Introduction au lecteur de microplaques
Le lecteur de microplaque est un instrument multimodal qui permet de réaliser et de mesurer simultanément une variété d’expérimentations. Les lecteurs…
Le lecteur de microplaque est un instrument largement utilisé qui permet pour beaucoup d’échantillons d’être mesurés simultanément, comme si beaucoup de minuscules expérimentations étaient réalisées au même moment.
Cet appareil est utilisé en conjonction avec des plaques à multipuits, comme la plaque à 96 puits.
Quel que soit le type d’expérimentation exécutée avec le lecteur de microplaque, des courbes standards sont souvent utilisées pour déterminer la valeur des échantillons expérimentaux, aussi bien que les contrôles positif et négatif.
Les lecteurs de microplaque ont des formes, tailles et programmations différentes. Beaucoup de lecteurs de microplaque ont des capacités multimodales permettant de réaliser beaucoup de tests différents. Ces modalités incluent l’abilité à réaliser différents types de mesures, tels que les mesures d’absorption, de fluorescence et de luminescence.
Les plaques multipuits sont des composants constitutifs au lecteur de microplaque et sont utilisés pour contenir les échantillons qui sont mesurés par la machine. Ces plaques peuvent être de tailles différentes, avoir différents types de fonds de puit et différent nombre de puits. Le type de plaque utilisé dépend du test.
Le tiroir de chargement est utilisé pour amener la plaque à 96 puits à l’intérieur de la machine.
Une interface d’ordinateur est typiquement utilisée pour faire fonctionner le lecteur de plaque et contrôler ses positions et paramètres, tels que la longueur d’onde et le mode. Le logiciel du lecteur de plaque a une interface d’utilisateur graphique qui vous permet de sélectionner quels puits de votre plaque contiennent des échantillons.
Des pipettes multicanaux sont souvent utilisées pour charger des plaques multipuits. Les réservoirs contiennent les solutions pour la pipette multicanaux.
Les puits peuvent parfois être chargés en utilisant une pipette standard à simple canal.
Les échantillons et les standards sont chargés soit en double soit en triple pour pallier à n’importe quelle erreur de pipetage. Ici vous voyez une plaque chargée en triple.
La courbe standard utilise des échantillons avec des concentrations connues, ce qui donne différentes valeurs d’absorbance. Ce résultat est alors utilisé pour créer un graphique où une ligne du meilleur ajustement est générée.
Le puit vierge est utilisé pour déterminer l’étendue de votre mesure qui n’est expérimentalement pas pertinente, et est due aux tampons dans lesquels l’échantillon est dilué, ou aux réactifs auxquels l’échantillon est exposé. Les valeurs obtenues sur ces mesures sont appelées le “bruit de fond”. Le puit vierge ne contient aucun échantillon.
Le contrôle positif indique si le test a fonctionné correctement ou non. Il donne un résultat positif. Le contrôle négatif est un contrôle variable où il est attendu de ne pas observer de mesure ou effet. Cela devrait ne pas donner de résultat.
Une fois que la plaque est prête, il est temps de charger les échantillons dans la machine. Pour prévenir la mesure du mauvais échantillon ou le chargement de la plaque dans le mauvais sens, il est primordial d’orienter la plaque correctement dans le tiroir de chargement. Souvenez-vous d’être précautionneux lors du chargement des échantillons dans le tiroir, de manière à ne pas forcer le tiroir vers l’intérieur de l’instrument ou d’attraper les extrémités à l’intérieur de celui-ci.
Une fois que le tiroir est chargé, les paramètres tels que le mode, la longueur d’onde et l’ordre de lecture des puits sont encodés dans le logiciel avant la lecture de la plaque.
Après que les paramètres sont encodés, la plaque est lue, et le lecteur produit un affichage de valeurs dans le logiciel.
Une fois que la plaque est lue, utilisez la valeur moyenne des échantillons vierges pour soustraire le bruit de fond de tous les échantillons incluant ceux de la courbe standard.
Après la lecture, les valeurs de concentration connues pour les standards sont comparées respectivement avec leurs valeurs mesurées, l’absorbance dans ce cas. Lorsque les valeurs ont été comparées, la ligne du meilleur ajustement peut être calculée en utilisant une régression linéaire. Ceci peut être facilement fait en utilisant une feuille de calcul.
Le coefficient de détermination, une mesure statistique de la précision des prédictions des données réelles, devrait être entre 0,90 et 0,99 - 0,99 étant considéré comme la meilleure valeur et indiquant que la ligne est parfaitement ajustée aux données.
En utilisant la ligne du meilleur ajustement, nous pouvons calculer les valeurs de concentration des échantillons expérimentaux ou des contrôles dans chaque puit, en considérant la valeur d’absorbance sur Y et en résolvant alors l’équation sur X. Les valeurs de concentration peuvent aussi être estimées en traçant une ligne depuis la valeur de l’absorbance sur l’axe des Y jusqu’à la meilleure ligne d’ajustement et ensuite descendre jusqu’à l’axe des X.
Beaucoup de types de lecteurs de microplaque mesurent l’absorbance, ce qui est définit comme le rapport logarithmique de la lumière tombant sur un objet à la lumière transmise à travers l’objet.
Le test de Bradford est un exemple de test basé sur un lecteur de microplaque mesurant l’absorbance, où les échantillons de protéines sont ajoutés à la plaque avec le réactif “Bradford”. Ce composé se lie aux protéines dans l’échantillon, et provoque un changement dans son absorbance.
Dans les tests basés sur la fluorescence, un fluorochrome est activé par une certaine longueur d’onde de la lumière, qui va provoquer son excitation. Il va alors émettre de la lumière à une longueur d’onde différente.
Lorsque vous travaillez avec des réactifs sensibles à la lumière, soyez attentifs à les garder couvert pour empêcher un photoblanchiment et ruiner l’expérimentation.
Les tests de luminescence émettent de la lumière via une réaction chimique et utilisent souvent de la luciférase. La luciférase provient de nombreuses sources comme les lucioles. Dans une réaction de luciférase, la lumière est émise lorsque la luciférase rencontre de l’oxygène, de l’ATP, et du magnésium dans une série de réactions.
Les tests de luminescence ont beaucoup d’utilisations différentes. Un exemple d’utilisation est la mesure de la production et la détection d’espèces réactives à l’oxygène dans les cancers.
D’autres applications, qui utilisent les lecteurs de microplaque, incluent des tests à haut débit utilisant des plaques à 384 et 1536 puits. Dans ces tests, les plaques sont chargées par un robot. Non, pas ce genre de robot. Un robot programmable qui automatise le traitement des échantillons, de manière extrêmement précise.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur le lecteur de microplaque. Dans cette vidéo, nous avons montré ce qu’est un lecteur de microplaque, comment il est utilisé, comment faire fonctionner cet instrument, comment interpréter les données d’un lecteur de microplaque, et quelques utilisations utilisant un lecteur de microplaque. Merci de nous avoir regardé.
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Le lecteur de microplaque est un instrument largement utilisé qui permet pour beaucoup d’échantillons d’être mesurés simultanément, comme si beaucoup de minuscules expérimentations étaient réalisées au même moment.
Cet appareil est utilisé en conjonction avec des plaques à multipuits, comme la plaque à 96 puits.
Quel que soit le type d’expérimentation exécutée avec le lecteur de microplaque, des courbes standards sont souvent utilisées pour déterminer la valeur des échantillons expérimentaux, aussi bien que les contrôles positif et négatif.
Les lecteurs de microplaque ont des formes, tailles et programmations différentes. Beaucoup de lecteurs de microplaque ont des capacités multimodales permettant de réaliser beaucoup de tests différents. Ces modalités incluent l’abilité à réaliser différents types de mesures, tels que les mesures d’absorption, de fluorescence et de luminescence.
Les plaques multipuits sont des composants constitutifs au lecteur de microplaque et sont utilisés pour contenir les échantillons qui sont mesurés par la machine. Ces plaques peuvent être de tailles différentes, avoir différents types de fonds de puit et différent nombre de puits. Le type de plaque utilisé dépend du test.
Le tiroir de chargement est utilisé pour amener la plaque à 96 puits à l’intérieur de la machine.
Une interface d’ordinateur est typiquement utilisée pour faire fonctionner le lecteur de plaque et contrôler ses positions et paramètres, tels que la longueur d’onde et le mode. Le logiciel du lecteur de plaque a une interface d’utilisateur graphique qui vous permet de sélectionner quels puits de votre plaque contiennent des échantillons.
Des pipettes multicanaux sont souvent utilisées pour charger des plaques multipuits. Les réservoirs contiennent les solutions pour la pipette multicanaux.
Les puits peuvent parfois être chargés en utilisant une pipette standard à simple canal.
Les échantillons et les standards sont chargés soit en double soit en triple pour pallier à n’importe quelle erreur de pipetage. Ici vous voyez une plaque chargée en triple.
La courbe standard utilise des échantillons avec des concentrations connues, ce qui donne différentes valeurs d’absorbance. Ce résultat est alors utilisé pour créer un graphique où une ligne du meilleur ajustement est générée.
Le puit vierge est utilisé pour déterminer l’étendue de votre mesure qui n’est expérimentalement pas pertinente, et est due aux tampons dans lesquels l’échantillon est dilué, ou aux réactifs auxquels l’échantillon est exposé. Les valeurs obtenues sur ces mesures sont appelées le “bruit de fond”. Le puit vierge ne contient aucun échantillon.
Le contrôle positif indique si le test a fonctionné correctement ou non. Il donne un résultat positif. Le contrôle négatif est un contrôle variable où il est attendu de ne pas observer de mesure ou effet. Cela devrait ne pas donner de résultat.
Une fois que la plaque est prête, il est temps de charger les échantillons dans la machine. Pour prévenir la mesure du mauvais échantillon ou le chargement de la plaque dans le mauvais sens, il est primordial d’orienter la plaque correctement dans le tiroir de chargement. Souvenez-vous d’être précautionneux lors du chargement des échantillons dans le tiroir, de manière à ne pas forcer le tiroir vers l’intérieur de l’instrument ou d’attraper les extrémités à l’intérieur de celui-ci.
Une fois que le tiroir est chargé, les paramètres tels que le mode, la longueur d’onde et l’ordre de lecture des puits sont encodés dans le logiciel avant la lecture de la plaque.
Après que les paramètres sont encodés, la plaque est lue, et le lecteur produit un affichage de valeurs dans le logiciel.
Une fois que la plaque est lue, utilisez la valeur moyenne des échantillons vierges pour soustraire le bruit de fond de tous les échantillons incluant ceux de la courbe standard.
Après la lecture, les valeurs de concentration connues pour les standards sont comparées respectivement avec leurs valeurs mesurées, l’absorbance dans ce cas. Lorsque les valeurs ont été comparées, la ligne du meilleur ajustement peut être calculée en utilisant une régression linéaire. Ceci peut être facilement fait en utilisant une feuille de calcul.
Le coefficient de détermination, une mesure statistique de la précision des prédictions des données réelles, devrait être entre 0,90 et 0,99 - 0,99 étant considéré comme la meilleure valeur et indiquant que la ligne est parfaitement ajustée aux données.
En utilisant la ligne du meilleur ajustement, nous pouvons calculer les valeurs de concentration des échantillons expérimentaux ou des contrôles dans chaque puit, en considérant la valeur d’absorbance sur Y et en résolvant alors l’équation sur X. Les valeurs de concentration peuvent aussi être estimées en traçant une ligne depuis la valeur de l’absorbance sur l’axe des Y jusqu’à la meilleure ligne d’ajustement et ensuite descendre jusqu’à l’axe des X.
Beaucoup de types de lecteurs de microplaque mesurent l’absorbance, ce qui est définit comme le rapport logarithmique de la lumière tombant sur un objet à la lumière transmise à travers l’objet.
Le test de Bradford est un exemple de test basé sur un lecteur de microplaque mesurant l’absorbance, où les échantillons de protéines sont ajoutés à la plaque avec le réactif “Bradford”. Ce composé se lie aux protéines dans l’échantillon, et provoque un changement dans son absorbance.
Dans les tests basés sur la fluorescence, un fluorochrome est activé par une certaine longueur d’onde de la lumière, qui va provoquer son excitation. Il va alors émettre de la lumière à une longueur d’onde différente.
Lorsque vous travaillez avec des réactifs sensibles à la lumière, soyez attentifs à les garder couvert pour empêcher un photoblanchiment et ruiner l’expérimentation.
Les tests de luminescence émettent de la lumière via une réaction chimique et utilisent souvent de la luciférase. La luciférase provient de nombreuses sources comme les lucioles. Dans une réaction de luciférase, la lumière est émise lorsque la luciférase rencontre de l’oxygène, de l’ATP, et du magnésium dans une série de réactions.
Les tests de luminescence ont beaucoup d’utilisations différentes. Un exemple d’utilisation est la mesure de la production et la détection d’espèces réactives à l’oxygène dans les cancers.
D’autres applications, qui utilisent les lecteurs de microplaque, incluent des tests à haut débit utilisant des plaques à 384 et 1536 puits. Dans ces tests, les plaques sont chargées par un robot. Non, pas ce genre de robot. Un robot programmable qui automatise le traitement des échantillons, de manière extrêmement précise.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur le lecteur de microplaque. Dans cette vidéo, nous avons montré ce qu’est un lecteur de microplaque, comment il est utilisé, comment faire fonctionner cet instrument, comment interpréter les données d’un lecteur de microplaque, et quelques utilisations utilisant un lecteur de microplaque. Merci de nous avoir regardé.
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Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.