Name: Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de Xenopus Nerf-muscle co-cultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Découvrez l'enregistrement électrophysiologique simultané pré- et post-synaptique sur des co-cultures nerf-muscle de Xenopus. Cette méthode permet d'étudier la physiologie synaptique et la libération de neurotransmetteurs.

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Financé par la NSF (0854551).

1. Préparation pré-expérimentale <ol><li> Préparer les solutions suivantes (voir le tableau 1 pour les compositions): (a) 1 litre NFR (Ringer de grenouille normale), (b) une solution saline 100 ml 10%, (c) 100 ml CMF (Ca 2 + / Mg 2 + sans solution ), (d) 1 ml SA (Insulin-transferrine-Sélénium, Sigma I1884), (e) 100 ml de milieu L-15 de la culture, (f) 10 ml HCG (gonadotrophine chorionique humaine Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-interne solution, (h) 100 ml K +-interne solution pour l&#39;amphotéricine B. La force osmotique de la solution 1 doit être vérifiée afin de s&#39;assurer qu&#39;elle est d&#39;environ 260 mOsm l&#39;aide d&#39;un osmomètre à pression de vapeur (p. ex Wescor modèle # 5100C) . </li><li> Stériliser par filtration des solutions (b) et (c). Les solutions (a) (b) et (c) peuvent être stockées jusqu&#39;à trois mois à 4 ° C. Préparer une solution (d) par addition de 1 ml d&#39;eau désionisée H 2 O dans le flacon contenant la poudre lyophilisée par une aiguille de calibre 25 et un filtre seringue seringue. Cette solution finale cun être conservés à 4 ° C pendant 30 jours. </li><li> Préparer une solution (E) dans une hotte à flux laminaire, en combinant tous les composants dans un bécher ou une fiole. Stériliser par filtration de la solution finale et transférer aliquotes de 10 ml dans des tubes à centrifuger stériles. Conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer l&#39;HCG (solution (f)) en ajoutant 10 ml d&#39;eau désionisée H 2 0 dans le flacon contenant la poudre lyophilisée aide d&#39;une aiguille de calibre 25 seringue et d&#39;un filtre seringue. Cette solution finale peut être conservé à 4 ° C pendant 30 jours. </li><li> Fabriquer au moins deux outils de microdissection par collage d&#39;un axe minuties (26002-10, Outils Fine Science) à l&#39;extrémité d&#39;une pipette Pasteur en verre avec de la colle cyanoacrylate. Permettre à l&#39;extrémité pointue de la broche à s&#39;étendre au-delà de l&#39;extrémité de la pipette d&#39;environ 0,5 cm. </li><li> Deux jours avant la préparation des cultures, induire la reproduction à la procédure suivante. Identifier un couple reproducteur-prêt de Xenopus en observant un éminent, cloaque rougeâtre sur la pigmentation foncée des femmes et sur ​​le plan surface des pattes avant du mâle. Un à la fois, déduction faite chaque grenouille et maintenez-la face ventrale vers le bas sur un évier avec le filet de sorte qu&#39;il ne peut pas s&#39;échapper. Injecter 1 ml de solution (f) à travers le net et sous-cutanée dans des sacs lymphatiques dorsaux. </li><li> Placez le couple reproducteur ensemble dans un réservoir couvert dix litres d&#39;eau. Afin de s&#39;assurer que les animaux ne seront pas piétiner les oeufs fraîchement pondus et fertilisés, installer un plancher blindé avec un maillage d&#39;environ ½ &quot;équipés d&#39;environ 1-2 cm au-dessus du fond de la cuve (figure 1A). </li><li> Laisser grenouilles intactes pendant 12-48 h jusqu&#39;à ce que les animaux sont en amplexus les oeufs fertilisés sont observées à l&#39;étage inférieur de l&#39;écran (figure 1B). </li><li> Retirer les animaux de la citerne, mais laisser les œufs reposer pendant au moins 24 heures plus. Cette paire de grenouilles peuvent être réutilisés élevés après six semaines. </li><li> Desserrez les embryons du fond de la cuve et de les transférer à quatre ou cinq culte mm 60x15ure plats contenant une solution saline à 10% (solution B). Trier les embryons par étape selon le schéma de Niewkoop et Faber (réf. 20). Embryons utiles seront ceux au stade 22-24. Figure 2A montre un embryon au stade d&#39;environ 22, tandis que la figure 2B montre un embryon qui est trop loin dans le développement pour être utile (environ étape 28). Il est important de choisir les embryons qui sont en bonne santé: ceux qui sont d&#39;apparence lisse marron clair avec des marbrures blanches et sont idéales. Les embryons qui ont de grandes taches noires ou blanches sont généralement malsain et inutilisable. </li></ol> 2. Microdissection d&#39;embryons de xénope <ol><li> L&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire, l&#39;étiquette et remplissez environ à mi-chemin trois plats 60x15 mm culture stériles avec une solution saline à 10%, et une avec FMC. </li><li> En utilisant une solution stérile, pipette Pasteur en verre transfert de cinq à dix étapes 22-24 embryons dans l&#39;une des boîtes contenant une solution saline à 10%. Avec l&#39;aide d&#39;un zoom stéréo disséquermicroscope ment intérieur de la hotte (0,6-5x avec oculaires x 10), enlever la couche de gelée et de la membrane vitelline de chaque embryon en utilisant deux paires de pinces stériles N ° 5 (11251-30, Outils Fine Science). (Voir les figures 3A et 3B). </li><li> Laver les embryons nus en les faisant passer, un à la fois, à travers les deux autres plats de solution saline à 10% et finalement dans le récipient métallique contenant du FMC. Utiliser une nouvelle pipette stérile pour chaque transfert et minimiser le volume de solution transféré de plat à plat. </li><li> À son tour, chaque embryon tenir doucement mais fermement avec une pince et, en utilisant l&#39;outil de microdissection façonné à l&#39;étape 1.5, retirer le tube neural et myotomes associés qui sont situés à l&#39;aspect le plus dorsale de l&#39;animal. Faire en faisant trois tranches, une à chaque extrémité de l&#39;emplacement du tube neural et un tiers seulement ventrale de celle-ci (figure 4A). Déplacez chaque tube neural disséqué / myotome à une partie propre de la vaisselle hors de la Granul&#39;eau jaunees et d&#39;autres débris (figure 4B). L&#39;axe dorsal-ventral, et les emplacements du tube neural et myotomes sont indiqués sur la figure 4. </li><li> Après une quinzaine de minutes dans cette solution pince utilisation (CMF) pour soulever la peau pigmentée libre du tissu disséqué et jeter. Après un temps supplémentaire 30-60 min, les cellules vont former un &quot;tas de sable&quot;, comme ils se dissocient les uns des autres (figure 4C). </li></ol> 3. Préparation de nerf-muscle co-cultures <ol><li> Décongeler un tube de 10 ml de milieu de culture et ajouter aseptiquement 70 pi SA et 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795). </li><li> Étiquette et remplissez stériles boîtes de 35 mm (culture FD35-100 World Precision Instruments) environ à mi-chemin avec un milieu de culture L-15 (solution (e)), un pour chaque embryon disséqués. </li><li> Fabriquer une pipette de placage en saisissant chaque extrémité d&#39;une pipette Pasteur en verre tout en maintenant la partie conique à feu. Tirer les bouts dehors à environ 10 cm et puis se détachent de l&#39;extrémité pour donner une pointe d&#39;environ 0,2 mm. </li><li> Utiliser la pipette placage pour aspirer le &quot;tas de sable&quot; d&#39;un embryon en minimisant la quantité de solution établi. Expulser les cellules sur le fond d&#39;une boîte de culture. Plaque de cellules sur plusieurs lignes. Observez plaqué des cellules indifférenciées (figure 5A et 5B). </li><li> Laisser les boîtes de cellules intactes plaqués pendant au moins quinze minutes pour laisser le temps aux cellules de se fixer l&#39;assiette. </li></ol> 4. Patch-clamp nerf-muscle Synapses <ol><li> Après 12-24 h de culture, les cellules plaquées prendre différentes caractéristiques morphologiques: les cellules musculaires deviennent fusiformes et neurones spinaux étendre les processus longs (figure 6). Fonctionnelle contact synaptique entre les varicosités neurites et les cellules musculaires peuvent être confirmés par paires simultanées des enregistrements électrophysiologiques. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; et &quot;V&quot; se réfèrent respectivement à la cellule musculaire, neuronalesoma et varicosités présynaptique. </li><li> Préparer deux électrodes de patch pour l&#39;enregistrement: l&#39;un pour le varicosités présynaptique et l&#39;autre pour la cellule musculaire. </li><li> Pour l&#39;électrode présynaptique, préparer une solution contenant de l&#39;amphotéricine comme suit: Ajouter 100 ul de DMSO à un tube de 1,5 ml contenant 5 mg d&#39;amphotéricine B (Sigma A4888). Vortex cette solution pendant 10 sec. Ensuite, ajouter 10 ul de cette solution dans un tube à centrifuger second contient 625 K +-ul interne solution pour l&#39;amphotéricine B (solution de (h)). Vortex comme ci-dessus. </li><li> Remplir l&#39;électrode de pré-synaptique avec l&#39;amphotéricine contenant K +-interne solution préparée à l&#39;étape 4,3 et l&#39;électrode de post-synaptique avec K +-interne solution (solution (g)). </li><li> Remplacez le support dans la boîte de culture avec NFR et le transférer à un microscope inversé équipé d&#39;une optique à contraste de phase. </li><li> Positionnez les deux électrodes juste au-dessus de leurs cibles respectives. Obtenir la collaboration de cellules entièresnfiguration avec l&#39;électrode de la cellule musculaire avant la configuration de patch perforé avec l&#39;électrode de varicosités. </li><li> Pour confirmer le fonctionnement de la synapse, dépolariser la varice avec un amplificateur de patch-clamp (par exemple Axopatch 200B, Molecular Devices) sous le contrôle du logiciel (par exemple pCLAMP 9, Molecular Devices) et d&#39;observer les courants simultanés présynaptiques et postsynaptiques. La figure 7 montre les courants observés en réponse à la dépolarisation des mesures de tension donnés à la varicosités présynaptique par incréments de 10 mV à -30 mV à +40 mV. Les courants entrants vus dans la cellule présynaptique sont portés par Na + et Ca 2 + et les courants sortants par K +. Courants enregistrés dans la cellule postsynaptique sont des réponses à des neurotransmetteurs libérés de la varice et sont portées principalement par des ions Na + à travers les canaux récepteurs de l&#39;acétylcholine nicotinique. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les principales étapes de la co-culture réussie des motoneurones et les cellules musculaires sont l&#39;utilisation d&#39;embryons mis en scène de façon appropriée produits de l&#39;élevage de grenouilles Xenopus induite, et la dissection minutieuse aseptique des neurones spinaux et les myoblastes non différenciés. Les œufs fécondés devrait être laissé au repos jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent environ 10 ou scène afin de les déplacer plus vite souvent freine leur développement. Embryons sains sont identifiés par un aspect lisse et une brune et blanche tachetée de coloration. Etape 22-24 embryons sont les plus utiles, car c&#39;est le point au cours du développement, juste après la fermeture du tube neural et avant les myocytes se sont différenciés de façon significative. En outre, les cellules provenant d&#39;embryons plus âgés ne parviennent pas à dissocier ainsi au FCM. Des précautions doivent être prises lors du retrait de la membrane vitelline car elle adhère fortement à l&#39;embryon. La membrane doit être déchiré l&#39;aide de pinces pointues pour que l&#39;embryon se dégage intacte. Une autre importante precaution est de bien placer les cellules sur le fond de la boîte de culture (plutôt que de les laisser s&#39;y installer). Cette méthode est préférable car cela augmente la probabilité que les cellules adhèrent à la boîte de culture. Neurotransmission fonctionnelle entre le nerf et le muscle peut être déterminée avec enregistrement juste postsynaptique et, souvent, peut être déterminée par l&#39;observation de la contraction musculaire spontanée après innervation. Cellules musculaires innervées non pas se contracter dans la culture. D&#39;enregistrement postsynaptique seule est utile pour enregistrer des plateaux vertébraux courants miniatures ou potentiels, mais des mesures de libération évoquée nécessite une stimulation présynaptique, et la corrélation des courants pré-et post-synaptique exige le double de patch-clamp. En plus de la méthode d&#39;enregistrement appariés correctif décrit ici, cette préparation offre la possibilité d&#39;introduire une pipette troisième au soma neuronal 5 Ce permet la génération d&#39;un potentiel d&#39;action that peut se propager à la varicosités présynaptique et conduire à la libération de neurotransmetteurs. En outre, les agents putatifs qui sont censés servir de médiateur ou de moduler la transmission synaptique peut être introduit de chaque côté de la synapse: via la pipette cellule musculaire ou par diffusion à partir d&#39;une pipette à la troisième place soma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Équipement / Fournitures </td><td> Vendeur </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-transferrine-Sélénium </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> La gonadotrophine chorionique humaine </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Osmomètre Pression de vapeur </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Pins minuties </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nom de solution </td><td> Recette </td></tr><tr><td> (A) NFR (Ringer de grenouille normale (en mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl2, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) une solution saline à 10% </td><td> 10 ml NFR 90 ml H 2 O déminéralisée </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 + sans solution) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Support L-15 de la culture </td><td> 50 ml L-15 (Sigma L1518 médias) + 50 ml NFR. </td></tr><tr><td> (G) K +-solution interne (en mM) </td><td> 116 KCl, 1 de NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, HEPES 5, pH 7,3 </td></tr><tr><td> (H) K +-solution interne de l&#39;amphotéricine B (en mM) </td><td> 52 K 2 SO 4, KCl 38, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de<em&gt; xenopus</em&gt; nerf-muscle co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Beaucoup d&#39;informations sur le couplage des courants ioniques présynaptiques avec la libération de neurotransmetteur a été obtenue à partir de préparations d&#39;invertébrés, notamment le calmar géant synapse 1. Toutefois, à l&#39;exception de la préparation décrite ici, il existe peu de préparations vertébrés dans lequel il est possible d&#39;effectuer des mesures simultanées de la libération des neurotransmetteurs et des courants ioniques présynaptiques. Embryonnaires de Xenopus motoneurones et les cellules musculaires peuvent être cultivées ensemble dans un milieu de culture simple à la température ambiante, ils vont former des synapses fonctionnelles dans les 12 à 24 heures, et peut être utilisée pour étudier les nerfs et le développement des cellules musculaires et les interactions synaptiques pendant plusieurs jours (jusqu&#39;à ce que prolifération se produit). Quelques avantages de ces co-cultures sur les préparatifs autres vertébrés comprennent la simplicité de préparation, la capacité de maintenir les cultures et le travail à la température ambiante, et l&#39;accessibilité aisée des synapses formée 2-4. La préparation a été largement utilisé pour étudier les propriétés biophysiques des canaux ioniques présynaptiques et la régulation de 5-8 libération du transmetteur. En outre, la préparation s&#39;est prêté à d&#39;autres usages, y compris l&#39;étude de la croissance des neurites et la synaptogenèse 9-12, les mécanismes moléculaires de la libération des neurotransmetteurs 13-15, le rôle de messagers diffusibles dans neuromodulation 16,17, et in vitro plasticité synaptique 18 - 19.

La figure 4B montre la vue dorsale d&#39;un cordon médullaire isolée / myotome immédiatement après son retrait à partir d&#39;un embryon de Xenopus étape 22. Figure 4C montre que, après l&#39;enlèvement de la peau et la solution d&#39;incubation de Ca 2 +-Mg 2 + sans solution (CMF, ( c)), les cellules se dissocient en un &quot;tas de sable&quot; et sont prêts pour le placage. Immédiatement après l&#39;étalement dans les cellules du milieu de culture présentent peu de variabilité morphologique (figure 5B), mais prendre des formes distinctes après 24 heures de culture. Les cellules musculaires deviennent fusiformes alors que les neurones restent sphériques tout en s&#39;étendant neurites qui varicosites élaborés au niveau des synapses avec les cellules musculaires (figure 6). L&#39;enregistrement simultané de correctif associé de la varice présynaptique et postsynaptique des cellules musculaires (figure 7) révèle les courants présynaptiques entrants et sortants associés à la libération de neurotransmetteurs et la resultant courants postsynaptiques excitateurs. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1:.. Paire d&#39;élevage de grenouilles dans un seau d&#39;accouplement au sommet de l&#39;écran B: Frogs in amplexus avec des œufs fécondés. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2:. B &quot;convenable&quot; embryon étape 22:. &quot;Impropre&quot; stade 28 embryonnaire. La barre d&#39;échelle représente 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3:. Stage 22 embryons avant de les enlever de vitelline membrane et la couche gelée. La flèche indique le bord extérieur de la couche gelée. La membrane vitelline adhère intimement à la embrans et est pratiquement invisible B:. embryon nu. La barre d&#39;échelle représente 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4: Stage 22 embryons par une ligne en pointillés indiquant à être disséqué partie B:.. Aiguë isolée partie dorsale de l&#39;embryon; &quot;d&quot; et &quot;v&quot; se réfèrent aux aspects dorsale et ventrale de l&#39;embryon, tandis que &quot;m&quot; et «n» indiquent les emplacements approximatifs des mytomes et tube neural C:. &quot;tas de sable&quot; de cellules après 60 min au FCM. La barre d&#39;échelle représente 1 mm pour A, et 0,5 mm pour B et C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Figure 5"/> A la figure 5:. 5x vue puissance de cellules en culture immédiatement après l&#39;étalement. B: la culture même à 40x. Échellebarre représente 40 pm pour A et pour B. 5 pm <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Jonction neuromusculaire en culture avec identification de neurones soma (S), varicosités présynaptique (V), et la cellule postsynaptique du muscle (M). Barre d&#39;échelle: 5 um. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Figure 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> Figure 7. Présynaptiques (en haut) et post-synaptique (en bas) courants observés en réponse à la demande de 10 mV de tension progressive étapes présentées à la varicosités présynaptique de -30 mV à +40 mV. Mesures de tension sont indiquées à côté de quelques-unes des traces présynaptiques. Le potentiel de maintien pour les deux cellules était de -70 mV.

Cette vidéo montre les procédures utilisées pour cultiver des cultures primaires d&#39;embryon de<em&gt; Xenopus</emNerf&gt; et les cellules musculaires et l&#39;utilité de cette préparation pour faire simultanées pré-et post-synaptique des enregistrements de patch-clamp.

Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerf-muscle co-cultures

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des cultures primaires de neurones spinaux et de cellules musculaires couplés synaptiquement à partir d'embryons de Xenopus. Cela est réalisé en premier lieu en induisant la reproduction chez Xenopus par injection d'hormone chorionique humaine et d'atropine dans les grenouilles mâles et femelles, puis en collectant les œufs fécondés. La deuxième étape consiste à retirer la couche gélatineuse ainsi que les téguments et membranes des embryons au stade 22.Ensuite, les neurones spinaux et les muscles sont isolés à partir des embryons et la peau est retirée et jetée. La dernière étape consiste à mettre en culture les cellules isolées dans des boîtes de culture et à permettre la formation de jonctions neuromusculaires fonctionnelles. En fin de compte, des connexions synaptiques fonctionnelles peuvent être démontrées par des enregistrements simultanés en paire à l’aide de la technique du patch clamp effectués sur les neurones et les cellules musculaires en culture.La beauté de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit une préparation synaptique vertébrée facilement accessible. Elle permet de surveiller la libération de neurotransmetteurs au moyen d'enregistrements électrophysiologiques postsynaptiques tout en mesurant simultanément la présence d'ions présynaptiques. En outre, les méthodes sont claires et simples, ne nécessitant aucun équipement particulier en dehors d'un microscope stéréoscopique, et les cultures peuvent ensuite être conservées à température ambiante dans un milieu de culture simple.Cette préparation peut être utile pour répondre à des questions essentielles dans le domaine de la physiologie synaptique, notamment la manière dont les événements pré-synaptiques, biochimiques et biophysiques sont couplés à la libération de neurotransmetteurs. En outre, elle est également utile pour l'étude de la neuromodulation, de la synaptogenèse et de la plasticité synaptique. Pour commencer cette procédure, préparez les solutions nécessaires conformément au manuscrit accompagnant. Ensuite, fabriquez au moins deux outils de microdissection en collant une épingle minuchin à l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre.Avec de la colle acrylique Sano, faites en sorte que l'extrémité pointue de l'épingle dépasse d'environ 0,5 centimètre de l'extrémité de la pipette. Deux jours avant la préparation des cultures, identifiez une paire de XUS prête à se reproduire en observant une griffe rougeâtre prononcée appelée aika chez la femelle et une pigmentation foncée sur la surface plane des pattes antérieures du mâle. Ensuite, attrapez chaque grenouille avec un filet et maintenez-la ventre vers le bas dans un évier à l'aide du filet, de manière à ce qu'elle puisse s'échapper.Injecter un millilitre de HCG à travers le filet et par voie sous-cutanée dans l'un des sacs lymphatiques dorsaux afin de s'assurer que les animaux n'écraseront pas les œufs nouvellement pondus et fécondés. Installer un plancher grillagé avec une maille d'un demi-pouce, fixé à une à deux pouces du fond du réservoir. Puis placer le couple reproducteur ensemble dans un réservoir de 10 gallons d'eau couvert.Laisser les grenouilles au repos pendant 12 à 48 heures, jusqu'à l'observation d'œufs fécondés au sol sous la grille. Ensuite, retirer les animaux du réservoir, mais laisser les œufs au repos pendant encore au moins 24 heures. Cette paire de grenouilles peut être réutilisée pour une nouvelle reproduction après six semaines.Ensuite, détacher les embryons du fond du récipient et les transférer vers quatre ou cinq boîtes de culture de 60 par 15 millimètres contenant du sérum physiologique à 10 %. Trier les embryons selon leur stade, en suivant le schéma de New &amp; Faber : les embryons lisses, présentant une coloration claire avec des modèles brun et blanc comme ceux situés à gauche, sont idéaux. En revanche, les embryons présentant de grandes taches noires ou blanches, comme ceux situés à droite, sont généralement peu viables et inutilisables.Dans une hotte à flux laminaire, étiquetez et remplissez à moitié environ 360 boîtes de culture stériles de 15 millimètres avec du sérum physiologique à 10 % et une avec du CMF. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile, transférez cinq à dix embryons au stade 22 à 24 dans l’une des boîtes contenant du sérum physiologique à 10 % ; sous un microscope stéréoscopique à zoom binoculaire à l’intérieur de la hotte, retirez la couche gélatineuse et la membrane veilleuse de chaque embryon à l’aide de deux paires de pinces stériles. Lavez les embryons nus en les faisant passer un par un à travers les deux boîtes restantes contenant du sérum physiologique à 10 %, puis enfin dans la boîte contenant le CMF.Ensuite, maintenez chaque embryon délicatement mais fermement à l’aide d’une pince et utilisez l’outil de microdissection pour retirer le tube neural et les myotomes associés, situés à l’aspect le plus dorsal de l’animal. Procédez en effectuant trois incisions : une à chaque extrémité de l’emplacement du tube neural et une troisième juste au-dessous, en position ventrale. Puis, déplacez chaque myotome avec le tube neural dissecté vers une zone propre de la boîte, à l’écart des granules de vitellus et des autres débris.Après environ 15 minutes dans le CMF, utilisez la pince pour soulever la peau pigmentée libre du tissu disséqué et jetez la peau. Après un délai supplémentaire de 30 à 60 minutes, les cellules formeront un tas en forme de dune de sable lorsqu'elles se dissocieront les unes des autres. Dans cette procédure, décongelez un tube de 10 millilitres de milieu de culture, puis ajoutez 70 microlitres d'ITS à 35 nanogrammes par millilitre, l'étiquette BDNF et remplissez à moitié environ les boîtes de culture stériles de 35 millimètres avec le milieu de culture L 15.Utilisez une boîte de culture pour chaque embryon que vous avez disséqué. Pour fabriquer une pipette de mise en culture, tenez les deux extrémités d'une pipette en verre Pasteur et placez la partie effilée au-dessus d'une flamme. Ensuite, écartez les extrémités sur environ 10 centimètres.Ensuite, casser l'extrémité pour obtenir une pointe d'environ 0,2 millimètre. Puis, utiliser la pipette de prélèvement pour aspirer le tas de sable à partir d'un embryon. Veiller à minimiser la quantité de solution aspirée.Ensuite, expulsez les cellules sur le fond d'une boîte de culture et ensemencez-les en plusieurs lignes. Laissez ensuite les boîtes contenant les cellules ensemencées au repos pendant au moins 15 minutes afin de permettre aux cellules de s'attacher à la boîte. Après 12 à 24 heures en culture, les cellules ensemencées développeront des caractéristiques morphologiques distinctes.Par exemple, les cellules musculaires prennent une forme fusiforme et les neurones spinaux développent de longs prolongements. Le contact synaptique fonctionnel entre les urates, les varicosités et les cellules musculaires peut être confirmé par des enregistrements électrophysiologiques simultanés par paires. Pour ce faire, préparez deux électrodes de patch pour l'enregistrement, une pour la varicosité présynaptique et une pour la cellule musculaire.Ensuite, remplissez l'électrode présynaptique avec une solution contenant de l'info terin et l'électrode postsynaptique avec une solution interne au potassium. Puis, remplacez le milieu dans la boîte de culture par du NFR. Transférez ensuite le dispositif sur un microscope inversé équipé d'optiques de contraste de phase, réalisez un patch sur la varicosité présynaptique à l'aide de l'électrode contenant de l'amphotéricine et sur la cellule musculaire postsynaptique avec l'autre électrode afin de confirmer la fonctionnalité de la synapse, dépolarisez la varicosité à l'aide d'un amplificateur de patch-clamp, puis observez les courants présynaptique et postsynaptique simultanés.Cette figure montre une vue à cinq fois le grossissement des cellules et de la culture immédiatement après la mise en place, et ceci est la même culture à 40 fois le grossissement. Voici la jonction neuromusculaire en culture, qui présente le soma neuronal, la terminaison présynaptique, la varicosité et la cellule musculaire postsynaptique. On observe ici les courants présynaptiques et postsynaptiques.En réponse à l'application d'impulsions de tension progressives de 10 millivolts, allant de moins 30 millivolts à plus 40 millivolts, appliquées à la varicosité présynaptique, le potentiel de maintien pour les deux cellules était de moins 70 millivolts. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures. Des cultures cellulaires viables peuvent ensuite être obtenues en aussi peu que 24 heures et peuvent être maintenues pendant plusieurs jours. Cette préparation est déjà utilisée depuis plusieurs années, contribuant à expliquer certaines des propriétés fondamentales de la transmission neuromusculaire.Nous espérons que cette vidéo permettra de poursuivre les découvertes en aidant les chercheurs à se familiariser davantage avec cette technique puissante et simple.

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