Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de Xenopus Nerf-muscle co-cultures

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des cultures primaires de neurones spinaux et de cellules musculaires couplés synaptiquement à partir d’embryons de xénope. Ceci est accompli en induisant d’abord la reproduction chez le xénope en injectant de la chorionique humaine dans l’atropine chez les grenouilles mâles et femelles et en recueillant des œufs fécondés. La deuxième étape consiste à retirer la couche de gelée, le fatel et les membranes des embryons de stade 22.

Ensuite, les neurones et les muscles de la colonne vertébrale sont isolés des embryons et la peau est retirée et jetée. La dernière étape consiste à plaquer les cellules isolées dans des boîtes de culture et à permettre la formation de jonctions neuromusculaires fonctionnelles. En fin de compte, des connexions synaptiques fonctionnelles peuvent être démontrées avec des enregistrements simultanés de patchclamps de neurones et de cellules musculaires en culture.

La beauté de cette technique est qu’elle permet d’obtenir une préparation synaptique de vertébrés facilement accessible. Il peut être utilisé pour surveiller la libération de neurotransmetteurs à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques postsynaptiques tout en mesurant simultanément l’occurrence des ions présynaptiques. De plus, les méthodes sont claires et simples, ne nécessitant aucun équipement spécial au-delà d’un microscope de dissection, et les cultures peuvent ensuite être stockées à température ambiante dans un milieu de culture simple.

Cette préparation peut être utile pour répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie synaptique, notamment comment les événements pré-synaptiques, biochimiques et biophysiques sont couplés à la libération de neurotransmetteurs. En outre, il est également utile pour l’étude de la synaptogenèse de neuromodulation et de la plasticité synaptique Pour commencer cette procédure, préparez les solutions requises selon le manuscrit ci-joint. Ensuite, fabriquez au moins deux outils de micro-dissection en collant une goupille de minucin à l’extrémité d’une pipette en verre.

Avec de la colle acrylique Sano, laissez l’extrémité pointue de la goupille dépasser l’extrémité de la pipette d’environ 0,5 centimètre. Deux jours avant de préparer les cultures, identifiez un couple de XUS prêt à la reproduction en observant une griffe rougeâtre proéminente aika sur la femelle et une pigmentation foncée sur la surface plane des pattes avant du mâle. Ensuite, élevez chaque grenouille dans un filet et maintenez-la face ventrale vers le bas dans un évier avec le filet afin qu’elle puisse s’échapper.

Injectez un millilitre d’HCG à travers le filet et par voie sous-cutanée dans l’un des sacs lymphatiques dorsaux pour vous assurer que les animaux ne piétineront pas les œufs nouvellement pondus et fécondés. Installez un plancher grillagé avec un maillage d’un demi-pouce installé sur un à deux pouces au fond du réservoir. Ensuite, placez le couple reproducteur ensemble dans un réservoir d’eau couvert de 10 gallons.

Laissez les grenouilles tranquilles pendant 12 à 48 heures jusqu’à ce que des œufs fécondés soient observés sur le sol sous l’écran. Retirez ensuite les animaux de l’aquarium, mais laissez les œufs intacts pendant au moins 24 heures de plus. Cette paire de grenouilles peut être reproduite après six semaines.

Ensuite, détachez les embryons du fond du réservoir et transférez-les dans quatre ou cinq boîtes de culture de 60 x 15 millimètres contenant 10 % de solution saline. Triez les embryons par stade selon le schéma des nouveaux embryons coupés et Faber qui ont un aspect lisse avec des modèles clairs, bruns et blancs comme ceux de gauche sont idéaux. D’autre part, les embryons qui ont de grandes taches noires ou blanches comme ceux de droite sont généralement malsains et inutilisables.

À l’intérieur d’une hotte à flux laminaire, étiquetez et remplissez environ la moitié de boîtes de culture stérile de 360 x 15 millimètres avec 10 % de solution saline et une avec du CMF. À l’aide d’une pipette en verre stérile, transférez cinq à 10 embryons au stade 22 à 24 dans l’une des boîtes contenant 10 % de solution saline avec les huit d’un microscope de dissection à zoom stéréo à l’intérieur du capot, retirez la couche de gelée et la membrane vielle de chaque embryon à l’aide de deux paires de pinces stériles. Lavez les embryons nus en les passant un à la fois dans les deux plats restants de solution saline à 10 %, et enfin dans le plat contenant du CMF.

Ensuite, tenez chaque embryon doucement mais fermement avec une paire de pinces et utilisez l’outil de micro-dissection pour retirer le tube neural et les myotomes associés, qui sont situés à l’aspect le plus dorsal de l’animal. Pour ce faire, faites trois tranches, une à chaque extrémité de l’emplacement du tube neural et une troisième juste ventrale à celui-ci. Déplacez ensuite chaque myotome de tube neural disséqué vers une partie propre de la boîte, à l’abri des granules de jaune d’œuf et d’autres débris.

Après environ 15 minutes dans CMF, utilisez la pince pour soulever la peau pigmentée pour la débarrasser du tissu disséqué et jeter la peau. Après 30 à 60 minutes supplémentaires, les cellules formeront un tas de sable au fur et à mesure qu’elles se dissocieront les unes des autres. Dans cette procédure, décongelez un tube de 10 millilitres de milieu de culture, puis à 70 microlitres d’ITS en 35 nanogrammes par millilitre, étiquetez le BDNF et remplissez les boîtes de culture stériles de 35 millimètres à moitié environ avec du milieu de culture L 15.

Utilisez une boîte de culture pour chaque embryon que vous avez disséqué. Pour fabriquer une pipette de placage, tenez les deux extrémités d’une pipette en verre et placez la partie effilée sur une flamme. Écartez ensuite les extrémités à environ 10 centimètres.

Cassez ensuite l’extrémité pour donner une pointe d’environ 0,2 millimètre. Ensuite, utilisez la pipette de placage pour aspirer le tas de sable d’un embryon. Veillez à minimiser la quantité de solution aspirée.

Ensuite, expulsez les cellules au fond d’une boîte de culture et disposez-les en plusieurs lignes. Laissez ensuite les boîtes des cellules plaquées intactes pendant au moins 15 minutes pour permettre aux cellules de se fixer à la boîte. Après 12 à 24 heures de culture, les cellules en plaques développeront des caractéristiques morphologiques distinctes.

Par exemple, les cellules musculaires prennent la forme d’un fuseau et les neurones spinaux développent de longs processus. Le contact synaptique fonctionnel entre l’urate, les varicosités et les cellules musculaires peut être confirmé par des enregistrements électrophysiologiques appariés simultanés. Pour ce faire, préparez deux électrodes patch pour l’enregistrement, une pour la varicosité présynaptique et une pour la cellule musculaire.

Remplissez ensuite l’électrode présynaptique avec une solution contenant de l’infotérine et l’électrode post-synaptique avec une solution interne de potassium. Après cela, remplacez le milieu dans la parabole de culture par NFR. Ensuite, transférez-le dans un microscope inversé équipé d’une optique de contraste facial, patchez la varicosité présynaptique avec l’électrode contenant l’amphotéricine et la cellule musculaire post-synaptique avec l’autre électrode pour confirmer la fonctionnalité de la synapse, dépolarisez la varicosité avec un amplificateur de patch clamp et observez les courants présynaptiques et postsynaptiques simultanés.

Cette figure montre une vue de puissance cinq fois des cellules et de la culture immédiatement après le placage, et il s’agit de la même culture à 40 fois. Voici la jonction neuromusculaire en culture, qui montre le soma neuronal, la cellule musculaire présynaptique, la varicosité et la cellule musculaire postsynaptique. On voit ici les courants présynaptiques et postsynaptiques.

En réponse à l’application de paliers de tension incrémentielle de 10 millivolts présentés à la varicosité présynaptique de moins 30 millivolts à plus 40 millivolts, le potentiel de maintien des deux cellules était de moins 70 millivolts Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en deux heures environ. Des cultures cellulaires viables peuvent alors être obtenues en 24 heures seulement et peuvent être conservées pendant plusieurs jours. Cette préparation est déjà utilisée depuis un certain nombre d’années, ce qui permet d’expliquer certaines des propriétés fondamentales de la transmission neuromusculaire.

Nous espérons que cette vidéo permettra de poursuivre les découvertes en aidant les chercheurs à se familiariser avec cette technique simple et puissante.