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Introduction au lecteur de microplaques

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Introduction to the Microplate Reader

1.1: An Introduction to the Centrifuge

1.3: Understanding Concentration and Measuring Volumes

126,210 Views

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07:51 min

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April 30, 2023

Overview

Le lecteur de microplaque est un instrument multimodal qui permet de réaliser et de mesurer simultanément une variété d’expérimentations. Les lecteurs de microplaque peuvent faire des mesures d’absorbance, de fluorescence et de luminescence. Les plaques à multi puits sont intégrées au lecteur de microplaque et permettent d’exécuter plusieurs expérimentations en une fois. En fonction du type de test, les expérimentations dans le lecteur de plaque utilisent une courbe standard pour déterminer les valeurs expérimentales. Cette courbe utilise des échantillons de concentrations connues pour générer une ligne de meilleur ajustement ou courbe standard. Les valeurs expérimentales sont alors extrapolées à la courbe ou sont calculées en utilisant l’équation issue de la régression linéaire. En plus des standards et des échantillons analysés dans la plaque à multi puits, les échantillons vierges ainsi que les contrôles positif et négatif sont aussi utilisés dans le test pour assurer qu’il fonctionne correctement. Les lecteurs de multiplaque sont utilisés pour quantifier des protéines, l’expression du gène et divers procédés métaboliques tels que les espèces réactives à l’oxygène et l’écoulement de calcium.

Procedure

Le lecteur de microplaque est un instrument largement utilisé qui permet pour beaucoup d’échantillons d’être mesurés simultanément, comme si beaucoup de minuscules expérimentations étaient réalisées au même moment.

Cet appareil est utilisé en conjonction avec des plaques à multipuits, comme la plaque à 96 puits.

Quel que soit le type d’expérimentation exécutée avec le lecteur de microplaque, des courbes standards sont souvent utilisées pour déterminer la valeur des échantillons expérimentaux, aussi bien que les contrôles positif et négatif.

Les lecteurs de microplaque ont des formes, tailles et programmations différentes. Beaucoup de lecteurs de microplaque ont des capacités multimodales permettant de réaliser beaucoup de tests différents. Ces modalités incluent l’abilité à réaliser différents types de mesures, tels que les mesures d’absorption, de fluorescence et de luminescence.

Les plaques multipuits sont des composants constitutifs au lecteur de microplaque et sont utilisés pour contenir les échantillons qui sont mesurés par la machine. Ces plaques peuvent être de tailles différentes, avoir différents types de fonds de puit et différent nombre de puits. Le type de plaque utilisé dépend du test.

Le tiroir de chargement est utilisé pour amener la plaque à 96 puits à l’intérieur de la machine.

Une interface d’ordinateur est typiquement utilisée pour faire fonctionner le lecteur de plaque et contrôler ses positions et paramètres, tels que la longueur d’onde et le mode. Le logiciel du lecteur de plaque a une interface d’utilisateur graphique qui vous permet de sélectionner quels puits de votre plaque contiennent des échantillons.

Des pipettes multicanaux sont souvent utilisées pour charger des plaques multipuits. Les réservoirs contiennent les solutions pour la pipette multicanaux.

Les puits peuvent parfois être chargés en utilisant une pipette standard à simple canal.

Les échantillons et les standards sont chargés soit en double soit en triple pour pallier à n’importe quelle erreur de pipetage. Ici vous voyez une plaque chargée en triple.

La courbe standard utilise des échantillons avec des concentrations connues, ce qui donne différentes valeurs d’absorbance. Ce résultat est alors utilisé pour créer un graphique où une ligne du meilleur ajustement est générée.

Le puit vierge est utilisé pour déterminer l’étendue de votre mesure qui n’est expérimentalement pas pertinente, et est due aux tampons dans lesquels l’échantillon est dilué, ou aux réactifs auxquels l’échantillon est exposé. Les valeurs obtenues sur ces mesures sont appelées le “bruit de fond”. Le puit vierge ne contient aucun échantillon.

Le contrôle positif indique si le test a fonctionné correctement ou non. Il donne un résultat positif. Le contrôle négatif est un contrôle variable où il est attendu de ne pas observer de mesure ou effet. Cela devrait ne pas donner de résultat.

Une fois que la plaque est prête, il est temps de charger les échantillons dans la machine. Pour prévenir la mesure du mauvais échantillon ou le chargement de la plaque dans le mauvais sens, il est primordial d’orienter la plaque correctement dans le tiroir de chargement. Souvenez-vous d’être précautionneux lors du chargement des échantillons dans le tiroir, de manière à ne pas forcer le tiroir vers l’intérieur de l’instrument ou d’attraper les extrémités à l’intérieur de celui-ci.

Une fois que le tiroir est chargé, les paramètres tels que le mode, la longueur d’onde et l’ordre de lecture des puits sont encodés dans le logiciel avant la lecture de la plaque.

Après que les paramètres sont encodés, la plaque est lue, et le lecteur produit un affichage de valeurs dans le logiciel.

Une fois que la plaque est lue, utilisez la valeur moyenne des échantillons vierges pour soustraire le bruit de fond de tous les échantillons incluant ceux de la courbe standard.

Après la lecture, les valeurs de concentration connues pour les standards sont comparées respectivement avec leurs valeurs mesurées, l’absorbance dans ce cas. Lorsque les valeurs ont été comparées, la ligne du meilleur ajustement peut être calculée en utilisant une régression linéaire. Ceci peut être facilement fait en utilisant une feuille de calcul.

Le coefficient de détermination, une mesure statistique de la précision des prédictions des données réelles, devrait être entre 0,90 et 0,99 – 0,99 étant considéré comme la meilleure valeur et indiquant que la ligne est parfaitement ajustée aux données.

En utilisant la ligne du meilleur ajustement, nous pouvons calculer les valeurs de concentration des échantillons expérimentaux ou des contrôles dans chaque puit, en considérant la valeur d’absorbance sur Y et en résolvant alors l’équation sur X. Les valeurs de concentration peuvent aussi être estimées en traçant une ligne depuis la valeur de l’absorbance sur l’axe des Y jusqu’à la meilleure ligne d’ajustement et ensuite descendre jusqu’à l’axe des X.

Beaucoup de types de lecteurs de microplaque mesurent l’absorbance, ce qui est définit comme le rapport logarithmique de la lumière tombant sur un objet à la lumière transmise à travers l’objet.

Le test de Bradford est un exemple de test basé sur un lecteur de microplaque mesurant l’absorbance, où les échantillons de protéines sont ajoutés à la plaque avec le réactif “Bradford”. Ce composé se lie aux protéines dans l’échantillon, et provoque un changement dans son absorbance.

Dans les tests basés sur la fluorescence, un fluorochrome est activé par une certaine longueur d’onde de la lumière, qui va provoquer son excitation. Il va alors émettre de la lumière à une longueur d’onde différente.

Lorsque vous travaillez avec des réactifs sensibles à la lumière, soyez attentifs à les garder couvert pour empêcher un photoblanchiment et ruiner l’expérimentation.

Les tests de luminescence émettent de la lumière via une réaction chimique et utilisent souvent de la luciférase. La luciférase provient de nombreuses sources comme les lucioles. Dans une réaction de luciférase, la lumière est émise lorsque la luciférase rencontre de l’oxygène, de l’ATP, et du magnésium dans une série de réactions.

Les tests de luminescence ont beaucoup d’utilisations différentes. Un exemple d’utilisation est la mesure de la production et la détection d’espèces réactives à l’oxygène dans les cancers.

D’autres applications, qui utilisent les lecteurs de microplaque, incluent des tests à haut débit utilisant des plaques à 384 et 1536 puits. Dans ces tests, les plaques sont chargées par un robot. Non, pas ce genre de robot. Un robot programmable qui automatise le traitement des échantillons, de manière extrêmement précise.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur le lecteur de microplaque. Dans cette vidéo, nous avons montré ce qu’est un lecteur de microplaque, comment il est utilisé, comment faire fonctionner cet instrument, comment interpréter les données d’un lecteur de microplaque, et quelques utilisations utilisant un lecteur de microplaque. Merci de nous avoir regardé.

Transcript

The microplate reader is a widely-used instrument that allows for many samples to be simultaneously measured, as if many miniscule experiments were being performed at the same time.

This apparatus is used in conjunction with multiwell plates, like the 96 well plate.

Regardless of the type of experiment run with the microplate reader, standard curves are often used to determine the value of experimental samples, as well as positive and negative controls.

Microplate readers come in different shapes, sizes and set-ups. Many microplate readers have multimodal capabilities allowing for many different assays to be performed. These modalities include the ability to perform different types of measurements, such as absorption, fluorescent, and luminescent measurements.

Multiwell plates are integral components to the microplate reader and are used to hold the samples that are measured by the machine. These plates can be different sizes, have different types of well bottoms and different numbers of wells. The type of plate used depends upon the assay.

The loading tray is used to bring the 96-well plate into the machine.

A computer interface is typically used to operate the plate reader and control its settings and parameters, such as the wavelength and mode. The plate reader software has a graphical user interface of the plate that allows you to select which wells are loaded with samples.

Multichannel pipettes are often used to load multi-well plates. The reservoirs hold the solutions for the multichannel pipette.

Wells can sometimes be loaded using a standard single channel pipette.

Samples and standards are loaded either in duplicate or triplicate to account for any pipetting errors. Here you see a plate loaded in triplicate.

The standard curve uses samples with known concentrations, which yield different absorbance values. This data is then used to create a graph where a line of best fit is generated.

The blank is used to determine the extent of your measurement that is not experimentally relevant and is due to the buffers in which your sample is diluted or reagents to which your sample is exposed. The values obtained from these measurements are called the “background”. The blank does not contain any sample.

The positive control indicates whether or not the assay has worked properly. It gives a good result. The negative control is a control variable where no measurement/effect is expected to be observed. It should not yield any result..

Once the plate is set up, it’s time to load the samples. To prevent measuring the wrong samples or loading the plate the wrong way, it is critical to orient the plate correctly in the loading tray. Remember to exercise caution when loading samples in the tray, so as not to force the tray into the instrument or catch ones extremities inside the instrument.

Once the tray is loaded, parameters such as the mode, wavelength and well loading order are set in the software before the plate is read.

After the parameters are set, the plate is read, and the reader generates a read-out of values within the software.

Once the plate is read, use the average value of the blank samples to subtract the background from all samples including the standard curve.

After reading, the known concentration values for the standards are plotted against their respective measured values, absorbance in this case.

When the values have been plotted, the line of best fit can be calculated using a linear regression. This can be easily done using a spreadsheet program.

The coefficient of determination, a statistical measure of how well the line predicts actual data points, should be between 0.90-0.99, with 0.99 being considered the best value and signifies that the line fits the data perfectly.

Using the line of best fit, we can calculate the concentration values of experimental samples or controls in each well by plugging in the absorbance value for Y and then solving the equation for X. Concentration values can also be estimated by drawing a line from the absorbance value on the Y axis to the best fit line and then down to the X axis.

Many types of microplate readers measure absorbance, which is defined as the logarithmic ratio of light falling upon an object to the light transmitted through an object.

The Bradford assay is an example of an absorbance-based microplate reader assay, where protein samples are added to the plate with the “Bradford” reagent. This compound binds to the proteins in the sample, and cause a shift in its absorbance.

In fluorescent-based assays, a fluorochrome is activated by a certain wavelength of light and in turn causes excitation of the fluorochrome, which emits light at a different wavelength.

When working with light sensitive reagents, be sure to keep them covered to prevent photobleaching and ruining the experiment.

Luminescent assays emit light via a chemical reaction and often use luciferase. Luciferase comes from a number of sources such as fireflies. In a luciferase reaction, light is emitted when luciferase encounters oxygen, ATP, and magnesium in a series of reactions.

Luminescent assays have many different applications. An example of this application is measuring the production and detection of reactive oxygen species in cancers.

Other applications, which use microplate readers, include high-throughput assays using 384- and 1536-wells. In these assays, plates are loaded by a robot. No, not that kind of robot. A programmable robot which automates extremely precise sample handling.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the microplate reader. In this video, we showed what a microlate reader is(A), how it is used(B), how to operate this instrument(C), how to interpret microplate reader data, and some applications using a microplate reader(D). Thank you for watching.