Name: ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Découvrez la prédiction de la structure secondaire de l'ARN avec une résolution à nucléotide unique grâce à la technologie SHAPE. Cette méthode combine modification chimique, transcription inverse et électrophorèse capillaire pour analyser des séquences d'ARN complexes.

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S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch et SFJ Le Grice sont pris en charge par le Programme de recherche intra-muros de l&#39;Institut national du cancer, National Institutes of Health, USA.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la forme à haut débit, une technique qui permet de déterminer la structure secondaire de la résolution d&#39;un nucléotide simple pour des ARN de toute taille. En outre, le couplage des données du SHAPE expérimentales avec secondaires algorithmes de prédiction de structure facilite la génération de modèles 2D ARN avec un degré de précision plus élevé que ce qui est possible avec soit seule méthode. La combinaison d&#39;amorces marquées par fluorescence et automatisé CE four...

Pour comprendre les fonctions des ARN catalytiques et non-codantes impliquées dans la régulation de l&#39;épissage, la traduction, la réplication du virus et le cancer, une connaissance détaillée de la structure d&#39;ARN est nécessaire 1,2. Malheureusement, la prédiction exacte du repliement des ARN constitue un formidable défi. Agents de sondage classiques souffrent de nombreux inconvénients tels que la toxicité, la couverture de nucléotides incomplètes et / ou le débit limité à 100-150 nucléotides par expérience. Secondaires algorithmes de prédiction de structure spontanées sont tout aussi désavantageux, en raison d&#39;inexactitudes résultant de leur incapacité à distinguer efficacement entre les structures énergiquement similaires. Grand ARN, en particulier, sont également souvent réfractaires aux procédés de détermination de la structure 3D telle que la cristallographie aux rayons X et par résonance magnétique nucléaire (RMN), en raison de leur flexibilité conformationnelle et de grandes quantités d&#39;échantillons de grande pureté nécessaires à ces techniques. HSHAPE aute-débit permet de résoudre nombre de ces problèmes en fournissant une approche efficace, simple à sonder les structures des grands ARN à la résolution d&#39;un nucléotide simple. En outre, les réactifs utilisés pour la forme sont sûrs, faciles à manipuler et, contrairement à la plupart des autres produits chimiques sondage réactifs, réagissent avec les quatre ribonucléotides. Ces réactifs peuvent aussi pénétrer dans les membranes cellulaires, ce qui permet de sonder ARN dans leur contexte in vivo (s) 3. Initialement développé dans les semaines laboratoire 4, SHAPE a été utilisée pour analyser une grande variété d&#39;ARN, l&#39;exemple le plus notable étant la détermination de la structure secondaire complète du ~ 9 kb ARN du VIH-1 du génome 5. Autres réalisations notables en utilisant SHAPE comprennent élucidation des structures de viroïdes infectieuses 6, ARN humains longs non codants 7, les ribosomes de levure 8 et 9 riboswitches ainsi que d&#39;identifier les sites de liaison de protéines à virion associée à ARN VIH-1 3. While aux variations originales et haut débit du protocole du SHAPE ont été publiés ailleurs 10-12, le présent ouvrage fournit une description détaillée de l&#39;ARN détermination de la structure secondaire par le SHAPE à haut débit en utilisant des oligonucléotides fluorescents, le Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer Beckman, et (v5.3) Logiciel de ShapeFinder et RNAStructure. Détails techniques inédites et des conseils de dépannage sont également inclus. Variations de forme L&#39;essence de forme et de ses variations est une exposition de l&#39;ARN en solution aqueuse à des anhydrides électrophiles qui acyler sélectivement 2&#39;-hydroxyle (2&#39;-OH), groupes ribose, produisant des produits d&#39;addition encombrants dans les sites de modification. Cette réaction chimique est un moyen d&#39;interroger la dynamique des structures d&#39;ARN locales, nucléotides simple brin sont plus enclins à adopter des conformations favorables à une attaque électrophile par ces réactifs, tandis que la base jumelé ou architectural constructionnucléotides ained sont moins ou pas réactif 10. Sites de la formation d&#39;adduits sont détectés par transcription inverse à partir d&#39;amorces initier par fluorescence ou radioactif hybridées à un site spécifique sur l&#39;ARN modifié (le &quot;(+)&quot; réaction d&#39;extension d&#39;amorce). Lorsque la transcriptase inverse (RT) ne parvient pas à traverser les ribonucléotides acylés, un pool de produits d&#39;ADNc est produit dont les longueurs coïncider avec les sites de modification. Un contrôle &quot;(-)&quot; primer extension de réaction en utilisant l&#39;ARN qui n&#39;a pas été exposé à un réactif est également effectuée de sorte que la résiliation prématurée de la synthèse d&#39;ADN (par exemple, «arrêts») en raison de structure de l&#39;ARN, non spécifique bris à ARN, etc, mai. être distinguée de faire une pause produite par modification chimique. Enfin, deux réactions séquençage didésoxy initiateurs des mêmes amorces sont utilisés comme marqueurs de corréler nucléotides réactifs avec la séquence primaire d&#39;ARN après électrophorèse. Dans la demande initiale de ShapE, le même 32P-fin-amorce marquée est utilisée pour la (+) - et les deux réactions de séquençage (). Les produits de ces réactions sont chargés dans des puits adjacents dans un gel de polyacrylamide de la dalle de 5-8%, et fractionné par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (PAGE; figure 1). L&#39;analyse quantitative des images de gel produites par forme classique peut être réalisée en utilisant SAFA, un logiciel d&#39;analyse de l&#39;empreinte semi-automatique 13. En contraste, la forme à haut débit utilise des amorces marquées par fluorescence et électrophorèse capillaire automatisé. Plus précisément, pour chaque région d&#39;ARN sous enquête, une série de quatre amorces d&#39;ADN ayant une séquence commune mais différente 5 &#39;marqueurs fluorescents doivent être synthétisés ou achetés. Ces oligonucléotides différemment marquées premiers servent à deux réactions de forme et deux réactions de séquençage, dont les produits sont regroupés et fractionné / détectés par électrophorèse capillaire automatisée (CE). WherEAS le profil de réactivité de 100-150 nt de l&#39;ARN peut être obtenue à partir d&#39;un ensemble de quatre réactions en utilisant l&#39;approche originale, SHAPE à haut débit permet une résolution de 300-600 nt partir d&#39;un seul échantillon composite 3. Jusqu&#39;à 8 séries de réactions peut être fractionné en même temps, alors que pas moins de 96 échantillons peuvent préparé pour le fractionnement au cours de 12 séries consécutives CE (Figure 2). En outre, le logiciel de ShapeFinder, développé pour traiter et analyser les données issues de la CEQ et autres analyseurs génétiques, est plus automatisé et requiert beaucoup moins d&#39;intervention de l&#39;utilisateur que SAFA 13 ou d&#39;autres paquets gel-analyse. Méthodologies à haut débit les plus avancées ont récemment émergé comme PARS (analyse parallèle de structure de l&#39;ARN) 14 et Frag-Seq (fragment de séquençage) 15, qui utilisent des enzymes structure spécifique plutôt que réactifs d&#39;alkylation en conjonction avec la prochaine génération de techniques de séquençage à obtenir information sur la structure d&#39;ARN. Malgré l&#39;attrait de ces techniques, les nombreuses limitations inhérentes à la nucléase sondage demeurent 16. Ces problèmes peuvent être contournés dans le séquençage du SHAPE (SHAPE-Seq) 17 protocole, où le séquençage de prochaine génération est précédée par modification chimique et la transcription inverse de l&#39;ARN d&#39;une manière similaire à celle réalisée en forme classique. Bien que ces méthodes peuvent représenter l&#39;avenir de la détermination de la structure de l&#39;ARN, il est important de se rappeler que le séquençage de prochaine génération est très coûteux, et reste disponible pour de nombreux laboratoires. Analyse de données de forme Les données produites dans l&#39;analyseur génétique est présenté sous la forme d&#39;un électrophérogramme, dans lequel l&#39;intensité de la fluorescence de l&#39;échantillon (S) s&#39;écoulant à travers le détecteur capillaire est tracée en fonction d&#39;un index de temps de migration. Cette parcelle prend la forme de traces superposées correspondant au canal de quatre fluorescences utilisé pour détecter les fluorophores différents, et où chaque trace est constituée de pics correspondant à des produits de séquençage d&#39;ADNc ou individuels. données Electrophorégramme sont exportées de l&#39;analyseur génétique comme un fichier texte délimité par des tabulations et importés dans la transformation de ShapeFinder et des logiciels d&#39;analyse 18. ShapeFinder est initialement utilisé pour effectuer une série de transformations mathématiques sur les données afin de s&#39;assurer que les temps de migration et les volumes de pointe reflètent avec précision les identités et les quantités de produits de réaction, respectivement. Les pics sont alors alignés et intégrés, et les résultats compilés avec la séquence d&#39;ARN primaire. Un &quot;profil de réactivité&quot; pour le segment pertinent de l&#39;ARN est obtenue en soustrayant les valeurs de contrôle à partir des valeurs (+) associé à chaque nucléotide d&#39;ARN, et normaliser les données comme décrit ci-dessous. Ce profil est importé dans RNAstructure (v5.3) 19,20 logiciels, qui convertit le val de réactivité normaliséeues en contraintes pseudo-énergie qui sont incorporés dans l&#39;algorithme de pliage de la structure secondaire de l&#39;ARN. La combinaison chimique de sondage et de pliage algorithmes de cette manière améliore considérablement la précision de la prédiction de la structure par rapport à chaque méthode seule 12,21. La sortie de RNAstructure (v5.3) comporte des images de la plus basse énergie structures secondaires d&#39;ARN codés par couleur avec le profil du SHAPE de réactivité (s), ainsi que les mêmes structures en notation point-support textuel. Celui-ci peut ensuite être exporté vers un logiciel dédié à l&#39;affichage graphique de la structure secondaire de l&#39;ARN tels que Varna 22 et PseudoViewer 23. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de la détermination de la structure de l&#39;ARN via SHAPE 4,10. (A) ARN may être obtenue à partir d&#39;échantillons biologiques ou par transcription in vitro. (B) Selon la source, l&#39;ARN est plié ou autrement traité et modifié avec le réactif du SHAPE. (C) La transcription inverse en utilisant des amorces fluorescente ou radioactive étiquetés. (d) les produits d&#39;ADNc sont fractionné soit par électrophorèse en gel capillaire ou de la dalle. (E) l&#39;analyse de fragments. (F) ARN prédiction de la structure. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> Figure 2. Le caractère à haut débit de FORME CE à base permet l&#39;analyse rapide de plusieurs ARN, et / ou plusieurs segments de la même ARN. (A) </strong&gt; représente la façon dont un ARN peut être divisé en sections 300-600 NT (code couleur en vert, bleu et rouge) (b) les articles de l&#39;ARN sont détectés indépendamment en utilisant différents jeux d&#39;amorces fluorescentes (flèches noires) (C) ensembles de les réactions sont mises en commun et chargés dans les puits A1, B1, C1, etc, respectivement, en fournissant une couverture complète pour l&#39;ARN 1 ~ 3 kb. Les produits de réaction à partir d&#39;ARN 2, 3, 4, etc peuvent être préparés de manière similaire pour le fractionnement dans les courses électrophorétiques consécutifs. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure.</a>

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>N-methylisatoid anhydride (NMIA)</td><td>Life technologies</td><td>M25</td><td>Dissous dans</td></tr><tr><td>l’anhydride anhydre DMSO 1-methyl-t-nitroisatoic (1M7)</td><td>voir réf. 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Life technologies</td><td>18080044</td><td>10 000 unités</td></tr> Kit <tr><td>de séquençage du cycle Thermo sequenase</td><td>Affymetrix</td><td>78500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Matériaux fournis par l’utilisateur</ARN>fort</td></tr> <tr><td>d’intérêt</td><td></td><td></td><td>6 pmol par réaction (la limite de détection sera déterminée par l’instrument)</td></tr><tr><td>Ensembles de quatre amorces marquées 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 et WellRed D1/Licor IR800)</td><td></td><td></td><td>Les amorces sont complémentaires à l’ARN et sont utilisées dans les réactions de transcription inverse et de séquençage. Les fluorophores énumérés sont optimaux pour le Beckman Coulter 8000 CEQ. Les amorces peuvent être achetées ou synthétisées en interne.</td></tr><tr><td>L’ADN</td><td></td><td></td><td>est utilisé pour le séquençage des réactions et doit contenir la séquence de l’ARN étudié, y compris toute extension 3'terminale, le cas échéant. Le cas échéant, il est souvent pratique d’utiliser le modèle de transcription de l’ARN.</td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>10x Tampon</td><td></td><td></td> de renaturation d’ARN <td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5X Tampon</td><td></td><td></td> de repliement d’ARN <td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Ce tampon peut être modifié selon le cas (par exemple pH, EDTA, Mg, inhibiteur de la RNase)</td></tr><tr><td>2.5X RT mix</td><td></td><td></td><td>4 &mu ; l 5X tampon, 1 &mu ; l 100 mM TNT, 1.5 &mu ; l eau,1 &mu ; l 10 mM dNTPs, 0,5 &mu ; l SuperScript III. Notez que le tampon 5X et la TNT 100 mM sont fournis avec l’achat de SuperScript III (Invitrogen).</td></tr><tr><td>Solution de chargement d’échantillons GenomeLab (Beckman Coulter)</td><td></td><td></td><td>Attention : Évitez plusieurs cycles</td></tr><tr> de gel-dégel<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Électrophorèse capillaire</td><td>Beckman</td><td>CEQ8000</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>varie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

arn prédiction de la structure secondaire via shape à haut débit

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Comprendre la fonction de l&#39;ARN impliqués dans les processus biologiques requiert une connaissance approfondie de la structure de l&#39;ARN. À cette fin, la méthodologie baptisée «haut débit 2 sélectif &#39;acylation hydroxyle analysés par extension d&#39;amorce» ou la forme, permet de prédire la structure secondaire de l&#39;ARN avec une résolution au nucléotide. Cette approche utilise des agents chimiques de sondage qui ACYLATE préférentiellement régions câblé ou flexible simples d&#39;ARN en solution aqueuse. Sites de modification chimique sont détectés par transcription inverse de l&#39;ARN modifié, et les produits de cette réaction sont fractionnés par électrophorèse capillaire automatisé (CE). Depuis la transcriptase inverse s&#39;arrête à ces nucléotides d&#39;ARN modifiées par les réactifs de forme, la banque d&#39;ADNc résultant mappe indirectement ces ribonucléotides qui sont simple brin dans le contexte de l&#39;ARN repliées. Utiliser un logiciel de ShapeFinder, les électrophérogrammes produites par automatisé CE sont traités et transformés en nutables de réactivité cleotide qui sont eux-mêmes transformés en contraintes pseudo-énergie utilisée dans le RNAStructure (v5.3) de l&#39;algorithme de prédiction. Les structures d&#39;ARN à deux dimensions obtenues par combinaison d&#39;une forme de sondage avec in silico ARN prédiction de structure secondaire ont été trouvés à être beaucoup plus précis que les structures obtenues en utilisant soit la méthode utilisée seule.

ARN contenant le VIH-1 élément rev de réponse (RRE), et une extrémité 3 &#39;de la cassette de la structure 4 est préparé à partir d&#39;un plasmide linéarisé par la transcription in vitro, après quoi elle a été plié par chauffage, de refroidissement, et l&#39;incubation à 37 ° C en présence de MgCl 2. L&#39;ARN a été exposé à NMIA puis une transcription inverse à partir d&#39;une amorce d&#39;ADN 5&#39;-fin-marquée hybridée à la borne cassette de structure de l&#39;extrémité 3 &#...

Haut-débit sélectif 2 &#39;acylation hydroxyle analysés par extension d&#39;amorce (SHAPE) utilise une nouvelle chimique sonder la technologie, la transcription inverse, l&#39;électrophorèse capillaire et les logiciels de prédiction de structure secondaire pour déterminer les structures des ARN de plusieurs centaines à plusieurs milliers de nucléotides à une résolution au nucléotide.

ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

L'objectif général de cette procédure est la prédiction de la structure secondaire de l'ARN avec une résolution d'un nucléotide. Cette prédiction est réalisée en modifiant d'abord chimiquement l'ARN replié à l'aide d'un réactif électrophile qui isole les régions simples brins ou flexibles de l'ARN. La deuxième étape consiste à utiliser la transcription inverse pour détecter les sites de l'ARN qui ont été modifiés chimiquement.Ensuite, les produits ADNc de la transcription inverse sont fractionnés par électrophorèse capillaire. La dernière étape consiste en le traitement et la normalisation des données. Enfin, un logiciel de structure ARN est utilisé pour prédire la structure secondaire de l'ARN à l'aide des contraintes de pseudo-énergie libre dérivées de l'analyse de forme.Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que la manière dont la structure de l'ARN régit les fonctions des ARN catalytiques et non codants, et comment les génomes viraux d'ARN régulent la multifonctionnalité de leurs génomes. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic des maladies virales ou du cancer, c

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Découvrez la prédiction de la structure secondaire de l'ARN avec une résolution à nucléotide unique grâce à la technologie SHAPE. Cette méthode combine modification chimique, transcription inverse et électrophorèse capillaire pour analyser des séquences d'ARN complexes.

ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

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