Name: À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Apprenez le profilage métabolomique non ciblé du sérum par UPLC-MS à grande échelle. Cette méthode robuste permet d'extraire, d'analyser et d'identifier des biomarqueurs moléculaires avec contrôle qualité rigoureux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le tutoriel présenté a été réalisé et développé au sein de l’installation de protéomique et de métabolomique de l’Université d’État du Colorado, qui est partiellement financée par les ressources d’administration de la recherche CSU pour les projets universitaires.

1. Exemple d’organisation
<ol>
	<li>Pour créer une carte de plaque pour la préparation d’échantillons sur une feuille de calcul, entrez dans la première colonne une liste d’échantillons par ordre de chargement. Dans une deuxième colonne, entrez les 96 emplacements des plaques de puits en utilisant la nomenclature correcte pour votre logiciel d’échantillonneur automatique.</li>
	<li>Conservez un puits dans chaque plaque pour les échantillons de contrôle qualité.</li>
	<li>Si votre passeur d’échantillons LC peut traiter deux plaques à la fois, séparez la liste d’échantillons en lots de 190 et enregistrez ces informations dans une deuxième feuille de travail.</li>
	<li>Dans chacun de ces lots, utilisez la fonction randomize [note : « =rand()"dans Excel] pour randomiser l’ordre d’injection. Copiez et collez maintenant votre ordre d’injection dans le système logiciel de file d’attente d’échantillons LC-MS. La randomisation doit se produire entre les lots, à l’intérieur des lots, et être unique entre les répétitions d’injection.</li>
</ol>
2. Procédures de préparation des échantillons de sérum et de contrôle de la qualité (CQ)
<ol>
	<li>Préparez un stock de 10 ml d’échantillon de CQ contenant au moins quatre composés de masse et de temps de rétention connus qui couvrent l’élution chromatographique de l’expérience. (Remarque : caféine, réserpine, sulfadiméthoxine et terfénadine à une concentration de 2 μg/ml chacune).</li>
	<li>Décongelez les échantillons de sérum sur de la glace et agitez doucement pendant ~5 secondes.</li>
	<li>Pré-mouillez les pointes d’une pipette à 12 canaux avec du méthanol pour éviter l’égouttement des pointes lors de la distribution de l’échantillon. Ajoutez ensuite 370 μl de méthanol froid dans chaque puits d’une plaque à 96 puits.</li>
	<li>Transférez 100 μl de chaque échantillon à l’emplacement de plaque correspondant à partir des cartes de plaques. Couvrir les plaques et laisser incuber à -80 °C pendant 30 min pour précipiter les protéines.</li>
	<li>Faites tourner les plaques dans une centrifugeuse à 4 °C à 3 200 x g pendant 30 min. Transférez 250 μl de surnageant dans un nouveau surnageant à 96 puits et répétez la centrifugation.</li>
	<li>Transférez maintenant 60 μl d’aliquotes du surnageant sur trois plaques de 96 puits adaptées à l’échantillonneur automatique UPLC ou LC.</li>
	<li>Ajouter 100 μl de mélange d’échantillon de CQ à la position de puits réservée sur la plaque.</li>
	<li>Scellez chaque plaque avec un film adhésif. Le solvant peut s’évaporer rapidement après le perçage du puits, et les injections ne doivent donc être effectuées qu’une seule fois à partir de chaque plaque. Les plaques dans la file d’attente d’échantillons peuvent être stockées à court terme à -20 °C.</li>
</ol>
3. Acquisition de données UPLC-MS
<ol>
	<li>Réglez l’échantillonneur automatique à 4 °C et placez les deux premières plaques dans l’échantillonneur automatique.</li>
	<li>Configurez la méthode d’acquisition à l’aide de l’un des deux gradients de phase inverse alternatifs. Le gradient A est biaisé en faveur des molécules non polaires tandis que le gradient B fournira une meilleure couverture des molécules modérément polaires.
	<ol>
		<li>Pente A : 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Temps (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>courbe</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td>
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3,0</td>
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Dégradé B 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Temps (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>courbe</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Réglez le spectromètre de masse pour collecter des données en mode positif à partir de 50-1 200 m/z. Des conditions spécifiques supplémentaires à l’instrument varieront en fonction du système utilisé. Ce qui suit représente les conditions d’utilisation sur notre spectromètre de masse Waters Xevo G2 Q-TOF : Énergie de collision = 6V ; Temps de balayage = 0,2 s par balayage ; Tension capillaire = 2 200 V ; Température de la source = 150 °C Température de désolvatation = 350 °C Débit de gaz de désolvatation (N2) = 800 L/h).</li>
	<li>Injectez les échantillons de contrôle qualité cinq fois au début de chaque lot de 2 plaques d’échantillons. Après avoir conditionné le système UPLC-MS avec les deux premières injections, surveillez la surface du pic (<25 % RSD), le temps de rétention (+/- 0,05 min) et la précision de masse (+/- 3 ppm) de la troisième à la cinquième injection. Il peut être nécessaire d’ajuster ces paramètres pour s’adapter aux spécifications de l’instrument utilisé pour l’acquisition de données.</li>
	<li>Si les échantillons de CQ réussissent, acquérez des données sur les échantillons de sérum pour ces deux plaques. En cas d’échec des échantillons de contrôle qualité, les données d’échantillon ne sont pas collectées tant que le problème n’est pas résolu et que les échantillons de contrôle qualité ne réussissent pas. Dans notre laboratoire, nous avons constaté que ces paramètres sont constamment stables sur trois jours d’injections (c’est-à-dire l’injection de 2 plaques de 96 puits). Si votre système s’avère instable pendant cette période, des injections de contrôle qualité plus fréquentes peuvent être appropriées. L’échantillon de CQ n’est pas utilisé pour corriger des données de mauvaise qualité, mais pour empêcher la collecte de données de mauvaise qualité.</li>
</ol>
4. Détection, intégration, alignement et normalisation des pics
Il existe une variété d’options pour effectuer ces étapes, y compris des logiciels gratuits et des outils spécifiques au fournisseur. Cette étape a été sautée dans le tutoriel vidéo, mais notre approche est décrite ci-dessous à titre d’exemple.
Pour chaque échantillon, les données analytiques générées par ce type d’expérience sont un profil d’ions décrit par un temps de rétention, une valeur m/z et une intensité spectrale. Une expérience de profilage de métabolites non ciblée sera composée de nombreux échantillons et, par conséquent, la détection des pics, l’alignement du temps de rétention et la normalisation doivent être effectués pour permettre une analyse statistique ultérieure de l’ensemble de données.
<ol>
	<li>Exportez les données brutes au format .cdf à l’aide du logiciel Waters DataBridge. Effectuez la détection des pics et l’alignement du temps de rétention à l’aide du progiciel XCMS 10 (logiciel gratuit disponible à l'<a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/ » target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) et est exécuté dans l’environnement statistique R11). Le site Web contient de la documentation sur la façon de télécharger et d’exécuter le logiciel.</li>
	<li>Utilisez la méthode du « filtre adapté » dans XCMS avec les paramètres suivants : pleine largeur à mi-hauteur = 8 sec, rapport S/B = 3, maximum de 100 pics pour chaque chromatogramme ionique extrait. Effectuez les étapes de regroupement de fonctionnalités, de correction du temps de rétention, de regroupement et de fillPeaks. Le résultat du logiciel XCMS est une matrice de données avec toutes les caractéristiques détectables répertoriées sous forme de lignes, chaque échantillon expérimental sous forme de colonne, et les cellules sont remplies avec la surface du pic de chaque caractéristique dans chaque échantillon. La transposition de cet ensemble de données peut être nécessaire pour l’intégration dans les flux de travail statistiques en aval.</li>
	<li>Normalisez la matrice de données dans R en divisant l’aire de pic de chaque caractéristique d’un échantillon donné par la somme de l’aire de pic ionique extrait (appelée courant ionique total, ou TIC pour cet échantillon (multipliée par 100 000 pour rendre les nombres plus propices à l’interprétation visuelle des données).</li>
	<li>Éliminez les valeurs aberrantes. Les valeurs aberrantes dans les données peuvent résulter soit d’une mauvaise injection d’un bon échantillon, soit d’une bonne injection d’un mauvais échantillon.
	<ol>
		<li>Effectuez la détection des valeurs aberrantes dans R à l’aide du package de valeurs aberrantes avec les paramètres suivants : (1) valeurs TIC et (2) scores PC avec un niveau de confiance de 99,9 %.</li>
		<li>Si des valeurs aberrantes sont présentes, les fichiers de données correspondants sont supprimés et les procédures de détection des pics, d’alignement et de normalisation sont à nouveau exécutées.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faites la moyenne des aires de pics normalisées par identificateur d’échantillon (pour faire la moyenne des injections multiples). Cela doit être fait avant d’effectuer une analyse statistique (notez que les répétitions d’injection tiennent compte de la variation analytique, mais ne peuvent pas être utilisées comme de véritables réplicats biologiques).</li>
</ol>
5. Analyse statistique
Pour les expériences métabolomiques, des techniques statistiques multivariées et univariées sont nécessaires pour l’interprétation des données. Deux techniques couramment utilisées sont l’analyse en composantes principales et l’analyse de variance (ANOVA). Il existe de multiples façons d’aborder l’analyse statistique des données, et des outils logiciels open source et commerciaux sont disponibles. Cette étape a été sautée dans le tutoriel vidéo, mais notre approche est décrite ci-dessous à titre d’exemple.
<ol>
	<li>Effectuez une ANOVA en appliquant une fonction aov à l’ensemble de données dans R.</li>
	<li>Tenez compte des faux positifs à l’aide d’un ajustement de Benjamini-Hochberg (fonction p.adjust dans R).</li>
	<li>Réalisez l’ACP avec l’ensemble de données à l’échelle de Pareto (la variance unitaire peut également être appliquée) et centré sur la moyenne. Les scores PC et les chargements sont calculés à l’aide du package pcaMethods dans R.</li>
	<li>Utilisez les valeurs p de l’ANOVA, les scores de charge et les paramètres de changement de pli pour déterminer les caractéristiques moléculaires qui décrivent le mieux la variation associée au traitement expérimental.</li>
	<li>Interrogez manuellement chaque caractéristique moléculaire d’intérêt pour déterminer si elle correspond à un ion moléculaire, à un adduit (par exemple, sodium, potassium ou dimère) ou à une perte neutre.</li>
</ol>
6. Identification des métabolites
Le flux de travail présenté ici est très général et peut être appliqué aux résultats de n’importe quelle plate-forme d’instrument. Une stratégie alternative est présentée dans la section Discussion.
<ol>
	<li>Pour toutes les caractéristiques statistiquement significatives (telles que déterminées à partir de l’analyse à l’étape 6), examinez les données brutes et confirmez que les ions parents, les adduits sodiques, les isotopes et les fragments suivent des tendances similaires dans l’ensemble de données. Par exemple, la valeur p dérivée de l’ANOVA pour un ion parent doit être similaire à son isotope. Cela indique que les deux caractéristiques moléculaires correspondent au même métabolite.</li>
	<li>Recherchez des mesures de masse précises et/ou des pertes neutres de caractéristiques moléculaires statistiquement significatives (choisissez l’isotope C12 si plusieurs isotopes sont significatifs) dans des bases de données internes (si disponibles) ou accessibles au public, telles que :
	<ol class="lroman">
		<li>Base de données sur le métabolome humain (<a href="http://www.hmdb.ca/ » target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php » target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Banque de masse (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en » target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Cartes lipidiques (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html » target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>National Institute of Standards and Technology MS Search (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ » target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utilisez un logiciel pour prédire une formule moléculaire à partir de la distribution précise de la masse et des isotopies de vos caractéristiques moléculaires significatives. Dans le logiciel Waters, cela s’effectue à l’aide de l’outil Elemental Comp dans le package MassLynx.</li>
	<li>Filtrez l’identification des métabolites candidats en fonction de l’erreur de masse (adaptée à votre plate-forme d’instrument), de la formule moléculaire prédite, de la pertinence biologique dans les tendances observées par rapport à la conception expérimentale et du temps de rétention (par exemple, les lipides et autres composés non polaires auront des temps de rétention plus longs lors de l’utilisation de la chromatographie en phase inverse).</li>
	<li>Effectuer des expériences ultérieures pour acquérir la fragmentation MS/MS pour des caractéristiques moléculaires statistiquement significatives. Dans la mesure du possible, l’identification des métabolites devrait être basée sur l’appariement des pics de fragmentation expérimentaux et du temps de rétention à ceux d’un étalon authentique acquis sur le même instrument. Alternativement, la fragmentation expérimentale peut être appariée à une base de données spectrale.</li>
	<li>Le niveau de confiance dans l’identification devrait être attribué à toutes les identifications de métabolites signalées sur la base des recommandations12. de l’initiative des normes métabolomiques.
	Niveau 1 : identification moléculaire fiable basée sur des paramètres analytiques orthogonaux (masse précise, temps de rétention et fragmentation MS/MS) par rapport à un composé authentique. 
	Le niveau 2 fait référence à une identification présumée basée sur des propriétés physicochimiques et/ou une similitude spectrale avec la littérature ou les bibliothèques spectrales. 
	Le niveau 3 fait référence à l’identification présumée d’une classe de composés sur la base de propriétés physicochimiques ou de similitude spectrale. 
	Le niveau 4 fait référence à un composé inconnu.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce tutoriel est destiné à servir de point de départ pour la réalisation d’un profilage de métabolites non ciblé à grande échelle par UPLC-MS. Le flux de travail se concentre sur les métabolites qui peuvent être extraits avec un solvant aqueux de méthanol, retenus sur une colonne UPLC C8 ou C18 et détectés sous forme d’ions positifs. Dans le cas où il n’y a pas de biais prédéterminé en faveur d’une classe de métabolites spécifique et qu’une hypothèse générant un profil global est souhaitée, ce protocole est précieux car i...

Le terme « métabolomique » peut englober beaucoup de choses. Par exemple, une expérience métabolomique peut être réalisée à l’aide de diverses plateformes analytiques telles que la RMN et la chromatographie en phase gazeuse et/ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. De plus, les expériences métabolomiques peuvent être réalisées de manière ciblée ou non ciblée, ou une combinaison des deux. Une expérience métabolomique ciblée impliquera l’analyse dirigée d’un panel de molécules importantes pour la question biologique à l’étude (par exemple, de petites molécules impliquées dans le cycle du TCA permettront une quantification précise de cette voie). Dans cette situation, l’hypothèse biologique dicte le choix des métabolites à cibler dans l’analyse et les étapes analytiques sont optimisées pour la détection de ces molécules. Alternativement, une expérience métabolomique non ciblée génère des hypothèses. Dans ce cas, l’expérience est réalisée de manière large et impartiale pour permettre la détection d’autant de métabolites que possible. Les résultats d’une expérience non ciblée orienteront l’étape suivante de la recherche (qui, dans de nombreux cas, peut impliquer un flux de travail métabolomique ciblé). Il est également possible de combiner les deux approches, auquel cas une expérience est réalisée de manière non ciblée pendant qu’un panel de molécules connues est suivi dans les données. 
Le tutoriel présenté ici se concentre spécifiquement sur le profilage non ciblé des métabolites du sérum. Comme décrit ci-dessus, l’approche non ciblée fournit une vue impartiale des métabolites détectables, peut générer de grandes quantités d’information et, en fin de compte, permettre de nouvelles découvertes. L’utilisation de cette approche, qui utilise spécifiquement la chromatographie liquide à ultra performance couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS), se généralise 1, 2, 3 et implique les étapes suivantes : (1) conception expérimentale (2) prélèvement d’échantillons (3) préparation de l’échantillon (4) acquisition de données par UPLC-MS (5) prétraitement des données (détection de pics, intégration, alignement et normalisation) (6) analyse statistique de données (uni- et multivariées) (7) identification de métabolites et (8) biologique interprétation. 
Actuellement, il n’existe pas de méthodes standard établies pour le profilage des métabolites non ciblés basé sur UPLC-MS et les étapes ultérieures de prétraitement des données. Ce manque de normalisation est dû en partie à l’un des principaux défis analytiques du profilage des métabolites ; la diversité chimique du métabolome. En raison de cette diversité, il est impossible pour une seule méthode d’extraction ou d’acquisition par spectrométrie de masse de fournir une couverture complète de tous les métabolites en une seule analyse. En théorie, la couverture des métabolites peut être maximisée en utilisant plusieurs extractions (par exemple, aqueuse, méthanol, chloroforme :méthanol, etc.) couplées à diverses conditions chromatographiques (par exemple, phase inverse, HILIC, etc.) et à divers modes d’ionisation (par exemple, ion positif, ion négatif, ionisation chimique, etc.). Souvent, cependant, les chercheurs n’ont pas de biais prédéterminé pour une classe chimique spécifique et les dépenses liées à la réalisation de plusieurs extractions et acquisitions d’instruments ne sont donc pas justifiées, en particulier pour les expériences à grande échelle. Ainsi, le tutoriel vidéo présenté ici a été conçu pour fournir une procédure générale pour le profilage non ciblé des métabolites sériques à grande échelle par UPLC-MS. Il permettra aux laboratoires nouveaux et établis d’effectuer ces types d’expériences et les éléments de base sur lesquels ils peuvent étendre l’approche à divers types d’échantillons, à des classes chimiques spécifiques ou à des analyses ciblées. Plus précisément, ce protocole comprendra les étapes suivantes : préparation des échantillons de sérum, organisation des échantillons pour les études à grande échelle, acquisition de données UPLC-MS, procédures de contrôle de la qualité (CQ) et identification des métabolites. Des stratégies de prétraitement des données et d’analyse statistique sont également présentées.
Le protocole ne se concentrera pas sur les étapes de conception expérimentale, de collecte d’échantillons ou d’interprétation des données biologiques, car il est en dehors du cadre de ce tutoriel. Cependant, de nombreuses ressources existent dans la littérature sur ces sujets et les auteurs encouragent les chercheurs novices en métabolomique à les explorer en profondeur 4, 5, 6, 7, 8, 9. En particulier, la conception expérimentale est extrêmement importante et essentielle au succès d’une expérience métabolomique non ciblée. Des facteurs tels que la réplication biologique appropriée et l’uniformité de la procédure de prélèvement des échantillons (p. ex. temps passé sur la paillasse, température d’entreposage, temps d’entreposage, congélation-décongélation, etc.) doivent être pris en compte pour assurer la viabilité de l’étude et faciliter l’interprétation biologique appropriée des données.

<table><tbody><tr><td>96 plaques de puits - 500 &mu ; l puits VWR</td><td></td><td>40002-020</td><td>Ceux-ci sont utilisés pour la préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>96 tapis de plaques</td><td>de puits VWR</td><td>89026-514 Ceux-ci</td><td>sont utilisés pour la préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>96 plaques de puits - 350 &mu ; l puits Waters</td><td>Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons</td></tr><tr><td>96 tapis de plaques de puits</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons</td></tr><tr><td>96 scellages thermiques de plaques de puits</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Ceux-ci peuvent être utilisés pour l’injection d’échantillons ou le stockage à long terme</td></tr><tr><td>96 scelleuse thermique de plaques de puits </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol de qualité LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr> Acide <tr><td>formique de qualité LC-MS</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette électronique multicanaux</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pointes Pipett</td><td>Eclipse (achetée via Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - contact Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra performance Chromatographie liquide (UPLC) System</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - contact Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 colonne (option de dégradé a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>Colonne UplC T3 (option de gradient b) </td><td>Waters Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF</td><td>Spectromètre de masse Waters Corporation</td><td>N/A - contacter Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. L’approche offre une analyse impartiale et approfondie qui peut permettre le développement de tests de diagnostic, de nouvelles thérapies et d’approfondir notre compréhension des processus pathologiques. La diversité chimique inhérente au métabolome crée d’importants défis analytiques et il n’existe pas d’approche expérimentale unique capable de détecter tous les métabolites. De plus, la variation biologique du métabolisme individuel et la dépendance du métabolisme vis-à-vis des facteurs environnementaux nécessitent un grand nombre d’échantillons pour atteindre la puissance statistique appropriée requise pour une interprétation biologique significative. Pour relever ces défis, ce tutoriel décrit un flux de travail analytique pour le profilage non ciblé des métabolites sériques à grande échelle par UPLC-MS. La procédure comprend des lignes directrices pour l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites et permettra une acquisition fiable de données pour de grandes expériences et fournira un point de départ pour les laboratoires novices en matière de profilage non ciblé des métabolites par UPLC-MS.

Les étapes analytiques de base d'une expérience de profilage métabolomique non ciblé par UPLC-MS sont décrites dans la Figure 1. Les données brutes de chaque échantillon peuvent être visualisées sous forme de chromatogramme de pics de base. La Figure 2 présente un exemple de chromatogramme de pics de base d'un échantillon de sérum analysé selon l'option de gradient (a) du didacticiel. Après l'analyse statistique décrite ci-dessus, une identification des métabolites est tentée pour toutes...

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer un profilage métabolomique non ciblé robuste du sérum dans le cadre d'une expérience à grande échelle. Dans un premier temps, extraire les métabolites sous forme de plaque. Mettre en place un échantillon et une méthode de contrôle qualité robustes afin de garantir la stabilité analytique dans le temps.Ensuite, acquérez des données spectrales de masse sur les échantillons de sérum QC et randomisés par répétition, puis procédez au traitement des données, à l'analyse statistique et à l'identification des métabolites. Les résultats du profilage métabolomique non ciblé par U-P-L-C-M-S peuvent être utilisés pour identifier des biomarqueurs de petites molécules dans le sérum. Le protocole est présenté ici pour l'analyse du sérum.Cependant, il peut facilement être étendu à l'analyse d'autres fluides biologiques, tels que l'urine, les tissus et les extraits de culture cellulaire. Pour créer une carte de plaque pour la préparation des échantillons, ouvrez une feuille de calcul. Dans la première colonne, saisissez la liste des échantillons dans l'ordre de chargement. Dans la deuxième colonne, indiquez les emplacements des puits de la plaque 96 puits en utilisant la nomenclature correcte prévue par votre logiciel d'échantillonneur automatique.Conserver un puits par plaque pour l'échantillon de contrôle qualité. Si votre autosampler en LC peut gérer deux plaques simultanément, diviser la liste d'échantillons en lots de 190 et enregistrer ces informations dans une deuxième feuille de calcul. À l'intérieur de chacun de ces lots, randomiser l'ordre d'injection.Copiez maintenant votre commande d'injection et collez-la dans le logiciel de file d'attente d'échantillons LCMS. Réservez les trois premières lignes de la file d'attente pour les injections de conditionnement de colonne. Préparez un stock de 10 millilitres d'échantillon de contrôle qualité contenant au minimum quatre composés de masse et de temps de rétention connus, couvrant l'éluage chromatographique de l'expérience.Décongeler les échantillons de sérum sur de la glace et les vortexer doucement pendant environ cinq secondes. Humidifier préalablement les embouts d'une pipette multicanal avec du méthanol afin d'éviter les gouttes pendant la distribution des échantillons. Ajouter ensuite 370 microlitres de méthanol froid dans chaque puits d'une plaque 96 puits, puis transférer 100 microlitres de chaque échantillon à l'emplacement correspondant sur la plaque, conformément aux cartes de plaques.Couvrez les plaques et incubez-les à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour précipiter les protéines, centrifugez les plaques à 3 200 G et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, transférez 250 microlitres du surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits et répétez l'étape de centrifugation.Transférez maintenant des aliquotes de 60 microlitres du surnageant dans 3 plaques de 96 puits adaptées au système d'échantillonnage automatique UPLC ou LC. Ajoutez 100 microlitres du mélange d'échantillons de contrôle qualité (QC) dans la position de puits réservée sur la plaque. Scellez chaque plaque avec un film adhésif.Régler le robot de prélèvement automatique à quatre degrés Celsius. Placer les deux premières plaques dans le robot de prélèvement automatique. Configurer la méthode d'acquisition en utilisant l'un des deux gradients alternatifs en phase inverse.Le gradient A est orienté vers les molécules non polaires. Le gradient B permettra quant à lui une meilleure couverture des molécules modérément polaires. Régler le spectromètre de masse pour acquérir les données en mode positif, en balayant un rapport masse/charge de 50 à 1200.Les conditions spécifiques supplémentaires de l'instrument varient selon le système utilisé au début de chaque série. Effectuez manuellement l'injection des échantillons de contrôle qualité (QC) cinq fois. Utilisez les injections de QC allant de la troisième à la cinquième pour surveiller une aire des pics inférieure à 25 % de RSD, un temps de rétention variant de ± 0,05 minute et une précision de masse de ± 3 parties par million.Ces paramètres peuvent nécessiter un ajustement pour correspondre aux spécifications de l'instrument utilisé pour l'acquisition des données. Si les échantillons de contrôle de qualité (QC) sont validés, acquérir les données sur les échantillons sériques pour ces deux plaques une fois que l'acquisition de l'ensemble du jeu de données est terminée. Effectuer la détection des caractéristiques, l'alignement et la normalisation des données de spectrométrie de masse pour l'ensemble du jeu de données.Ensuite, effectuez une analyse statistique afin de déterminer les caractéristiques moléculaires d'intérêt biologique. Ces étapes sont décrites dans le protocole textuel. Le flux de travail suivant présente un aperçu conceptuel du processus d'identification des métabolites.Une stratégie alternative est décrite dans le protocole textuel. Utilisez un logiciel pour prédire une formule moléculaire à partir de la masse exacte et de la distribution isotopique des caractéristiques moléculaires significatives. Ensuite, recherchez les mesures de masse exacte dans des bases de données de métabolites internes ou publiques.Les bases de données filtrent les métabolites candidats en fonction de l'erreur de masse, de la formule moléculaire prédite, du temps de rétention, de la fragmentation en source et de la pertinence biologique par rapport aux tendances observées en fonction du plan expérimental. Cela conduit à une identification putative du métabolite. L'identification absolue nécessite la concordance de la masse exacte, du temps de rétention et du profil de fragmentation du composé expérimental avec un étalon authentique du métabolite putatif.Enfin, attribuez un niveau de confiance à l'identification pour toutes les identifications de métabolites signalées, selon les recommandations de l'initiative de normalisation en métabolomique. Ce protocole indique les étapes analytiques de base pour réaliser une expérience de profilage métabolomique non ciblé par U-P-L-C-M-S. Les données brutes peuvent être visualisées sous forme de chromatogramme de pics de base.Cet exemple montre un échantillon de sérum qui a été analysé par une pente de gradient suivie d'une analyse statistique. L'identification des métabolites est tentée pour toutes les caractéristiques moléculaires biologiquement importantes et statistiquement significatives. Ici, la caféine a été identifiée dans le sérum humain en appariant le temps de rétention chromatographique, la masse exacte et le profil de fragmentation entre la caractéristique moléculaire expérimentale et une substance étalon authentique du métabolite présumé.Il s'agit d'un exemple d'identification de métabolite de niveau un. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assurer la stabilité analytique lors d'un profilage de métabolites non ciblé à grande échelle du sérum à l'aide de la CLUP/SM. Toutefois, la stabilité analytique n'est qu'un aspect important parmi d'autres d'une expérience réussie de profilage de métabolites. La conception de l'expérience ainsi que l'analyse et l'interprétation des données en aval sont également essentielles.Mais en dehors du champ de ce tutoriel vidéo, ces sujets sont présentés et discutés dans le protocole écrit.

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Non ciblée métabolomique fournit une hypothèse générer instantané d'un profil métabolique. Ce protocole démontrera l'extraction et l'analyse des métabolites provenant de cellules, le sérum ou les tissus. Une gamme de métabolites sont interrogés par extraction en phase liquide-liquide, microflow UltraPerformance chromatographie liquide / haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) couplé à un logiciel d'analyse différentielle.

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

La fiabilité des résultats dans les expériences de la métabolomique dépend de l'efficacité et la reproductibilité de la préparation de l'échantillon. Décrit une méthode rigoureuse et en profondeur qui permet l'extraction de métabolites à partir de fluides biologiques avec l'option de la suite à l'analyse des milliers de composés, ou seulement les classes de composés d'intérêt.

Multi-étape de préparation technique pour récupérer plusieurs classes de composés de métabolites pour approfondie et analyse métabolomique informatif

Un protocole pour le profilage métabolique des échantillons biologiques par électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse en utilisant une conception d'interface de pointe poreuse introducteur est présenté.

Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Un protocole détaillé est décrit pour la séparation, l’identification et la caractérisation des proteoforms dans des échantillons de protéine à l’aide de la zone capillaire électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS). Le protocole peut être utilisé pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéine simple et l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe.

Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry

Nous décrivons ici une méthode de haut-débit pour la surveillance des médicaments complète qui permet la résolution améliorée et la détection de grands panneaux de drogues d’abus et de leurs métabolites, avec contrôle de la qualité basé sur l’injection multisegment-capillaire spectrométrie de masse à l’électrophorèse.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

Une méthode pour l’analyse non ciblée des métabolites et des lipides de grain de blé est présentée. Le protocole comprend une méthode d’extraction de métabolites en acétonitrile et une méthodologie de spectrométrie de chromatographie-masse liquide inversée, avec acquisition dans des modes d’ionisation électrospray positive et négative.

Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Les protocoles décrivent des méthodes de chromatographie liquide à haute performance couplées à la détection de l’indice de réfraction ou de la spectrométrie de masse pour l’étude des réactions métaboliques dans des systèmes complexes sans cellules à base de lysate.

Chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de réfraction ou de masse pour le profilage de métabolites dans des systèmes sans cellules à base de lysate

L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma à l’aide d’une méthode de chromatographie-spectrométrie de masse semi-ciblée.

Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés

Apprenez le profilage métabolomique non ciblé du sérum par UPLC-MS à grande échelle. Cette méthode robuste permet d'extraire, d'analyser et d'identifier des biomarqueurs moléculaires avec contrôle qualité rigoureux.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) (Vidéo) | JoVE Journal

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Explorer plus de vidéos