Name: Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Découvrez l'électroporation ex utero et la préparation d'explants d'hémisphère cérébral chez la souris embryonnaire pour étudier le développement cortical précoce. Cette méthode permet d'évaluer les effets de mutations ou de toxines sur les neurones corticaux.

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Ce travail a été soutenu subventions du NINDS (NS066071) et le NIAAA. (P50AA017823) à NML. Les auteurs remercient le Dr Robert Quinn et le personnel du ministère des Ressources animales de laboratoire pour le soin des animaux. Nous remercions Judson Belmont pour le support technique, Nicole Belletier de l&#39;aide en tant que chercheur d&#39;été de premier cycle (SURF). Nous remercions également le Dr David Cameron pour les commentaires et les modifications sur une version antérieure du manuscrit.

1. Électroporations ex utero avec Expression Green Fluorescent Protein plasmide <ol><li> Plasmide solutions d&#39;injection d&#39;ADN sont préparés avec CAG-eGFP ADN 27 dilué à la concentration de travail finale de 0,33 mg / ml dans ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sont utilisés pour purifier le plasmide à partir de bactéries transformées. Rapide colorant vert à ~ 0,02% (p / v final) est ajouté à la solution d&#39;ADN en tant que traceur injection. </li><li> Pour préparer la zone chirurgicale, arroser paillasse et le stade microscope à dissection avec une solution d&#39;éthanol à 70% et essuyez-le. Vaporiser ciseaux chirurgicaux et des pinces d&#39;éthanol à 70% avant la dissection et essuyez-le. </li><li> Timed enceintes suisses / Webster barrages sont sacrifiés sur E13 par transfert dans une chambre remplie de CO 2 d&#39;un cylindre pressurisé et le barrage est surveillé jusqu&#39;à ce que tout mouvement a cessé pendant au moins 1 min. Après sacrifice par inhalation de CO 2 les embryons sont retirés de l&#39;utérus et mis enune boîte de Pétri de 10 cm de glace contenant Hanks froide solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> Disséquer soigneusement chaque embryon à partir des membranes extra-embryonnaires environnantes et garder à l&#39;glacées HBSS. </li><li> Transférer chaque embryon individuellement à un deuxième plat de 10 cm de Petri contenant HBSS froid. Utiliser une seringue pour injecter Hamilton 2-3 pl de l&#39;ADN mélange vert rapide dans le ventricule de l&#39;hémisphère cérébral gauche, en prenant soin d&#39;injecter dans une zone corticale spatialement séparée de la zone corticale pour une analyse ultérieure. </li><li> Pour électroporation, maintenez l&#39;embryon délicatement avec une pince et placez la pagaie légère positive de l&#39;électrode pince sur la ligne médiane dorsale de la tête et légèrement négative placez la pagaie sous le menton embryon. Électroporations sont atteints avec un électroporateur BTX830 programmé pour livrer cinq 30 impulsions V de 50 ms de durée, séparées par des intervalles ms 950. Ces réglages sont pour le modèle BTX830. D&#39;autres systèmes peuvent être utilisés selon les instructio fabricantns. </li></ol> 2. Préparation des explants hémisphère entier <ol><li> Après électroporation les embryons sont replacés dans glacées HBSS. Le cerveau est prélevé au moyen de deux pinces de bijoutier n ° 5 pour enlever la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l&#39;embryon. Une pince est ensuite glissé sous le cerveau pour retirer le cerveau intact du crâne. L&#39;hémisphère électroporation (à gauche) est ensuite disséqué loin du cerveau et attaché mi-tissu cérébral est retiré. Tout au long de la prise en charge technique de dissection est prise de ne pas endommager les méninges recouvrant l&#39;hémisphère gauche corticale. </li><li> Une fois disséqué chaque embryon est transféré dans HBSS l&#39;aide d&#39;une pipette avec une pointe de coupe 1 ml pipette. L&#39;hémisphère est ensuite expulsé doucement sur un insert de culture revêtus de collagène. Jusqu&#39;à six explants hémisphère sont disposés côté médial vers le bas sur chaque insert de 24 mm. Une fois disposées, HBSS en excès est éliminé de l&#39;insert et l&#39;insert est ensuite placé dans une 35 mm et d&#39;une boîte à 6 puits. Le bien contient exacte 2,7 ml de médias: DMEM-F12 supports contenant Glutamax et additionné de 2% B-27, 1% et 1% G5 pénicilline-Strep. Quelques gouttes des médias du puits peut être introduit à la pipette au-dessus de chaque explant, mais ne pas ajouter des médias au-delà de l&#39;original 2,7 ml par puits. </li><li> Une fois les explants ont été placés sur des filtres de collagène le plat à 6 puits contenant les explants sont placés dans un Billups Rothenberg (BR) chambre (qui contient également un plat d&#39;humidification de l&#39;eau). A 95% / 5% d&#39;oxygène / CO 2 du mélange gazeux est injecté dans la chambre pendant au moins 1 min avant de sceller la chambre fermée et la déconnexion 95% / 5% d&#39;oxygène / CO 2 du tube d&#39;alimentation en gaz. La chambre de BR est ensuite placé dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pour le reste de la période de culture, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fixation des tissus explantation pour histologie <ol><li> Dans une hotte préparer la solution de fixation Pagano en commençant par solubilisation 8 g de paraformaldéhyde dans 100 ml d&#39;préchauffé (~ 80 &amp; deg, C) ddH 2 O. Ajouter 1-3 gouttes de NaOH concentrée pour favoriser la solubilisation et remuer doucement. Une fois solubilisé mélanger la solution de paraformaldéhyde 8% de 1:1 avec une solution qui est de 500 mM de saccharose, Hepes 100 mM, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl pour une concentration finale de paraformaldéhyde 4% de saccharose dans 250 Hepes mm 50 mm , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Pour fixer les explants réchauffer la solution fix Pagano à 37 ° C. Supprimer rapidement la plupart des DMEM/F12 médias de chaque puits de culture et ajoutez 5 ml de Fix Pagano dans chaque puits d&#39;explants. Assurez-vous de couvrir chaque explant complètement en solution. Fixer pendant 1 heure à température ambiante. Ne retirez pas explants de filtre avant 1 h de fixation. </li><li> Après fixation éliminer la solution de correction Pagano et la remplacer par une solution Pagano sans correction (250 mM HEPES 50 mM de saccharose, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Ajouter quelques gouttes d&#39;azoture de sodium à 10% et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à incorporer. </li></ol> 4. Intégration et Sectioning pour histologie <ol><li> Préparer une solution de veau à 10% la gélatine de peau en solubilisant 10 g de gélatine de peau de veau dans 100 ml d&#39;eau tiède (55-60 ° C). Placez une solution de gélatine sur une plaque chauffante réglée à 60 ° C et agiter périodiquement jusqu&#39;à solubilisé. </li><li> Verser environ 10 ml de la solution de gélatine à 10% dans le fond d&#39;une boîte de Petri de 10 cm et 30 min permettre de se solidifier. Cela formera un &quot;pad&quot; pour l&#39;intégration des explants. Ces tampons peuvent être des jours préparés à l&#39;avance et stocké à 4 ° C. Utilisez une règle pour tracer une grille sur le fond de la boîte de Pétri et le transfert des explants individuels dans chaque case de la grille. Enlever les résidus solution Pagano et à l&#39;aide d&#39;une pipette, couvrir chaque explant avec une solution de gélatine chaude 10% et laisser se solidifier. Reprendre l&#39;addition lente d&#39;une solution de gélatine jusqu&#39;à ce que chaque explant est complètement entourée par la gélatine, en prenant soin de ne pas faire fondre le tampon par addition de trop chauffer la gélatine à la fois. Permettre la gélatine à durcir pendant ~ 1 heure. Une fois durci le particulierexplants UAL peut être découpée en petits blocs de gélatine. Les blocs sont ensuite post-fixée dans Pagano fixer pendant 24-48 heures avant la coupe avec un vibratome. </li><li> Explants dans les blocs de gélatine sont positionnés bulbe olfactif et en coupe dans le plan frontal à 100 pm d&#39;épaisseur. Les coupes sont recueillies et stockées dans du PBS + 0,1% d&#39;azoture de sodium à 4 ° C jusqu&#39;à leur traitement immunohistochimique. </li><li> Détection immunohistochimique est réalisée par le transfert de sections dans une plaque à 24 puits (2-3 sections par puits). Premier bloc non spécifique de liaison d&#39;anticorps en ajoutant 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 et 2% de BSA) à chaque puits, incuber 1 h sous agitation douce. L&#39;anticorps primaire appropriée est ensuite dilué dans du PBST + B et de 0,4 ml par puits est ajouté pour une nuit d&#39;incubation à température ambiante. Le premier est lavé avec du PBS 3X lave pendant au moins 10 minutes chacune. L&#39;anticorps secondaire et 2 pg / ml Hoechst 33342 colorant nucléaire sont ensuite diluées dans du PBST + B et les échantillons sont incubés pendant 2 heures à la température ambianteen agitant doucement. Trois lavages PBS (10 min chacun) sont effectués, puis les coupes sont montées sur des lames à l&#39;aide de 90% de glycérol Tris 50 mM, pH 7,4, milieu de montage. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Nous avons amélioré et évalué un modèle expérimental - explants hémisphère entiers - pour l&#39;étude du développement cortical précoce (E13-E15). Le modèle s&#39;est révélé utile pour l&#39;analyse de la migration et de la différenciation de la lignée neurone excitateur qui constitue la couche 6 du cortex cérébral 25,37. Les principaux avantages du système sont: 1) la croissance organotypique pour 2 DIV, 2) la simplicité de préparation, et 3) l&#39;accès expérimental aux neurones pour l&#39;électroporation, ...

Les formes de mammifères cortex cérébral à travers la prolifération, la migration concertée et la différenciation des neurones générés successivement. Chaque neurone est né dans la zone ventriculaire (VZ) et migre du VZ dans la zone intermédiaire (IZ), la formation de la plaque corticale (CP) 1. Lors de leur passage à travers les différents domaines corticaux, les neurones migrent afficher de multiples modes de migration 2,3 qui dépendent de l&#39;environnement extracellulaire et d&#39;autres éléments cellulaires (par exemple, la glie radiale) dans le tissu développement. Les neurones corticaux puis arrêter la migration en haut de la plaque de formage corticale dans les processus d&#39;arrêt coïncidant migration neuronale et 4 dendritogénèse. Développement cortical est initiée entre embryonnaires jours 11-13 (E11-13) 5 à travers la couche de mise en place primordiale plexiforme 6 ou preplate (PP), une couche de neurones pionniers qui recouvre le VZ. Éventuelcouche 6 neurones corticaux (c&#39;est à dire les premiers neurones corticaux nés dans le VZ) puis orienter leur corps cellulaire dans un modèle stéréotypé et se fondre en une couche distincte au sein du PP 7. Ces événements diviser le preplate dans une superficielle marginale (future couche corticale 1) et une zone de profondeur, ce dernier composé de cellules sous-plaque (transitoire couche corticale 7). Ce processus, appelé le fractionnement preplate, est un événement fondamental dans la croissance future du cortex cérébral 8. De nombreuses mutations génétiques ont été identifiés qui perturbent les différents aspects du développement cortical 9. Développement cortical peut également être affectée négativement par l&#39;exposition à des toxines ingérées telles que la cocaïne et l&#39;alcool 10 11. Parce que des malformations corticales qui se posent au cours du développement sont probablement contribué à des troubles neurologiques (autisme, par exemple, la schizophrénie), les enquêtes empiriques de perturbations du développement cortical sont inhérentesment important. Il est donc d&#39;une importance considérable pour établir des approches pour étudier le développement cortical qui permet des tests rapides d&#39;effets génétiques ou de la toxine mais aussi de préserver les interactions possibles entre les neurones de différenciation, d&#39;autres types cellulaires et la matrice extracellulaire (ECM) au cours de cette première période de 12 le développement du cerveau . Explants tranche 13 ont fourni un tel système et ont été largement utilisés pour analyser neurone développement cortical 14-16. Toutefois, les essais de tranche peuvent souffrir de l&#39;inconvénient que la migration neuronale et de stratification peut être anormale 17 probablement en raison de dommages aux cellules méningées qui entourent le cerveau en développement et l&#39;ancrage du gliales radiales échafaud. Comme radiales fibres gliales sont un substrat important pour la migration des neurones corticaux 18 rupture de la membrane basale par tranchage peut perturber localement radiale l&#39;architecture des cellules gliales et conduire à la migration corticale altérée. En outre, le sliced surfaces d&#39;explants fournit une région de cellules mortes qui peuvent modifier la composition normale de l&#39;ECM dans ces domaines. Des approches plus récentes ont concentré leur analyse sur les cellules situées au fond de la tranche qui sont entourés par des types de cellules appropriées sains et ECM. Toutefois, dans certains cas, ces nouvelles approches peuvent exiger que l&#39;original tranche épaisse culture cryo-être sectionné ou de la paraffine après fixation de section afin que l&#39;intérieur relativement normal de la tranche est mis à disposition pour l&#39;analyse de 19-21. À la fois l&#39;origine vibratome sectionnement pour préparer les tranches en direct pour la culture, ainsi que la découpe au cryostat ultérieur de tranches fixes pour l&#39;analyse nécessitent des soins et de l&#39;effort de ces dosages à travailler. Pour assurer une approche simple et complémentaires pour les études du développement cortical début, nous avons modifié l&#39;approche d&#39;une tranche existante de 13 à faciliter les études du développement cortical précoce. Nous avons développé un whmodèle ole explant hémisphère semblable à un modèle existant E14 hémisphère qui a impliqué cultures secousses à 65 rotations par minute et permet la croissance organotypique pour 16-18 heures 22,23. Dans notre approche, les explants hémisphère entières sont placées sur membrane semi-perméable 13 avec la culture, dans une atmosphère d&#39;oxygène à haute 21,24 organotypique de prolonger la croissance corticale pendant 48 heures. Cette approche permet également d&#39;électroporation cohérente de développement des neurones corticaux. Les embryons sont retirés de l&#39;utérus et une électroporation pour introduire l&#39;ADN plasmidique et le télencéphale est ensuite découpé. Chaque hémisphère est isolé et placé côté médial vers le bas sur un filtre revêtu de collagène. L&#39;explant est ensuite mis en culture pour une période de 48 heures, une période qui englobe 8 fractionnement preplate. Au cours de la période de culture, les neurones L6 développer à partir de précurseur de neurone différencié 25, correctement positionnée à l&#39;intérieur de la plaque corticale. Tout au long de cette période, le développement deneurone est entouré par l&#39;ECM approprié et des types de cellules qui face la cellule correspondant in vivo. Ce système a déjà avéré utile pour déchiffrer les événements cellulaires qui sous-tendent toxicité de l&#39;éthanol 26, couche 6 formation et diviser preplate 7,25.

<table><tbody><tr><td><Réactif>s forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Supplément 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Sans Sérum Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Stylo / Strep Liquide 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Insert de culture enrobé de collagène </td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau bovine </td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211 ; chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 Électroporateur</td><td>Harvard Appareil</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler électrodes 10mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton seringue (5uL)</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton aiguille seringue</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>Spécifiez 1" et style 4</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins Tough Cut 9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero électroporation et explants hémisphère: une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Développement cortical implique des interactions complexes entre les neurones et les non-neuronales, y compris des éléments précurseurs de cellules, des vaisseaux sanguins, les méninges et associé matrice extracellulaire. Parce qu&#39;ils fournissent un environnement propice organotypique, les explants tranches corticales sont souvent utilisées pour étudier ces interactions qui contrôlent la différenciation neuronale et le développement. Bien que bénéfiques, le modèle d&#39;explant tranche peuvent souffrir d&#39;inconvénients, y compris stratification cellulaire aberrante et la migration. Nous rapportons ici l&#39;ensemble du système cérébral explant hémisphère pour les études du développement cortical précoce qui est plus facile à préparer que les tranches de cortex et spectacles cohérente de migration organotypique et le laminage. Dans ce système modèle, la stratification précoce et les schémas de migration se dérouler normalement pour une période de deux jours in vitro, y compris la période de séparation preplate, au cours de laquelle prospective couche corticale six formes. Nous avons ensuite développé une électroporation ex utero (EUEP)approche qui connaît un succès ~ 80% dans le ciblage expression de la GFP pour les neurones en développement dans le cortex dorsal médial. Le modèle hémisphère explant rend développement précoce corticale accessibles pour l&#39;électroporation, une intervention pharmacologique et des approches d&#39;imagerie en direct. Cette méthode permet d&#39;éviter la chirurgie de survie nécessaire d&#39;électroporation in utero (IUEP) des approches tout en améliorant à la fois la transfection et la cohérence de surface de ciblage. Cette méthode facilitera les études expérimentales de la prolifération, la migration neuronale et de la différenciation.

Le rongeur embryonnaire cortex présente un gradient de neurogénétique transversale tout au long de la période de développement, tels que le néocortex latéral est d&#39;environ 1 jour plus mature que dorsale médiale néocortex 28. Le nombre de neurones couche 6 est ainsi généré (c&#39;est à dire présenter leur dernière phase S) sur E12 dans le cortex latéral (également appelé champ 40 5) et à E13 dans le cortex médial dorsale (également appelé champ 1 5). Fractionnement Preplate c...

Ce protocole décrit une procédure d&#39;explantation amélioré qui implique<em&gt; Ex utero</em&gt; Électroporation, la dissection et la culture de tout hémisphères cérébraux de l&#39;embryon de souris. La préparation facilite les études pharmacologiques et des essais de la fonction des gènes au cours du développement cortical précoce.

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des hémisphères cérébraux entiers en culture pour l'étude du développement cortical précoce. Cette opération s'effectue tout d'abord en prélevant des embryons de souris au jour embryonnaire 13. Ensuite, injecter le mélange d'ADN plasmidique dans le ventricule cérébral et réaliser une électroporation ex utero.Ensuite, préparez une explante de l'hémisphère entier à partir de l'embryon électroporé. La dernière étape consiste à fixer et sectionner l'explant complet de l'hémisphère pour des analyses histologiques. Enfin, les conséquences d'une mutation ou d'une exposition à une toxine sur le développement des neurones corticaux peuvent être évaluées par des analyses immunohistologiques des neurones exprimant la GFP.Je m'appelle Eric Olson. Je travaille au Département des neurosciences et de physiologie de l'Université médicale de l'État de New York à Syracuse, et aujourd'hui nous allons vous présenter une méthode que nous avons développée appelée l'explan hémisphérique complet. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'explan de tranches est que les explants hémisphériques complets sont simples à préparer et permettent une croissance organotypique de deux jours.La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, comme la manière dont une mutation ou un toxique particulier perturbe le développement cortical précoce. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la préparation de l'hémisphère entier en explant sans endommager les méninges peut nécessiter un certain entraînement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissection et de transfert de l'explant sont difficiles à apprendre en raison de la sensibilité du tissu aux perturbations mécaniques.La procédure sera démontrée par le Dr Theresa Ozzi, une postdoctorante dans mon laboratoire. Pour ce protocole, utilisez un kit disponible commercialement afin de purifier les plasmides. Préparez l'ADN plasmidique à 0,33 milligramme par millilitre dans de l'eau et ajoutez un colorant bleu rapide comme traceur d'injection à environ 0,02 % poids par volume. Désinfectez toujours les outils chirurgicaux, l'espace de travail et le microscope.Avec de l'éthanol à 70 %, sacrifier un nombre requis de souris Swiss Webster à J 13 par inhalation de dioxyde de carbone. Une fois les embryons extraits, les placer dans une boîte de 10 centimètres contenant du HBSS froid sur glace, maintenue au froid. Dissecter soigneusement chaque embryon des membranes extra-embryonnaires environnantes.Transférez maintenant chaque embryon individuellement dans une boîte de Pétri propre contenant du HBSS glacé. À l’aide d’une seringue Hamilton, injectez deux à trois microlitres de l’ADN préparé dans le ventricule de l’hémisphère cérébral gauche. N’effectuez pas d’injection dans la zone corticale destinée à l’analyse ultérieure ni à proximité de celle-ci.Pour électroporer l'ADN, maintenez l'embryon délicatement avec une pince et placez légèrement la palette positive de l'électrode en pince sur la ligne médiane dorsale de la tête. Placez légèrement la palette négative sous le menton de l'embryon. Exécutez un programme de cinq impulsions de 30 volts, chacune de 50 millisecondes, à des intervalles d'une seconde, à l'aide d'un modèle BTX 830 ou d'autres systèmes pouvant être réglés selon les instructions du fabricant.Replacer chaque embryon dans le HBSS glacé et poursuivre la préparation de l'hémisphère entier en utilisant deux pincettes de bijoutier n°5 sous microscope de dissection. Retirer la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l'embryon. Glisser ensuite les pincettes sous le cerveau.Pour extraire le cerveau intact du crâne, disséquez l'hémisphère électroporé, y compris le tissu du mésencéphale qui y est attaché. Veillez à ne pas endommager les méninges recouvrant l'hémisphère cortical disséqué. Nous avons constaté que l'étape la plus difficile à maîtriser consiste à disséquer et retirer l'hémisphère électroporé sans endommager les méninges.Une fois disséqués, transférez chaque hémisphère dans cinq millilitres de HBSS glacé à l’aide d’une pipette dont l’embout d’un millilitre a été élargi. Si nécessaire, les embryons peuvent être conservés dans des puits séparés d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Ensuite, transférez délicatement jusqu’à six hémisphères sur une culture de 24 millimètres revêtue de collagène.Insérez et positionnez-le avec le côté médial vers le bas. Remplissez maintenant une cavité de 35 millimètres d'une plaque à six puits avec 2,7 millilitres de milieu supplémenté. Éliminez tout excès de HBSS de l'insert et placez l'insert dans la cavité ; à l’aide d’une pipette, ajoutez quelques gouttes du milieu provenant du puits sur la face supérieure de chaque x explan.Ne pas augmenter le volume du milieu. Nous avons constaté qu'il est essentiel de déposer quelques gouttes de milieu de culture sur l'explant X, de sorte que les explants X ne soient pas complètement recouverts de milieu. Cela peut impliquer d'ajouter jusqu'à 400 microlitres aux 2,7 mils de milieu situés au-dessus de l'explant X.Déplacer la boîte dans une chambre Billups-Rothenberg contenant une coupelle d'eau humidifiante et ayant été imprégnée d'oxygène à 95 % pendant au moins une minute. Fermer hermétiquement la chambre et déconnecter le tube d'approvisionnement en gaz. Placer la chambre dans un incubateur à 37 °C pendant deux jours, délai au terme duquel la division des prépl sera intervenue.En préparation. Préparer des tampons pour l'incorporation de l'explants. Préparer une solution de gélatine de peau de veau à 10 % à 60 degrés Celsius.Une fois solubilisé, verser environ 10 millilitres de la solution dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Conserver le reste de la solution à 60 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Laisser les supports durcir pendant une demi-heure, si nécessaire.Ils peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours, mais doivent être réchauffés à température ambiante avant utilisation. Le jour de la fixation, en hotte, préparez la solution de Pagano avec fixateur et la solution de Pagano sans fixateur. Réchauffez la solution de fixation à 37 degrés Celsius.Retirez les explants de l'incubateur sans perturber soigneusement et rapidement les tissus. Éliminez la majeure partie du milieu et remplacez-le par cinq millilitres de fixateur préchauffé. Assurez-vous que chaque explant est complètement immergé.Fixer les tissus pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirer le fixateur et le remplacer par la solution de Pagano. Sans fixateur.Ajouter quelques gouttes d'azoture de sodium à 10 % dans chaque puits. Les tissus peuvent désormais être conservés à quatre degrés Celsius jusqu'à leur inclusion sur un coussin d'inclusion. Tracer une grille sur le fond de la boîte à l'aide d'une règle.Préparer des carrés de deux à trois centimètres. Transférer les explants individuels sur le coussin d'encrage. Aspirer toute solution résiduelle et recouvrir chaque explant d'une solution chaude de gélatine à 10 %.Laisser durcir. Une fois que la prise est effectuée lentement, ajouter progressivement plus de solution de gélatine jusqu'à ce que chaque explant soit entièrement entouré. Éviter de faire fondre le coussin, ce qui peut se produire si trop de gélatine est ajoutée d'un seul coup.À présent, laissez durcir la gélatine pendant environ une heure. Une fois durcie, l'explant individuel peut être découpé en petits blocs de gélatine avant d'être sectionné. Il est important de fixer les blocs dans le fixateur de Pagano pendant un jour ou deux.Lors de la coupe, positionner les explants avec le bulbe olfactif vers le haut et réaliser des coupes dans le plan coronal avec une épaisseur de 100 micromètres. Ramasser les sections dans du PBS refroidi contenant 0,1 % d'azoture de sodium.Conserver les sections à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles puissent être colorées à l'aide de la technique décrite. Des explants entiers d'hémisphère ont été préparés au stade E 13 avant la séparation préliminaire. Dans le néocortex dorsal.Le tissu contenait un transgène qui marque les neurones immatures de la lignée corticale excitatrice. Des explants corticaux provenant de la même portée ont été fixés goutte à goutte de manière séquentielle sur une période de deux jours in vitro et préparés pour une analyse histologique ultérieure. Au moment initial d'analyse, soit le jour in vitro zéro (DIV 0), la division prémitotique n'avait pas encore eu lieu dans le champ, un par un, DIV.Les CP deviennent apparents et continuent de croître jusqu'au 2D IV. Ainsi, les explants hémisphériques entiers cultivés initialement à E 13 ont permis pendant deux jours la maturation du cortex cérébral et ont permis d'observer la scission précoce dans le néocortex dorsal afin de confirmer un développement histologique normal dans cette région. Les explants de 2D IV ont été soumis à une immunomarquage pour le sulfate de chondroïtine, les protéoglycanes et les composants de la matrice extracellulaire. Deux bandes d'immunoréactivité dans le cortex dorsal indiquaient une scission adéquate du PPP en zone marginale (MZ) et couche sous-plaquaire (SP) durant la période de culture in vitro.Le PP a été divisé par six neurones corticaux exprimant CTIP deux et TBR R un. Le motif d'immunomarquage de ces marqueurs confirme l'expression appropriée de ces facteurs de transcription dans le cp nouvellement formé. Ensemble, ces analyses confirment un développement cortical précoce d'origine organotypique dans l'hémisphère entier en utilisant l'ensemble du protocole décrit ; le ventricule gauche d'embryons E 13 intacts a été injecté.Une expression de GFP électroporée et traitée pouvait être observée à partir des précurseurs neuronaux dans la zone ventriculaire. Alors que des cellules exprimant fortement GFP étaient observées dans la zone intermédiaire et le cortex pallial, des neurones nombreux exprimant GFP, marqués par des flèches, ont été observés de manière importante au sommet du cortex pallial en formation, avec des dendrites et des axones émergents. La couche discrète située à l'interface entre le cortex pallial et la zone moléculaire indique une migration, une arrestation et une laminage appropriés.Les dendrites s'étendaient dans la zone moléculaire (MZ), tandis que les axones cortico-ugaux s'étendaient sous la couche plexiforme (CP) et dans la zone intermédiaire (iz). Les cellules en cours de différenciation étaient des cellules GFP positives à divers stades de maturité, incluant des neurones de morphologie bipolaire adjacents aux fibres gliales radiaires, ainsi que, en dessous, des neurones multipolaires présents dans la zone intermédiaire (iz). Les dendrites s'étendaient également dans la zone moléculaire (MZ), où la protéine matricielle extracellulaire réidine est correctement localisée par immunomarquage.Ainsi, les conditions d'électroporation et d'explant permettent un développement normal des neurones corticaux. Comme prévu, les neurones post-mitotiques positifs pour la GFP ont colonisé le cp en formation. Par conséquent, ce protocole peut cibler de manière fiable les neurones corticaux de couche six pour l'étude de leur migration et de leur maturation.Une utilisation extensive de cette procédure a permis d'obtenir un taux de réussite de 79 %. 195 tentatives sur 248 se sont révélées appropriées pour l'imagerie et l'analyse. La moitié des échecs sont attribuables à une absence d'expression de la GFP ou à une ciblage manqué de la GFP. Une fois maîtrisée,Cette technique peut être réalisée en 90 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de s'entraîner aux dissections afin que les hémisphères électroporés puissent être cultivés avec des méninges intactes après cette procédure. D'autres méthodes, comme la microscopie en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont les mutations d'intérêt perturbent la migration neuronale ou l'agenèse dendritique.

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En injection intraventriculaire Utero et l&#39;électroporation d&#39;embryons de souris E15

Électroporation in utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou in vitro des effets de l'altération génétique.

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Cet article décrit en détail un protocole d'électroporation in utero du cortex cérébral et l'hippocampe à E14.5 chez la souris. Nous montrons aussi que cette méthode est précieuse pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales.

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Nous présentons ici un protocole fournissant un outil pour examiner les mécanismes de régulation de gènes spécifiques au cours du développement de l’hippocampe. L’utilisation de l’électroporation ex utero et de la culture de coupes organotypiques permet la régulation à la hausse et à la baisse de l’expression des gènes d’intérêt dans les cellules individuelles et suit leur destin au cours du développement.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

Ce protocole décrit en détail comment transfecter spécifiquement différentes régions du système nerveux central C57BL/6 via électroporation in utero. Ce protocole comprend des instructions détaillées pour les transfections de régions qui se développent dans le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le noyau septal latéral et le striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

L’électroporation double in utero permet de cibler les populations cellulaires qui sont séparées spatialement et temporellement. Cette technique est utile pour visualiser les interactions entre ces populations cellulaires à l’aide de protéines fluorescentes dans des conditions normales, mais aussi après des expériences fonctionnelles pour perturber les gènes d’intérêt.

Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

Découvrez l'électroporation ex utero et la préparation d'explants d'hémisphère cérébral chez la souris embryonnaire pour étudier le développement cortical précoce. Cette méthode permet d'évaluer les effets de mutations ou de toxines sur les neurones corticaux.

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce (Vidéo) | JoVE Journal

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

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