De cellules vivantes analyse du cycle de

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la phase relative du cycle cellulaire et la taille cellulaire des tissus avec des populations cellulaires génétiquement manipulées et marquées avec GFP ou RFP chez la drosophile. Tout d’abord, mettez en place des croisements génétiques pour générer une descendance contenant des cellules marquées avec les protéines fluorescentes souhaitées et avec les manipulations génétiques souhaitées dans un tissu ou une population spécifique de cellules. À l’étude, isolez proprement le tissu souhaité de la descendance du stade de développement approprié, puis dissociez le tissu en une suspension cellulaire unique et colorez-le avec un colorant d’ADN viable pour mesurer le contenu de l’ADN.

Analysez les échantillons dissociés colorés par cytométrie en flux. En fin de compte, les résultats in vivo mesurent les changements dans la taille des cellules et la phase du cycle cellulaire causés par les manipulations génétiques à l’étude. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante de cytométrie en flux sur des tissus de drosophile vivants à l’aide de colorants ultraviolets est que le colorant violet à cycle de colorant est compatible avec les cytomètres de paillasse moins coûteux contenant un laser violet 4, 0, 5, qui peut être acheté avec un petit budget et maintenu à l’échelle d’un seul laboratoire.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cycle cellulaire en fournissant des informations sur la phase du cycle cellulaire et la taille des cellules qui sont plus détaillées que la simple mesure de la taille globale des tissus et du taux de prolifération. Kagel et Dan Sun, étudiants diplômés de mon laboratoire, et Olga Guko feront la démonstration de la procédure. Notre technicien Recueille les larves matures au troisième stade larvaire environ 110 à 120 heures après la ponte pour les dissections larvaires.

Une mise en scène précise de la pupille est essentielle pour les études lors de la métamorphose pour cette récolte blanche pré pupe au début de la métamorphose si nécessaire, je mesa scellé une boîte de Pétri de pupi ou une fiole de larves dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour activer la chaleur. Base rabattable pour le traçage des clones de lignée. Après avoir desscellé la boîte de Pétri, placez-la dans un incubateur pour le vieillissement jusqu’au stade de développement souhaité pour la dissection pupillaire.

Saisissez doucement une chrysalide par l’extrémité antérieure de la pupille où il y a une bulle d’air pour éviter d’endommager la chrysalide à l’intérieur, positionnez la chrysalide flottante pour une bonne préhension. Ensuite, avec des micro-ciseaux, coupez proprement l’extrémité postérieure de la chrysalide à un léger angle vers la partie dorsale de l’animal pour relâcher la pression interne sans forcer la graisse dans les tissus souhaités dans le thorax et la tête, coupez soigneusement le long de la médiane dorsale, en évitant d’endommager les ailes et le lavage du cerveau de l’œil antérieur pour éliminer sa graisse. Retirez ensuite la pupille de l’étui pupillaire en saisissant le bord postérieur de l’épiderme pupillaire avec une pince et en la tirant hors de l’étui pupillaire.

Transférez la chrysalide disséquée dans un plat de dissection propre. Percez un petit trou dans la cuticule antérieure au complexe cerveau-œil avec des pinces. À l’aide d’une pipette à pasti en verre avec une poire en caoutchouc.

Lavez doucement la solution de dissection PBS à travers la chrysalide partiellement disséquée pour éliminer tout reste de graisse et de tissu intestinal. Pour obtenir les ailes de la pupille, maintenez la chrysalide par la tête avec une pince à l’aide d’une deuxième pince. Saisissez l’extrémité la plus postérieure de la cuticule de l’aile, tirez-la et délogez-la du côté de la carcasse.

Ensuite, coupez ou retirez l’aile au niveau de la charnière pour la retirer du corps et mettez-la en tas à l’écart des carcasses et autres matériaux pour obtenir la pupille, les yeux ou le cerveau. Lavez la chrysalide jusqu’à ce que le complexe cerveau-œil se déloge et se libère de la nymphe. À l’aide d’une pince, retirez doucement l’œil de la pupille du cerveau et conservez le tissu souhaité À l’aide d’une pipette lubrifiée, transférez soigneusement les tissus disséqués.

Incuber les tubes en les secouant à 23 degrés Celsius à 500 tr/min pendant 70 minutes. Ensuite, agitez doucement pendant cinq secondes à vitesse moyenne et remettez les échantillons dans l’agitateur pendant 15 à 20 minutes supplémentaires. Vortex échantillonne à nouveau pendant cinq secondes à vitesse moyenne pour le cerveau et les yeux pupillaires.

Datant de plus de 36 heures. Un PF dissocie les tissus dans une solution de coloration d’ADN à 23 degrés Celsius à 500 tr/min pendant 45 à 60 minutes. Ensuite, un par un, dissociez manuellement de gros morceaux de tissu en les transférant dans une boîte de dissection avec environ 50 microlitres de solution de coloration d’ADN.

Pipetez rapidement de haut en bas à l’aide d’un passage manuel de votre pipette d’une ouverture d’environ 100 à 150 micromètres. Regroupez les échantillons dissociés dans un tube de cinq millilitres. Incuber 30 minutes supplémentaires à 23 degrés Celsius en secouant à 500 tr/min.

Vérifiez visuellement que les échantillons sont complètement dissociés. Conscient que la pupille acellulaire transparente cuticule de l’aile ne s’associera pas. Commencez l’analyse par télécopieur en chargeant l’échantillon sur le cytomètre.

Sélectionnez ensuite les canaux pour détecter la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale indiquant la taille de la cellule et la complexité de la membrane. Pour détecter la coloration violette du cycle D de l’ADN, vous devrez mesurer VL une hauteur, une largeur et une zone d’excitation laser violette. Sélectionnez également le canal laser bleu d’une zone pour mesurer la fluorescence GFP.

Pour l’analyse des appels d’offres, nous utilisons le canal laser bleu trois. Ce canal sur l’harmonisation est optimisé pour la détection RFP. Réglez les vannes afin de restreindre l’analyse à la population sélectionnée et de limiter les débris et les amas de l’analyse qui génère des graphiques d’arrêt avec la première porte, excluez les débris et les amas dans le graphique de SSC par rapport à FSC dans le graphique de VL une zone par rapport à VL un avec utilisez GA deux pour exclure les cellules non colorées sous G un cellules apoptotiques et les amas de cellules sur la base de l’identification des singulets.

GA trois englobe les cellules des portes un et deux qui sont GFP négatives sur le graphique de la fluorescence en fonction du contenu en ADN basé sur VE, L, une hauteur. La marche suivante quatre comprend des cellules dans les portes un et deux qui sont positives à la GFP sur le graphique de la fluorescence en fonction du contenu en ADN. On peut également générer les portes cinq et six à partir de diagrammes à points de la taille des cellules mesurée par la GFP par rapport à la diffusion directe.

Pour examiner la phase du cycle cellulaire, utilisez les deux histogrammes qui tracent le contenu de l’ADN sur l’axe des x et le nombre de cellules sur les ais Y pour les populations définies par la porte trois et la porte quatre. Pour la taille de la cellule, les histogrammes définissent les populations sur les portes cinq et six et tracent le FSC sur l’axe des x et les comptes sur l’axe des y lors de l’exécution des échantillons, ils règlent l’enregistrement pour qu’il s’arrête à 10 000. Les événements positifs de la GFP ont également fixé le volume d’acquisition de 300 microlitres.

Les paramètres de seuil et de tension appropriés sont contenus dans les modèles fournis. Analysez les échantillons à une sensibilité standard ou élevée de 100 microlitres par minute et enregistrez. Les fichiers de données enregistrés générés par le logiciel Attune sont au format FCS, qui est compatible avec la plupart des logiciels de modélisation du cycle cellulaire.

Cet espace de travail représentatif contenant quatre diagrammes à points et deux histogrammes montre un échantillon d’aile de larve exprimant la GFP et la cycline D dans l’aile postérieure, piloté par un transgène Grailed gal four. Le premier graphique à points de la taille de la cellule avec la démarche un exclut les débris et les amas. Le deuxième graphique à points distingue les singlets avec la démarche deux pour exclure les cellules non colorées sous G 1D NA et les amas dans le graphique de GFP en fonction du contenu en ADN.

Les cellules négatives et positives de la GFP peuvent être distinguées et la teneur en deux N et quatre en NDNA est évidente en fonction de la position le long de l’axe des x. Ce graphique de la taille de la cellule mesurée par GFP en fonction de la diffusion directe est utilisé pour générer les portes cinq et six. Les analyses qui en résultent conduisent à des histogrammes du contenu de l’ADN en fonction des comptages pour la population GFP ou RFP négative ainsi que pour les cellules GFP ou RFP positives.

À l’aide du modèle d’appel d’offres fourni. Des résultats similaires sont obtenus avec le même type de tissu et le même profil d’expression. Pour l’appel d’offres, les modèles et les tensions fournis conviennent à l’analyse des yeux, du cerveau et des ailes des larves, ainsi que des yeux pupillaires, du cerveau et des ailes.

Dans le logiciel adapté. L’utilisation de la fonction de mise à l’échelle automatique pour le cycle de cellule ou les histogrammes de taille de cellule permet de déterminer le maximum global pour chaque population. Ces profils de cycle cellulaire représentent des cellules positives et négatives à la GFP dans les yeux des larves exprimant la GFP dans la partie postérieure.

En utilisant les quatre transgènes U-A-S-G-F-P de GMR GAL, la superposition révèle les différences de phasage du cycle cellulaire des cellules postérieures exprimant la GFP. La variation relative de la taille des cellules entre les cellules positives et négatives de la GFP peut également être tracée. Ce profil de cycle cellulaire a été dérivé du cerveau des pupilles à 46 heures A PF. Les cellules positives à la GFP sont des clones traçants de lignée exprimant le régulateur G un S, la cycline D et E deux F, qui perturbent la quiescence et conduisent à l’entrée en phase S.

Cela contraste avec les cellules GFP négatives non exprimées, qui à ce stade sont normalement arrêtées. Dans G one, le logiciel d’harmonisation génère des régions définies par l’utilisateur sur les histogrammes, délimitant G un s et G deux phases. Un tableau de statistiques pour chaque exécution détermine le nombre absolu de cellules dans les régions et les pourcentages définis par l’utilisateur.

Alternativement, un logiciel de modélisation tel que mod fit peut être utilisé pour estimer les pourcentages dans chaque phase ainsi que les cellules apoptotiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de marquer plusieurs tissus de la drosophile pour l’analyse du cycle cellulaire.