ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

L’objectif global de cette procédure est la prédiction de la structure secondaire de l’ARN avec une résolution nucléotidique unique. Ceci est accompli en modifiant d’abord chimiquement l’ARN replié avec un réactif électrophile qui isole les régions monocaténaires ou flexibles de l’ARN. La deuxième étape consiste à utiliser la transcription inverse pour détecter les sites de l’ARN qui ont été modifiés chimiquement.

Ensuite, les produits CD NA de la transcription inverse sont fractionnés par électrophorèse capillaire. La dernière étape est le traitement et la normalisation des données. En fin de compte, le logiciel de structure de l’ARN est utilisé pour prédire la structure secondaire de l’ARN en utilisant les contraintes d’énergie pseudo libre dérivées de l’analyse de la forme.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que la façon dont la structure de l’ARN régit les fonctions des ARN catalytiques et non actuels, et comment les génomes des ARN viraux régulent la multifonctionnalité de leurs génomes. Les implications de cette technique s’étendent à notre thérapie et au diagnostic des maladies virales ou du cancer, car obtenir des informations sur la structure secondaire de l’ARN pourrait aider à la conception de médicaments basés sur la structure. Bien que cette méthode donne des informations sur la structure des ARN produits par transcription in vitro, elle peut également être appliquée in vivo puisque les réactifs de forme sont perméables aux cellules.

Avant de commencer cette procédure, préparez l’ARN par transcription in vitro. À l’aide d’un kit de transcription commercial. Les ARN doivent être stockés dans un tampon TE entre moins 20 et moins 80 degrés Celsius dans un microtube à centrifuger de 0,5 microlitre.

Diluez 12 pico moles d’ARN à 18 microlitres d’eau et ajoutez deux microlitres de mélange de tampons de 10 x renaturation en tapotant le tube, puis tournez brièvement et chauffez le mélange dans le tube à 85 degrés Celsius pendant une minute, puis refroidissez à quatre degrés Celsius à raison de 0,1 degré Celsius par seconde. Ajoutez 100 microlitres d’eau et 30 microlitres de cinq tampons pliants dans le tube de la micro-centrifugeuse. Ensuite, incubez le contenu du tube à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes selon l’ARN replié.

En général, le repliement dépendant du magnésium d’ARN plus longs et plus structurés nécessite des temps d’incubation plus longs Transférez une aliquote de 72 microlitres dans chacun des deux tubes de micro-centrifugeuse de 0,5 millilitre, qui doivent être étiquetés comme modifiés et témoins respectivement. L’étape suivante consiste à ajouter huit microlitres de diméthylsulfoxyde anhydre au mélange témoin et à réserver. Ajoutez ensuite huit microlitres de 10 x et MIA au mélange modifié.

Incuber le mélange modifié et contrôler à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Ajoutez huit microlitres de trois acétate de sodium, un pH de 5,28 microlitres de 100 millimolaires, de l’EDTA, de 240 microlitres d’éthanol froid et un microlitre de 10 milligrammes par millilitre. Le glycogène dans le tube mixte modifié pour précipiter l’ARN modifié réfrigère le contenu du tube pendant deux heures à moins 20 degrés Celsius, puis centrifuge à 14 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez le granulé deux fois avec une centrifugation à froid à 70 % d’éthanol pendant cinq minutes. Après chaque lavage, retirez le surnageant à l’aide de la micro-pipette et faites sécher la pastille à l’air libre pendant cinq minutes. À température ambiante, préparez les échantillons modifiés et témoins pour la transcription inverse dans des microtubes à centrifuger de 0,5 millilitre.

Pour la réaction modifiée, mélangez cinq microlitres d’ARN modifié, six microlitres d’eau et un microlitre d’une solution d’amorce marquée à 10 micromolaires. Pour la réaction de contrôle, mélangez cinq microlitres d’ARN de contrôle, six microlitres d’eau et un microlitre d’une solution d’amorce marquée à 10 micromolaires sci 5.5. Placez les tubes dans un thermocycleur et agenouillez l’amorce devant l’ARN.

Lors d’un agenouillement, préparez un mélange 2,5 x RT. Pour chaque réaction RT, mélangez bien et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes avant d’ajouter aux réactions à genoux. Une fois que la température de l’agenouillé atteint 50 degrés Celsius, ajoutez huit microlitres de 2,5 XRT.

Mélangez et incubez pendant 50 minutes à 50 degrés Celsius. Ensuite, hydrolysez l’ARN en ajoutant un microlitre d’hydroxyde de sodium à quatre molaires et en chauffant à 90 degrés Celsius pendant trois minutes. Refroidissez les réactions sur de la glace puis neutralisez-les en ajoutant deux microlitres d’acide chlorhydrique à deux molaires.

Combinez maintenant les réactions modifiées et de contrôle et ajoutez 0,1 volume ou un dixième du volume total de réaction de trois molaires d’acétate de sodium et 100 millimolaires d’EDTA, 1,5 volume d’éthanol froid et un microlitre de 10 milligrammes par millilitre. Glycogène. Il en résulte que l’ARNC précipite hors de la solution. Réfrigérer la solution pendant deux heures, puis centrifuger à 14 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Lavez le granulé deux fois avec du froid, 70 % d’éthanol en suspension, le CD NA granulé dans 40 microlitres de forme désionisée amide en chauffant à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi d’un tourbillon vigoureux pendant au moins 30 minutes pour la préparation de la réaction de séquençage dans un mélange de microtube de centrifugation de 0,5 millilitre 40 microlitres du mélange de terminaison DDA. Cinq moles PICA de la matrice d’ADN, 4,6 microlitres de tampon 10 x sease et 10 microlitres d’amorce D bien lue à deux marqués. À ce mélange, ajoutez 4,6 microlitres de QUIN A et diluez avec de l’eau pour porter le volume total à 82 microlitres.

Préparez une deuxième réaction de séquençage de la même manière en utilisant plutôt du DDT et de l’amorce marquée au lycor IR 800. Ensuite, passez à l’amplification PCR en utilisant les conditions recommandées par l’USB. Ajoutez 16 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires, pH 5,2, 16 microlitres d’EDTA de 100 millimolaires, un microlitre de 10 milligrammes par millilitre de glycogène et 480 microlitres d’éthanol à 95 % pour précipiter l’ADN, puis incubez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes et centrifugez à 14 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Remettre en suspension le CD NA granulé dans 100 microlitres de forme amide désionisée en chauffant à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi d’un tourbillon vigoureux pendant au moins 30 minutes. Ensuite, mélangez 40 microlitres d’échantillons de forme groupée avec 10 microlitres d’échelles de séquençage groupées et pipetez le volume total de l’échantillon dans le programme de plaques d’échantillon à 96 puits, préparez l’instrument d’électrophorèse capillaire et lancez un essai selon les instructions du fabricant. Les quatre traces codées par couleur qui se chevauchent sont produites par la migration des quatre ensembles de produits de réaction à travers le capillaire comme suit, la trace bleue montre les produits de transcription inverse générés par la transcription inverse des ARN modifiés NMIA.

Le Green Trace montre des produits de transcription inverse à partir d’ARN repliés mais autrement non modifiés. La trace noire montre l’échelle de séquençage D-N-A-D-D-G et la trace rouge montre l’échelle de séquençage DDT. Les traces brutes d’électrophorèse capillaire sont séparées, traitées, alignées et intégrées à l’aide d’un logiciel de recherche de formes.

L’analyse des données commence par l’importation des électrophérogrammes du système d’électrophorèse capillaire dans le localisateur de forme. La fenêtre centrale de la vue des données fournit un retour graphique sur chaque étape de traitement des données. La fenêtre de l’inspecteur d’outils située en bas à gauche de l’écran affiche les paramètres des outils sélectionnés dans l’inspecteur de script.

L’inspecteur de script en haut de l’écran affiche les outils qui ont été appliqués aux données, ajuste les électrophérogrammes pour corriger le fond fluorescent, le chevauchement spectral entre les canaux fluorescents, les décalages de mobilité, transmis par des amorces étiquetées différemment, la décroissance du signal résultant de l’arrêt prématuré de la transcription inverse et les différences d’intensité de fluorescence des produits courants étiquetés avec différents fluorophores dans les outils d’alignement et d’intégration des chercheurs de forme. Utilisez la fonction de configuration pour attribuer automatiquement des identités à des pics individuels et corréler ces informations à la séquence d’ARN telle que définie par l’entrée de l’utilisateur et aux deux échelles de séquençage pour incorporer les profils de réactivité nucléotidique dans l’algorithme de structure secondaire utilisé par le logiciel RNA structure 5.3 et/ou pour comparer des profils d’ARN étroitement apparentés. Normalisez les données de forme de manière standardisée.

Pour ce faire, excluez les valeurs aberrantes des calculs ultérieurs. Déterminez la réactivité maximale effective et normalisez en divisant toutes les valeurs de réactivité par le maximum effectif. Un logiciel de structure d’ARN est utilisé pour prédire les structures secondaires d’ARN soutenues expérimentalement en utilisant les contraintes d’énergie pseudo libre de l’analyse de forme.

Le logiciel fournit des représentations graphiques de l’énergie la plus faible pour les structures DRNA, ainsi qu’une représentation textuelle de ces structures. Dans la notation par crochets, la séquence et l’annotation par crochet doivent être importées dans le visualiseur de structure d’ARN. Le graphique illustré ici est la structure 2D de la boucle de tige de l’élément de réponse au VIH générée dans la structure d’ARN 5.3 à l’aide des profils de réactivité dérivés de la forme et visualisée à l’aide d’une applet légère Java. Les nucléotides de couleur bleue ont une faible réactivité, tandis que les nucléotides de couleur rouge ont une réactivité plus élevée Une fois maîtrisée, la technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le modèle d’ARN résultant doit être soigneusement interprété avant de tirer des conclusions finales sur la structure secondaire de l’ARN après cette procédure. D’autres méthodes, comme l’utilisation de l’exploration des radicaux hydroxyles à travers les méthodes de clivage spatial, peuvent être effectuées afin d’élucider des interactions tertiaires complexes et, éventuellement, de permettre aux chercheurs de déterminer les structures de ces ARN en trois dimensions.