF, respectivement (p&gt; 0,05). 15 La figure 4 montre des enregistrements simultanés représentatifs de voltage-dépendant de type L Ca 2 + et courants Ca 2 + cytosolique transitoires. Application de la isoprénaline agoniste β-adrénergique non sélectif (1 nM) augmente les amplitudes des deux I Ca, L et cytosolique de Ca 2 + transitoires, suggérant intact β-adrénergique cascade de transduction du signal. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme des myocytes Fluo-3 heures chargement protocole (voir l&#39;étape 6,1-6,5). m / v, masse / volume. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figure 2. A, isolés myocytes auriculaires droits humains après une heure dans une solution de stockage. B, moyenne ± SEM du rendement des cellules comptées dans 10 pi de cellules dans une solution de stockage (voir l&#39;étape 5.5). n désigne le nombre de préparations à l&#39;intérieur de chaque groupe. * P &lt;0,05. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figure 3. Enregistrements représentatifs du potentiel d&#39;action déclenché par Ca 2 + transitoires (CAT) dans un myocyte auriculaire d&#39;un rythme sinusal et une chrONIC patients de fibrillation auriculaire. Top: courant injecté membrane (I M) utilisée pour la stimulation (0,5 Hz). Ci-dessous: l&#39;enregistrement simultané du potentiel de membrane (V M), et le chat déclenchée (en bas). (Retracé avec la permission de Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figure 4. Enregistrements représentatifs de l&#39;(1 M) effet isoprénaline sur L-Type courant Ca 2 + déclenchée par Ca 2 + transitoires (CAT) dans un myocyte auriculaire d&#39;un rythme sinusal et un patient atteint de fibrillation auriculaire chronique. Top: Voltage-clamp protocole (0,5 Hz). Ci-dessous: enregistrement simultané de membrane total net courant (I M), reflétant principalement de type L Ca 2 + Cat actuel (au milieu) et déclenché (en bas). (Retracé avec la permission de Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tableau 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tableau I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tableau 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tableau II. Equipements spécifiques. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tableau 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Le tableau III. Substances pour le chargement des myocytes avec Fluo-trois heures. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tableau 4" fo:content-width = &quot;2.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tableau IV. solution pour bain de patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tableau 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Pipette solution de tableau V. de patch-clamp *.

Nous décrivons l&#39;isolement des myocytes auriculaires humains qui peuvent être utilisés pour intracellulaire de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mesures en combinaison avec des études de patch-clamp électrophysiologie.

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitoires et courants membranaires

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des myocytes atriaux humains adaptés à des mesures simultanées du calcium, des transitoires calciques et des courants membranaires. L'échantillon atrial droit est obtenu à partir de patients subissant une chirurgie cardiaque à cœur ouvert et est rapidement transporté afin de commencer la procédure. La première étape consiste à nettoyer le tissu et à le découper en petits fragments tissulaires.La deuxième étape consiste en une digestion enzymatique double du tissu à l'aide d'enzymes protéolytiques, conduisant à l'isolement de myocytes atriaux. La dernière étape comprend le chargement des myocytes avec un colorant fluorescent sensible au calcium. Enfin, l'utilisation combinée de la microscopie en épifluorescence et de la technique de patch clamp permet d'obtenir des enregistrements simultanés de transitoires calciques et de courants membranaires ou de potentiels d'action.Cette méthode peut aider à comprendre la base moléculaire des anomalies du traitement cellulaire du calcium à l'origine de maladies cardiaques telles que la fibrillation auriculaire. La démonstration de la méthode sera effectuée par Claudia Lira, technicienne principale de notre laboratoire. Le tissu auriculaire humain, obtenu à partir de patients subissant une chirurgie cardiaque ouverte pour pontage coronarien ou remplacement de la valve mitrale, doit être rapidement transporté au laboratoire dans une solution de transport. Une fois au laboratoire, transférez l'échantillon de tissu et la solution dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Ensuite, retirez grossièrement le tissu adipeux à l'aide de ciseaux.Ensuite, agitez l'échantillon de tissu. Conservez entre 200 et 600 milligrammes pour l'isolement cellulaire et congélez le reste dans de l'azote liquide pour une analyse biochimique. Transférez le tissu destiné à l'isolement cellulaire dans une boîte contenant une solution froide sans calcium et hachez le tissu en morceaux d'un millimètre cube afin de le laver.Transférez-le avec la solution sans calcium dans le bécher à double enveloppe. Chauffez à 37 degrés. Fournissez de l'oxygène à partir d'une ligne terminée par une pointe de pipette afin d'éviter une forte formation de bulles.Agiter délicatement le tissu pendant environ trois minutes à l’aide d’un barreau magnétique. Laisser ensuite le tissu se déposer. Filtrer ensuite soigneusement le surnageant à travers une maille en nylon de 200 microns.La majeure partie du tissu doit rester dans le bécher. Remplissez à nouveau le bécher avec une solution sans calcium chauffée à 37 degrés. Puis, à l’aide de pinces, remettez les morceaux de tissu filtrés provenant de la maille dans le bécher et répétez la procédure de lavage deux fois.Commencez cette partie de la procédure en préparant 20 millilitres de solution enzymatique E1 réchauffée à 37 degrés Celsius, contenant de la collagénase et de la protéase. Filtrez soigneusement la solution sans calcium après la dernière étape de lavage et remettez en suspension le tissu lavé dans la solution E1. Replacez le tissu recueilli sur le tamis dans le bécher.Agiter doucement la suspension pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 40 microlitres de chlorure de calcium à 10 millimolaire et poursuivre l'agitation pendant 35 minutes. Ensuite, filtrer soigneusement le surnageant à travers une maille en nylon.La majeure partie du tissu doit rester dans le bécher. Préparez 20 millilitres de solution enzymatique E deux contenant uniquement de la collagénase un, et utilisez-la pour remplir à nouveau le bécher. Remettez le tissu recueilli sur le tamis dans le bécher.Ensuite, ajoutez immédiatement 40 microlitres de solution de chlorure de calcium à 10 millimolaire pendant la deuxième digestion, et utilisez occasionnellement des ciseaux pour hacher les caillots de tissu. Après cinq minutes, prélève un échantillon de la suspension pour vérifier la dissociation des cellules au microscope. Continuez à prélever des échantillons toutes les deux à trois minutes jusqu'à ce que des cardiomyocytes striés en forme de bâtonnets soient clairement visibles.Ensuite, arrêtez l'agitation, en laissant le tissu se déposer. Une fois déposé, filtrez soigneusement le surnageant à travers une maille en nylon et dans un tube plastique de 50 millilitres. Puis, resuspendez le tissu dans 20 millilitres de solution de conservation et remettez les morceaux de tissu filtrés provenant de la maille dans le bécher.Dissocier davantage les cellules par agitation mécanique douce. À l’aide d’une pipette de 20 millilitres, tenter d’éviter la formation de bulles. Ensuite, filtrer soigneusement le surnageant à travers un tamis en nylon après la centrifugation de filtration, puis centrifuger les deux récoltes de surnageant à 90 5G pendant 10 minutes.Pour former un culot cellulaire, éliminer les surnageants par aspiration sans perturber le culot. Ressuspendre chaque culot dans 1,5 millilitre de solution de conservation à température ambiante. Ensuite, ajouter 7,5 microlitres de solution de chlorure de calcium à 10 millimolaire dans chaque tube et attendre 10 minutes.Ensuite, ajoutez 7,5 µL supplémentaires de chlorure de calcium et attendez encore 10 minutes. Après cette attente, ajoutez un troisième volume de 15 µL de chlorure de calcium à 10 millimolaire afin d'obtenir une concentration finale de chlorure de calcium en solution de 0,2 millimolaire. L'objectif de cette isolation est d'obtenir des cellules adaptées aux mesures du calcium intracellulaire.Par conséquent, il est essentiel d'omettre tout tampon calcique tel que l'EGTA de la solution de stockage. Transférez 1,5 millilitre de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de deux millilitres. Les étapes suivantes doivent être réalisées en tenant compte de la sensibilité à la lumière de l'indicateur fluorescent du calcium.Flu O trois. Préparez d'abord une solution mère de flu oh 3 à une concentration de un millimolaire. Cette solution peut être conservée à moins vingt degrés Celsius pendant jusqu'à une semaine.Ensuite, ajoutez 15 microlitres de la solution mère de flu oh 3:00 AM au suspense cellulaire de 1,5 millilitre. Agitez soigneusement le mélange et incubez le suspense pendant 10 minutes à température ambiante dans une boîte opaque. Après l'incubation, centrifugez brièvement le tissu à environ 6 000 tr/min.Ensuite, jetez le surnageant et resuspendez le culot dans 1,5 millilitre de solution bain. Laissez la suspension cellulaire environ 30 minutes pour la déesterification avant de commencer les expériences. Procédez ensuite à des mesures simultanées de patch clamp et de calcium en fluorescence épifluorescente en utilisant le protocole décrit.Les myocytes ont été isolés à partir de tissu atrial et quantifiés sur une lame de microscope dotée d'un compteur de cellules. Les rendements cellulaires moyens indiquent clairement une tendance à des rendements plus faibles dans les échantillons provenant de patients atteints de fibrillation atriale chronique. Les myocytes chargés en Flu oh trois ont été stimulés à 0,5 hertz en configuration de blocage de courant afin d'induire des potentiels d'action ; environ 90 % des cellules étudiées ont présenté des contractions régulières.En réponse à cette stimulation, le passage à la microscopie en fluorescence permet de visualiser la libération de calcium déclenchée par le potentiel d'action à partir du réticulum sarcoplasmique, ce qui initie la contraction cellulaire. Des enregistrements représentatifs provenant de patients en rythme sinusal et en fibrillation auriculaire montrent que les potentiels d'action des patients présentent généralement une forme en pic et en dôme, tandis que la triangulation et l'abréviation du potentiel d'action sont des signes caractéristiques typiques du remodelage auriculaire.Chez les patients atteints de fibrillation auriculaire, les transitoires intracellulaires du calcium enregistrés simultanément ont révélé des niveaux diastoliques de calcium augmentés et une amplitude réduite des transitoires calciques dans les myocytes provenant de patients en fibrillation auriculaire afin d'enregistrer les courants calciques de type L. Les courants potassiques ont été bloqués à l'aide de la 4-aminopyridine et du chlorure de baryum. Les cellules ont été stimulées à 0,5 hertz en configuration de blocage de tension, avec un potentiel de maintien de -80 millivolts, une rampe de 100 millisecondes jusqu'à -40 millivolts et une impulsion test de 100 millisecondes à +10 millivolts.Des enregistrements représentatifs montrent que la fibrillation auriculaire est associée à une diminution du courant calcique de type L. Encore une fois, le niveau diastolique de calcium était augmenté, tandis que l'amplitude de la transitoire calcique était plus faible. En cas de fibrillation auriculaire.L'application de l'agoniste non sélectif des récepteurs bêta-adrénergiques, l'isoprénaline, a augmenté l'amplitude des courants calciques de type L et du transitoire calcique cytosolique. Dans les deux groupes, cela suggère que les cellules possèdent une cascade de transduction du signal bêta-adrénergique intacte. Les résultats montrent que cette méthode permet d'obtenir des myocytes de haute qualité tolérants au calcium, adaptés à des mesures simultanées par patch-clamp et de transitoires calciques.De plus, les myocytes obtenus peuvent être utiles pour les mesures de raccourcissement cellulaire, la coloration immunohistochimique ou la coloration de l'UTT.

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JoVE Journal

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Dysfonctionnement des canaux Kv est associée à des arythmies cardiaques. Afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent à des arythmies telles que nous utilisons un protocole systématique pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires chez des souris knock-out canaux Kv auxiliaires sous-unités. Cardiomyocytes isolés peuvent alors être immédiatement utilisé pour les études électrophysiologiques cellulaires, biochimiques ou immunofluorescence (IF) essais.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

Les connaissances actuelles sur la base cellulaire de maladies cardiaques repose principalement sur des études sur des modèles animaux. Nous décrivons ici et valider une nouvelle méthode pour obtenir des cardiomyocytes viables simples de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. Myocytes ventriculaires humains peuvent être utilisés pour des études électrophysiologiques et le dépistage des drogues.

L&#39;isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

Les méthodes sont mises en évidence pour l'isolement des myocytes nœud sino-auriculaire (SAMS) provenant de souris adulte pour les études électrophysiologiques de patch-clamp ou d'imagerie. Les cellules isolées peuvent être utilisés directement ou peuvent être maintenues en culture pour permettre l'expression de protéines d'intérêt, comme rapporteurs codés génétiquement.

Méthodes pour l&#39;isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes

Ce protocole décrit l’évaluation électrophysiologique des oreillettes murins utilisant un système de cartographie optique à haute résolution temporelle et spatiale, y compris les enregistrements doubles de la tension de la membrane et Ca2 + transitoire sous programmé stimulation au moyen d’une sonde électrode spécialisés.

Évaluation électrophysiologique des oreillettes murins avec cartographie optique à haute résolution

Ici, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des cardiomyocytes auriculaires cellule unique d’un modèle de rat de métabolique associés au syndrome d’une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée. Une régulation manuelle de la pression intraluminale des cavités cardiaques est mis en œuvre pour produire des myocytes fonctionnellement intactes adaptés aux études couplage excitation-contraction.

Isolement des Cardiomyocytes auriculaires d’un modèle de Rat de métaboliques liées Syndrome une insuffisance cardiaque avec Fraction d’éjection préservée

Ce protocole est utilisé pour isoler les cardiomyocytes auriculaires simples du cœur adulte de souris en utilisant une approche de digestion de morceau. Cette approche est utilisée pour isoler les myocytes auriculaires de droite ou de gauche qui peuvent être utilisés pour caractériser l'électrophysiologie du myocyte auriculaire dans les études de patch-clamp.

Isolement des myocytes auriculaires des souris adultes

Présenté est un protocole pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains et animaux des tranches myocardales vibratoires. Des rendements élevés de cellules tolérantes au calcium (jusqu’à 200 cellules/mg) peuvent être obtenus à partir de petites quantités de tissus (&lt;50 mg). Le protocole s’applique au myocarde exposé à l’ischémie froide jusqu’à 36 h.

Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

Les modèles murins permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse. À cette fin, des cardiomyocytes de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp. Ici, une méthode pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires murins via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet des mesures simultanées des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L, est décrite.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Ce protocole décrit les modifications de la méthode de Langendorff, y compris la profondeur de la canulation de l’aorte pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes.

Modifications de la méthode de Langendorff pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes

Découvrez l'isolation des myocytes auriculaires humains pour mesurer simultanément les transitoires calciques et les courants membranaires. Cette méthode combine digestion enzymatique, marquage fluorescent et patch clamp pour étudier la physiologie cardiaque.

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca

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