Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

L’objectif général de cette procédure est de préparer un plan d’observation de l’hémisphère cérébral entier pour l’étude du développement cortical précoce. Ceci est accompli en récoltant d’abord des embryons de souris le 13e jour embryonnaire. Ensuite, injectez le mélange d’ADN plasmidique dans le ventricule cérébral et effectuez une électroporation ex utero.

Préparez ensuite un plan d’hémisphère entier à partir de l’embryon électroporé. La dernière étape consiste à fixer et à sectionner l’ensemble de l’hémisphère pour des analyses histologiques. En fin de compte, la conséquence d’une mutation ou d’une exposition à une toxine sur le développement des neurones corticaux peut être évaluée par les analyses immunohistologiques des neurones exprimant la GFP.

Je m’appelle Eric Olson. Je suis au département de neurosciences et de physiologie ici à l’Université médicale SUNY Upstate à Syracuse, et aujourd’hui, nous allons vous montrer une méthode que nous avons développée appelée l’ensemble de l’explan Hemisphere X. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’explan de tranche, est que l’explan de l’hémisphère X entier est simple à préparer et fournit deux jours de croissance organotypique.

La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du neurodéveloppement, telles que la façon dont une mutation ou une toxine particulière perturbe le développement cortical précoce. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car la préparation de l’ensemble de l’explan de l’hémisphère sans endommager les méninges peut nécessiter une certaine pratique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de dissection et de transfert explan sont difficiles à apprendre en raison de la sensibilité du tissu aux perturbations mécaniques.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Theresa Ozzi, postdoctorante dans mon laboratoire. Pour ce protocole, utilisez un kit disponible dans le commerce pour purifier les plasmides. Préparez l’ADN plasmidique à 0,33 milligramme par millilitre dans l’eau et ajoutez un colorant vert rapide comme traceur d’injection à environ 0,02 %Poids par volume Désinfectez toujours les outils chirurgicaux, l’espace de travail et le microscope.

Avec 70 % d’éthanol, il sacrifie un nombre requis de barrages suisses Webster sur l’E 13 par inhalation de dioxyde de carbone. Lorsque les embryons sont retirés, placez-les dans un plat de 10 centimètres avec du HBSS glacé dans le plat maintenu glacé. Disséquez soigneusement chaque embryon des membranes extra-embryonnaires environnantes.

Transférez maintenant chaque embryon individuellement dans une boîte propre avec HBSS glacé. À l’aide d’une seringue Hamilton, injectez deux à trois microlitres de l’ADN préparé dans le ventricule de l’hémisphère cérébral gauche. Ne pas injecter dans ou à proximité de la zone corticale destinée à une analyse future.

Pour électroporer l’ADN, tenez doucement l’embryon à l’aide d’une pince et placez légèrement la palette positive de l’électrode de la pince à épiler sur la ligne médiane dorsale de la tête. Placez légèrement la palette négative sous le menton de l’embryon. Exécutez un programme de cinq impulsions de 30 volts, de 50 millisecondes chacune à des intervalles d’une seconde à l’aide d’un modèle BTX 830 ou d’autres systèmes peuvent être réglés selon les instructions du fabricant.

Retournez chaque embryon dans le HBSS glacé et procédez à la préparation de l’Explan de tout l’hémisphère sous un microscope de dissection à l’aide de deux pinces de bijoutier numéro cinq. Retirez la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l’embryon. Glissement suivant de pinces sous le cerveau.

Pour retirer le cerveau intact du crâne, disséquez l’hémisphère électroporé, y compris le tissu du mésencéphale attaché. Attention à ne pas endommager les méninges recouvrant l’hémisphère cortical disséqué. Nous avons constaté que l’étape la plus difficile à maîtriser est la dissection et l’ablation de l’hémisphère de parade électrique sans endommager les méninges.

Une fois disséqué, transférez chaque hémisphère dans cinq millilitres de HBSS glacé à l’aide d’une pointe de pipette élargie d’un millilitre. Si nécessaire, les embryons peuvent être conservés dans des puits séparés d’une boîte de culture tissulaire de 12 puits. Ensuite, transférez doucement jusqu’à six hémisphères sur une culture enrobée de collagène de 24 millimètres.

Insérez et disposez le côté médial vers le bas. Remplissez maintenant un puits de 35 millimètres d’une parabole à six puits avec 2,7 millilitres de milieu supplémenté. Retirez tout excès de HBSS de l’insert et placez l’insert dans le puits avec la pipette de support, quelques gouttes du support du puits sur le dessus de chaque x explan.

N’augmentez pas le volume du support. Nous avons constaté qu’il est essentiel de placer quelques gouttes de milieu de culture sur l’explant X, de sorte que les explants X ne soient pas tout à fait complètement recouverts de milieu. Cela peut signifier ajouter jusqu’à 400 microlitres aux 2,7 mils de média au-dessus de l’explan x.

Déplacez le plat dans une chambre de rothenberg qui contient un bol d’eau humidifiant et qui a été infusé avec 95 % d’oxygène pendant au moins une minute. Fermez la chambre et débranchez le tube d’alimentation en gaz. Placez la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux jours, heure à laquelle le fractionnement préparatoire aura eu lieu.

En préparation. Faites des tampons pour intégrer l’explan. Préparez une solution de gélatine de peau de veau à 10 % à 60 degrés Celsius.

Une fois solubilisée, versez environ 10 millilitres de la solution dans un plat de 10 centimètres. Conservez le reste de la solution à 60 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Laissez les coussinets se solidifier une demi-heure si nécessaire.

Ils peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours, mais doivent être réchauffés à température ambiante avant utilisation. Le jour de la fixation dans une hotte, préparez la solution Pagano, fixateur et pagano sans fixateur. Réchauffez la solution de fixation à 37 degrés Celsius.

Récupérez les explants de l’incubateur sans déranger les tissus avec soin et rapidité. Retirez la majeure partie du support et remplacez-le par cinq millilitres de fixateur réchauffé. Assurez-vous que chaque explant est complètement immergé.

Fixez les mouchoirs pendant une heure à température ambiante. Retirez ensuite le fixateur et remplacez-le par la solution Pagano. Sans fixateur.

Ajoutez quelques gouttes d’azoture de sodium à 10 % dans chaque puits. Les mouchoirs peuvent maintenant être stockés à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient intégrés sur un tampon d’enrobage. Dessinez une grille au fond du plat à l’aide d’une règle.

Faites des carrés de deux à trois centimètres. Transférez les explants individuels sur le tampon d’enrobage. Évacuez toute solution résiduelle et couvrez chaque explan avec une solution chaude de gélatine à 10 %.

Laissez-le se solidifier. Une fois solidifié lentement, ajoutez plus de solution de gélatine jusqu’à ce que chaque explant soit complètement cerclé. Évitez de faire fondre le tampon, ce qui peut se produire si trop de gélatine est ajoutée à la fois.

Maintenant, laissez la gélatine durcir pendant environ une heure. Une fois durci, l’explan individuel peut être coupé en petits blocs de gélatine avant d’être sectionné. Il est important de poster réparer les blocs dans le fixateur Pagano pendant un jour ou deux.

Lors de la section. Positionnez les explants avec le bulbe olfactif vers le haut et sectionnez dans le plan coronal à 100 micromètres d’épaisseur. Recueillir les sections dans du PBS réfrigéré avec de l’azoture de sodium à 0,1 %.

Conservez les sections à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles puissent être colorées à l’aide de la technique décrite. Des explants de l’hémisphère entier ont été préparés à E 13 avant la séparation du prélate. Dans le néocortex dorsal.

Le tissu hébergeait un transgène qui signale des neurones immatures de la lignée corticale excitatrice. Des explants corticaux de la même portée ont été fixés séquentiellement sur une période de deux jours in vitro et traités pour une analyse histologique ultérieure. Au moment de l’analyse initiale, la division de la prepl zéro DIV n’a pas encore eu lieu dans le champ un par un.DIV.

La PC est devenue apparente et elle a continué à croître jusqu’à 2D IV. Ainsi, les explants de l’hémisphère entier, cultivés initialement en E 13, ont soutenu pendant deux jours la maturation du cortex cérébral et ont capturé la division prélate dans le néocortex dorsal pour confirmer le développement histologique normal dans le néocortex dorsal. protag, glycanes et composant de la matrice extracellulaire. Deux bandes d’immunoréactivité dans le cortex dorsal indiquaient une division appropriée du PPP en MZ et SP au cours de la période de culture in vitro.

Le PP a été divisé par les neurones corticaux L six exprimant CTIP deux et TBR R un. Le modèle d’immunocoloration de ces marqueurs confirme l’expression appropriée de ces facteurs de transcription dans le cp nouvellement formé. L’ensemble de ces analyses confirme le développement cortical précoce ORGANOTYPIQUE dans l’ensemble de l’hémisphère. En utilisant l’ensemble du protocole décrit, le ventricule gauche d’embryons E 13 intacts a été injecté.

L’expression de la GFP électroporée et traitée a pu être observée à partir de précurseurs neuronaux dans le vz. Alors que des cellules exprimant la GFP ont été observées dans l’IZ et le cp, il est important de noter que de nombreux neurones positifs à la GFP marqués par des pointes de flèche ont été observés au sommet de la CP en formation avec des dendrites et des axones émergents. La couche discrète à l’interface entre le CP et le MZ indique une migration, un arrêt et une lamination appropriés.

Les dendrites s’étendaient dans la MZ tandis que les axones du cortico ugal s’étendaient sous le CP et dans le iz. Sous. Les cellules différenciatrices étaient des cellules positives à la GFP à divers stades de maturité, y compris des neurones de morphologie bipolaire juxtaposés à des fibres radiogliales et en dessous des neurones multipolaires dans l’iz. Les dendrites se sont également étendues dans la MZ où la lecture de la protéine ECM est correctement immunolocalisée.

Ainsi, les conditions d’électroporation et d’explantation permettent un développement normal des neurones corticaux. Comme prévu, les neurones positifs à la GFP post-mitotique ont peuplé le cp en formation. Ainsi, le protocole peut cibler de manière fiable les neurones corticaux L six pour l’étude de leur migration et de leur maturation.

L’utilisation intensive de cette procédure a donné un taux de réussite de 79 %. 195 des 248 tentatives se sont avérées propices à l’imagerie et à l’analyse. La moitié des échecs provenaient d’un échec à exprimer la GFP ou d’une GFP ciblée manquée une fois masterisée.

Cette technique peut être réalisée en 90 minutes si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de pratiquer les dissections afin que les hémisphères électroporés puissent être cultivés avec des méninges intactes Suite à cette procédure. D’autres méthodes, comme la microscopie à intervalle de temps, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont les mutations d’intérêt perturbent la migration neuronale ou l’agénésie dendri.