Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des myocytes atriaux humains adaptés à des mesures simultanées du calcium, des transitoires calciques et des courants membranaires. L'échantillon atrial droit est obtenu à partir de patients subissant une chirurgie cardiaque à cœur ouvert et est rapidement transporté afin de commencer la procédure. La première étape consiste à nettoyer le tissu et à le découper en petits fragments tissulaires.

La deuxième étape consiste en une digestion enzymatique double du tissu à l'aide d'enzymes protéolytiques, conduisant à l'isolement de myocytes atriaux. La dernière étape comprend le chargement des myocytes avec un colorant fluorescent sensible au calcium. Enfin, l'utilisation combinée de la microscopie en épifluorescence et de la technique de patch clamp permet d'obtenir des enregistrements simultanés de transitoires calciques et de courants membranaires ou de potentiels d'action.

Cette méthode peut aider à comprendre la base moléculaire des anomalies du traitement cellulaire du calcium à l'origine de maladies cardiaques telles que la fibrillation auriculaire. La démonstration de la méthode sera effectuée par Claudia Lira, technicienne principale de notre laboratoire. Le tissu auriculaire humain, obtenu à partir de patients subissant une chirurgie cardiaque ouverte pour pontage coronarien ou remplacement de la valve mitrale, doit être rapidement transporté au laboratoire dans une solution de transport. Une fois au laboratoire, transférez l'échantillon de tissu et la solution dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Ensuite, retirez grossièrement le tissu adipeux à l'aide de ciseaux.

Ensuite, agitez l'échantillon de tissu. Conservez entre 200 et 600 milligrammes pour l'isolement cellulaire et congélez le reste dans de l'azote liquide pour une analyse biochimique. Transférez le tissu destiné à l'isolement cellulaire dans une boîte contenant une solution froide sans calcium et hachez le tissu en morceaux d'un millimètre cube afin de le laver.

Transférez-le avec la solution sans calcium dans le bécher à double enveloppe. Chauffez à 37 degrés. Fournissez de l'oxygène à partir d'une ligne terminée par une pointe de pipette afin d'éviter une forte formation de bulles.

Agiter délicatement le tissu pendant environ trois minutes à l’aide d’un barreau magnétique. Laisser ensuite le tissu se déposer. Filtrer ensuite soigneusement le surnageant à travers une maille en nylon de 200 microns.

La majeure partie du tissu doit rester dans le bécher. Remplissez à nouveau le bécher avec une solution sans calcium chauffée à 37 degrés. Puis, à l’aide de pinces, remettez les morceaux de tissu filtrés provenant de la maille dans le bécher et répétez la procédure de lavage deux fois.

Commencez cette partie de la procédure en préparant 20 millilitres de solution enzymatique E1 réchauffée à 37 degrés Celsius, contenant de la collagénase et de la protéase. Filtrez soigneusement la solution sans calcium après la dernière étape de lavage et remettez en suspension le tissu lavé dans la solution E1. Replacez le tissu recueilli sur le tamis dans le bécher.

Agiter doucement la suspension pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 40 microlitres de chlorure de calcium à 10 millimolaire et poursuivre l'agitation pendant 35 minutes. Ensuite, filtrer soigneusement le surnageant à travers une maille en nylon.

La majeure partie du tissu doit rester dans le bécher. Préparez 20 millilitres de solution enzymatique E deux contenant uniquement de la collagénase un, et utilisez-la pour remplir à nouveau le bécher. Remettez le tissu recueilli sur le tamis dans le bécher.

Ensuite, ajoutez immédiatement 40 microlitres de solution de chlorure de calcium à 10 millimolaire pendant la deuxième digestion, et utilisez occasionnellement des ciseaux pour hacher les caillots de tissu. Après cinq minutes, prélève un échantillon de la suspension pour vérifier la dissociation des cellules au microscope. Continuez à prélever des échantillons toutes les deux à trois minutes jusqu'à ce que des cardiomyocytes striés en forme de bâtonnets soient clairement visibles.

Ensuite, arrêtez l'agitation, en laissant le tissu se déposer. Une fois déposé, filtrez soigneusement le surnageant à travers une maille en nylon et dans un tube plastique de 50 millilitres. Puis, resuspendez le tissu dans 20 millilitres de solution de conservation et remettez les morceaux de tissu filtrés provenant de la maille dans le bécher.

Dissocier davantage les cellules par agitation mécanique douce. À l’aide d’une pipette de 20 millilitres, tenter d’éviter la formation de bulles. Ensuite, filtrer soigneusement le surnageant à travers un tamis en nylon après la centrifugation de filtration, puis centrifuger les deux récoltes de surnageant à 90 5G pendant 10 minutes.

Pour former un culot cellulaire, éliminer les surnageants par aspiration sans perturber le culot. Ressuspendre chaque culot dans 1,5 millilitre de solution de conservation à température ambiante. Ensuite, ajouter 7,5 microlitres de solution de chlorure de calcium à 10 millimolaire dans chaque tube et attendre 10 minutes.

Ensuite, ajoutez 7,5 µL supplémentaires de chlorure de calcium et attendez encore 10 minutes. Après cette attente, ajoutez un troisième volume de 15 µL de chlorure de calcium à 10 millimolaire afin d'obtenir une concentration finale de chlorure de calcium en solution de 0,2 millimolaire. L'objectif de cette isolation est d'obtenir des cellules adaptées aux mesures du calcium intracellulaire.

Par conséquent, il est essentiel d'omettre tout tampon calcique tel que l'EGTA de la solution de stockage. Transférez 1,5 millilitre de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de deux millilitres. Les étapes suivantes doivent être réalisées en tenant compte de la sensibilité à la lumière de l'indicateur fluorescent du calcium.

Flu O trois. Préparez d'abord une solution mère de flu oh 3 à une concentration de un millimolaire. Cette solution peut être conservée à moins vingt degrés Celsius pendant jusqu'à une semaine.

Ensuite, ajoutez 15 microlitres de la solution mère de flu oh 3:00 AM au suspense cellulaire de 1,5 millilitre. Agitez soigneusement le mélange et incubez le suspense pendant 10 minutes à température ambiante dans une boîte opaque. Après l'incubation, centrifugez brièvement le tissu à environ 6 000 tr/min.

Ensuite, jetez le surnageant et resuspendez le culot dans 1,5 millilitre de solution bain. Laissez la suspension cellulaire environ 30 minutes pour la déesterification avant de commencer les expériences. Procédez ensuite à des mesures simultanées de patch clamp et de calcium en fluorescence épifluorescente en utilisant le protocole décrit.

Les myocytes ont été isolés à partir de tissu atrial et quantifiés sur une lame de microscope dotée d'un compteur de cellules. Les rendements cellulaires moyens indiquent clairement une tendance à des rendements plus faibles dans les échantillons provenant de patients atteints de fibrillation atriale chronique. Les myocytes chargés en Flu oh trois ont été stimulés à 0,5 hertz en configuration de blocage de courant afin d'induire des potentiels d'action ; environ 90 % des cellules étudiées ont présenté des contractions régulières.

En réponse à cette stimulation, le passage à la microscopie en fluorescence permet de visualiser la libération de calcium déclenchée par le potentiel d'action à partir du réticulum sarcoplasmique, ce qui initie la contraction cellulaire. Des enregistrements représentatifs provenant de patients en rythme sinusal et en fibrillation auriculaire montrent que les potentiels d'action des patients présentent généralement une forme en pic et en dôme, tandis que la triangulation et l'abréviation du potentiel d'action sont des signes caractéristiques typiques du remodelage auriculaire.

Chez les patients atteints de fibrillation auriculaire, les transitoires intracellulaires du calcium enregistrés simultanément ont révélé des niveaux diastoliques de calcium augmentés et une amplitude réduite des transitoires calciques dans les myocytes provenant de patients en fibrillation auriculaire afin d'enregistrer les courants calciques de type L. Les courants potassiques ont été bloqués à l'aide de la 4-aminopyridine et du chlorure de baryum. Les cellules ont été stimulées à 0,5 hertz en configuration de blocage de tension, avec un potentiel de maintien de -80 millivolts, une rampe de 100 millisecondes jusqu'à -40 millivolts et une impulsion test de 100 millisecondes à +10 millivolts.

Des enregistrements représentatifs montrent que la fibrillation auriculaire est associée à une diminution du courant calcique de type L. Encore une fois, le niveau diastolique de calcium était augmenté, tandis que l'amplitude de la transitoire calcique était plus faible. En cas de fibrillation auriculaire.

L'application de l'agoniste non sélectif des récepteurs bêta-adrénergiques, l'isoprénaline, a augmenté l'amplitude des courants calciques de type L et du transitoire calcique cytosolique. Dans les deux groupes, cela suggère que les cellules possèdent une cascade de transduction du signal bêta-adrénergique intacte. Les résultats montrent que cette méthode permet d'obtenir des myocytes de haute qualité tolérants au calcium, adaptés à des mesures simultanées par patch-clamp et de transitoires calciques.

De plus, les myocytes obtenus peuvent être utiles pour les mesures de raccourcissement cellulaire, la coloration immunohistochimique ou la coloration de l'UTT.