Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des cultures primaires de neurones spinaux et de cellules musculaires couplés synaptiquement à partir d'embryons de Xenopus. Cela est réalisé en premier lieu en induisant la reproduction chez Xenopus par injection d'hormone chorionique humaine et d'atropine dans les grenouilles mâles et femelles, puis en collectant les œufs fécondés. La deuxième étape consiste à retirer la couche gélatineuse ainsi que les téguments et membranes des embryons au stade 22.

Ensuite, les neurones spinaux et les muscles sont isolés à partir des embryons et la peau est retirée et jetée. La dernière étape consiste à mettre en culture les cellules isolées dans des boîtes de culture et à permettre la formation de jonctions neuromusculaires fonctionnelles. En fin de compte, des connexions synaptiques fonctionnelles peuvent être démontrées par des enregistrements simultanés en paire à l’aide de la technique du patch clamp effectués sur les neurones et les cellules musculaires en culture.

La beauté de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit une préparation synaptique vertébrée facilement accessible. Elle permet de surveiller la libération de neurotransmetteurs au moyen d'enregistrements électrophysiologiques postsynaptiques tout en mesurant simultanément la présence d'ions présynaptiques. En outre, les méthodes sont claires et simples, ne nécessitant aucun équipement particulier en dehors d'un microscope stéréoscopique, et les cultures peuvent ensuite être conservées à température ambiante dans un milieu de culture simple.

Cette préparation peut être utile pour répondre à des questions essentielles dans le domaine de la physiologie synaptique, notamment la manière dont les événements pré-synaptiques, biochimiques et biophysiques sont couplés à la libération de neurotransmetteurs. En outre, elle est également utile pour l'étude de la neuromodulation, de la synaptogenèse et de la plasticité synaptique. Pour commencer cette procédure, préparez les solutions nécessaires conformément au manuscrit accompagnant. Ensuite, fabriquez au moins deux outils de microdissection en collant une épingle minuchin à l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre.

Avec de la colle acrylique Sano, faites en sorte que l'extrémité pointue de l'épingle dépasse d'environ 0,5 centimètre de l'extrémité de la pipette. Deux jours avant la préparation des cultures, identifiez une paire de XUS prête à se reproduire en observant une griffe rougeâtre prononcée appelée aika chez la femelle et une pigmentation foncée sur la surface plane des pattes antérieures du mâle. Ensuite, attrapez chaque grenouille avec un filet et maintenez-la ventre vers le bas dans un évier à l'aide du filet, de manière à ce qu'elle puisse s'échapper.

Injecter un millilitre de HCG à travers le filet et par voie sous-cutanée dans l'un des sacs lymphatiques dorsaux afin de s'assurer que les animaux n'écraseront pas les œufs nouvellement pondus et fécondés. Installer un plancher grillagé avec une maille d'un demi-pouce, fixé à une à deux pouces du fond du réservoir. Puis placer le couple reproducteur ensemble dans un réservoir de 10 gallons d'eau couvert.

Laisser les grenouilles au repos pendant 12 à 48 heures, jusqu'à l'observation d'œufs fécondés au sol sous la grille. Ensuite, retirer les animaux du réservoir, mais laisser les œufs au repos pendant encore au moins 24 heures. Cette paire de grenouilles peut être réutilisée pour une nouvelle reproduction après six semaines.

Ensuite, détacher les embryons du fond du récipient et les transférer vers quatre ou cinq boîtes de culture de 60 par 15 millimètres contenant du sérum physiologique à 10 %. Trier les embryons selon leur stade, en suivant le schéma de New & Faber : les embryons lisses, présentant une coloration claire avec des modèles brun et blanc comme ceux situés à gauche, sont idéaux. En revanche, les embryons présentant de grandes taches noires ou blanches, comme ceux situés à droite, sont généralement peu viables et inutilisables.

Dans une hotte à flux laminaire, étiquetez et remplissez à moitié environ 360 boîtes de culture stériles de 15 millimètres avec du sérum physiologique à 10 % et une avec du CMF. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile, transférez cinq à dix embryons au stade 22 à 24 dans l’une des boîtes contenant du sérum physiologique à 10 % ; sous un microscope stéréoscopique à zoom binoculaire à l’intérieur de la hotte, retirez la couche gélatineuse et la membrane veilleuse de chaque embryon à l’aide de deux paires de pinces stériles. Lavez les embryons nus en les faisant passer un par un à travers les deux boîtes restantes contenant du sérum physiologique à 10 %, puis enfin dans la boîte contenant le CMF.

Ensuite, maintenez chaque embryon délicatement mais fermement à l’aide d’une pince et utilisez l’outil de microdissection pour retirer le tube neural et les myotomes associés, situés à l’aspect le plus dorsal de l’animal. Procédez en effectuant trois incisions : une à chaque extrémité de l’emplacement du tube neural et une troisième juste au-dessous, en position ventrale. Puis, déplacez chaque myotome avec le tube neural dissecté vers une zone propre de la boîte, à l’écart des granules de vitellus et des autres débris.

Après environ 15 minutes dans le CMF, utilisez la pince pour soulever la peau pigmentée libre du tissu disséqué et jetez la peau. Après un délai supplémentaire de 30 à 60 minutes, les cellules formeront un tas en forme de dune de sable lorsqu'elles se dissocieront les unes des autres. Dans cette procédure, décongelez un tube de 10 millilitres de milieu de culture, puis ajoutez 70 microlitres d'ITS à 35 nanogrammes par millilitre, l'étiquette BDNF et remplissez à moitié environ les boîtes de culture stériles de 35 millimètres avec le milieu de culture L 15.

Utilisez une boîte de culture pour chaque embryon que vous avez disséqué. Pour fabriquer une pipette de mise en culture, tenez les deux extrémités d'une pipette en verre Pasteur et placez la partie effilée au-dessus d'une flamme. Ensuite, écartez les extrémités sur environ 10 centimètres.

Ensuite, casser l'extrémité pour obtenir une pointe d'environ 0,2 millimètre. Puis, utiliser la pipette de prélèvement pour aspirer le tas de sable à partir d'un embryon. Veiller à minimiser la quantité de solution aspirée.

Ensuite, expulsez les cellules sur le fond d'une boîte de culture et ensemencez-les en plusieurs lignes. Laissez ensuite les boîtes contenant les cellules ensemencées au repos pendant au moins 15 minutes afin de permettre aux cellules de s'attacher à la boîte. Après 12 à 24 heures en culture, les cellules ensemencées développeront des caractéristiques morphologiques distinctes.

Par exemple, les cellules musculaires prennent une forme fusiforme et les neurones spinaux développent de longs prolongements. Le contact synaptique fonctionnel entre les urates, les varicosités et les cellules musculaires peut être confirmé par des enregistrements électrophysiologiques simultanés par paires. Pour ce faire, préparez deux électrodes de patch pour l'enregistrement, une pour la varicosité présynaptique et une pour la cellule musculaire.

Ensuite, remplissez l'électrode présynaptique avec une solution contenant de l'info terin et l'électrode postsynaptique avec une solution interne au potassium. Puis, remplacez le milieu dans la boîte de culture par du NFR. Transférez ensuite le dispositif sur un microscope inversé équipé d'optiques de contraste de phase, réalisez un patch sur la varicosité présynaptique à l'aide de l'électrode contenant de l'amphotéricine et sur la cellule musculaire postsynaptique avec l'autre électrode afin de confirmer la fonctionnalité de la synapse, dépolarisez la varicosité à l'aide d'un amplificateur de patch-clamp, puis observez les courants présynaptique et postsynaptique simultanés.

Cette figure montre une vue à cinq fois le grossissement des cellules et de la culture immédiatement après la mise en place, et ceci est la même culture à 40 fois le grossissement. Voici la jonction neuromusculaire en culture, qui présente le soma neuronal, la terminaison présynaptique, la varicosité et la cellule musculaire postsynaptique. On observe ici les courants présynaptiques et postsynaptiques.

En réponse à l'application d'impulsions de tension progressives de 10 millivolts, allant de moins 30 millivolts à plus 40 millivolts, appliquées à la varicosité présynaptique, le potentiel de maintien pour les deux cellules était de moins 70 millivolts. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures. Des cultures cellulaires viables peuvent ensuite être obtenues en aussi peu que 24 heures et peuvent être maintenues pendant plusieurs jours. Cette préparation est déjà utilisée depuis plusieurs années, contribuant à expliquer certaines des propriétés fondamentales de la transmission neuromusculaire.

Nous espérons que cette vidéo permettra de poursuivre les découvertes en aidant les chercheurs à se familiariser davantage avec cette technique puissante et simple.