Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

L'objectif général de cette procédure est de préparer des hémisphères cérébraux entiers en culture pour l'étude du développement cortical précoce. Cette opération s'effectue tout d'abord en prélevant des embryons de souris au jour embryonnaire 13. Ensuite, injecter le mélange d'ADN plasmidique dans le ventricule cérébral et réaliser une électroporation ex utero.

Ensuite, préparez une explante de l'hémisphère entier à partir de l'embryon électroporé. La dernière étape consiste à fixer et sectionner l'explant complet de l'hémisphère pour des analyses histologiques. Enfin, les conséquences d'une mutation ou d'une exposition à une toxine sur le développement des neurones corticaux peuvent être évaluées par des analyses immunohistologiques des neurones exprimant la GFP.

Je m'appelle Eric Olson. Je travaille au Département des neurosciences et de physiologie de l'Université médicale de l'État de New York à Syracuse, et aujourd'hui nous allons vous présenter une méthode que nous avons développée appelée l'explan hémisphérique complet. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'explan de tranches est que les explants hémisphériques complets sont simples à préparer et permettent une croissance organotypique de deux jours.

La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, comme la manière dont une mutation ou un toxique particulier perturbe le développement cortical précoce. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la préparation de l'hémisphère entier en explant sans endommager les méninges peut nécessiter un certain entraînement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissection et de transfert de l'explant sont difficiles à apprendre en raison de la sensibilité du tissu aux perturbations mécaniques.

La procédure sera démontrée par le Dr Theresa Ozzi, une postdoctorante dans mon laboratoire. Pour ce protocole, utilisez un kit disponible commercialement afin de purifier les plasmides. Préparez l'ADN plasmidique à 0,33 milligramme par millilitre dans de l'eau et ajoutez un colorant bleu rapide comme traceur d'injection à environ 0,02 % poids par volume. Désinfectez toujours les outils chirurgicaux, l'espace de travail et le microscope.

Avec de l'éthanol à 70 %, sacrifier un nombre requis de souris Swiss Webster à J 13 par inhalation de dioxyde de carbone. Une fois les embryons extraits, les placer dans une boîte de 10 centimètres contenant du HBSS froid sur glace, maintenue au froid. Dissecter soigneusement chaque embryon des membranes extra-embryonnaires environnantes.

Transférez maintenant chaque embryon individuellement dans une boîte de Pétri propre contenant du HBSS glacé. À l’aide d’une seringue Hamilton, injectez deux à trois microlitres de l’ADN préparé dans le ventricule de l’hémisphère cérébral gauche. N’effectuez pas d’injection dans la zone corticale destinée à l’analyse ultérieure ni à proximité de celle-ci.

Pour électroporer l'ADN, maintenez l'embryon délicatement avec une pince et placez légèrement la palette positive de l'électrode en pince sur la ligne médiane dorsale de la tête. Placez légèrement la palette négative sous le menton de l'embryon. Exécutez un programme de cinq impulsions de 30 volts, chacune de 50 millisecondes, à des intervalles d'une seconde, à l'aide d'un modèle BTX 830 ou d'autres systèmes pouvant être réglés selon les instructions du fabricant.

Replacer chaque embryon dans le HBSS glacé et poursuivre la préparation de l'hémisphère entier en utilisant deux pincettes de bijoutier n°5 sous microscope de dissection. Retirer la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l'embryon. Glisser ensuite les pincettes sous le cerveau.

Pour extraire le cerveau intact du crâne, disséquez l'hémisphère électroporé, y compris le tissu du mésencéphale qui y est attaché. Veillez à ne pas endommager les méninges recouvrant l'hémisphère cortical disséqué. Nous avons constaté que l'étape la plus difficile à maîtriser consiste à disséquer et retirer l'hémisphère électroporé sans endommager les méninges.

Une fois disséqués, transférez chaque hémisphère dans cinq millilitres de HBSS glacé à l’aide d’une pipette dont l’embout d’un millilitre a été élargi. Si nécessaire, les embryons peuvent être conservés dans des puits séparés d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Ensuite, transférez délicatement jusqu’à six hémisphères sur une culture de 24 millimètres revêtue de collagène.

Insérez et positionnez-le avec le côté médial vers le bas. Remplissez maintenant une cavité de 35 millimètres d'une plaque à six puits avec 2,7 millilitres de milieu supplémenté. Éliminez tout excès de HBSS de l'insert et placez l'insert dans la cavité ; à l’aide d’une pipette, ajoutez quelques gouttes du milieu provenant du puits sur la face supérieure de chaque x explan.

Ne pas augmenter le volume du milieu. Nous avons constaté qu'il est essentiel de déposer quelques gouttes de milieu de culture sur l'explant X, de sorte que les explants X ne soient pas complètement recouverts de milieu. Cela peut impliquer d'ajouter jusqu'à 400 microlitres aux 2,7 mils de milieu situés au-dessus de l'explant X.

Déplacer la boîte dans une chambre Billups-Rothenberg contenant une coupelle d'eau humidifiante et ayant été imprégnée d'oxygène à 95 % pendant au moins une minute. Fermer hermétiquement la chambre et déconnecter le tube d'approvisionnement en gaz. Placer la chambre dans un incubateur à 37 °C pendant deux jours, délai au terme duquel la division des prépl sera intervenue.

En préparation. Préparer des tampons pour l'incorporation de l'explants. Préparer une solution de gélatine de peau de veau à 10 % à 60 degrés Celsius.

Une fois solubilisé, verser environ 10 millilitres de la solution dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Conserver le reste de la solution à 60 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Laisser les supports durcir pendant une demi-heure, si nécessaire.

Ils peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours, mais doivent être réchauffés à température ambiante avant utilisation. Le jour de la fixation, en hotte, préparez la solution de Pagano avec fixateur et la solution de Pagano sans fixateur. Réchauffez la solution de fixation à 37 degrés Celsius.

Retirez les explants de l'incubateur sans perturber soigneusement et rapidement les tissus. Éliminez la majeure partie du milieu et remplacez-le par cinq millilitres de fixateur préchauffé. Assurez-vous que chaque explant est complètement immergé.

Fixer les tissus pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirer le fixateur et le remplacer par la solution de Pagano. Sans fixateur.

Ajouter quelques gouttes d'azoture de sodium à 10 % dans chaque puits. Les tissus peuvent désormais être conservés à quatre degrés Celsius jusqu'à leur inclusion sur un coussin d'inclusion. Tracer une grille sur le fond de la boîte à l'aide d'une règle.

Préparer des carrés de deux à trois centimètres. Transférer les explants individuels sur le coussin d'encrage. Aspirer toute solution résiduelle et recouvrir chaque explant d'une solution chaude de gélatine à 10 %.

Laisser durcir. Une fois que la prise est effectuée lentement, ajouter progressivement plus de solution de gélatine jusqu'à ce que chaque explant soit entièrement entouré. Éviter de faire fondre le coussin, ce qui peut se produire si trop de gélatine est ajoutée d'un seul coup.

À présent, laissez durcir la gélatine pendant environ une heure. Une fois durcie, l'explant individuel peut être découpé en petits blocs de gélatine avant d'être sectionné. Il est important de fixer les blocs dans le fixateur de Pagano pendant un jour ou deux.

Lors de la coupe, positionner les explants avec le bulbe olfactif vers le haut et réaliser des coupes dans le plan coronal avec une épaisseur de 100 micromètres. Ramasser les sections dans du PBS refroidi contenant 0,1 % d'azoture de sodium.

Conserver les sections à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles puissent être colorées à l'aide de la technique décrite. Des explants entiers d'hémisphère ont été préparés au stade E 13 avant la séparation préliminaire. Dans le néocortex dorsal.

Le tissu contenait un transgène qui marque les neurones immatures de la lignée corticale excitatrice. Des explants corticaux provenant de la même portée ont été fixés goutte à goutte de manière séquentielle sur une période de deux jours in vitro et préparés pour une analyse histologique ultérieure. Au moment initial d'analyse, soit le jour in vitro zéro (DIV 0), la division prémitotique n'avait pas encore eu lieu dans le champ, un par un, DIV.

Les CP deviennent apparents et continuent de croître jusqu'au 2D IV. Ainsi, les explants hémisphériques entiers cultivés initialement à E 13 ont permis pendant deux jours la maturation du cortex cérébral et ont permis d'observer la scission précoce dans le néocortex dorsal afin de confirmer un développement histologique normal dans cette région. Les explants de 2D IV ont été soumis à une immunomarquage pour le sulfate de chondroïtine, les protéoglycanes et les composants de la matrice extracellulaire. Deux bandes d'immunoréactivité dans le cortex dorsal indiquaient une scission adéquate du PPP en zone marginale (MZ) et couche sous-plaquaire (SP) durant la période de culture in vitro.

Le PP a été divisé par six neurones corticaux exprimant CTIP deux et TBR R un. Le motif d'immunomarquage de ces marqueurs confirme l'expression appropriée de ces facteurs de transcription dans le cp nouvellement formé. Ensemble, ces analyses confirment un développement cortical précoce d'origine organotypique dans l'hémisphère entier en utilisant l'ensemble du protocole décrit ; le ventricule gauche d'embryons E 13 intacts a été injecté.

Une expression de GFP électroporée et traitée pouvait être observée à partir des précurseurs neuronaux dans la zone ventriculaire. Alors que des cellules exprimant fortement GFP étaient observées dans la zone intermédiaire et le cortex pallial, des neurones nombreux exprimant GFP, marqués par des flèches, ont été observés de manière importante au sommet du cortex pallial en formation, avec des dendrites et des axones émergents. La couche discrète située à l'interface entre le cortex pallial et la zone moléculaire indique une migration, une arrestation et une laminage appropriés.

Les dendrites s'étendaient dans la zone moléculaire (MZ), tandis que les axones cortico-ugaux s'étendaient sous la couche plexiforme (CP) et dans la zone intermédiaire (iz). Les cellules en cours de différenciation étaient des cellules GFP positives à divers stades de maturité, incluant des neurones de morphologie bipolaire adjacents aux fibres gliales radiaires, ainsi que, en dessous, des neurones multipolaires présents dans la zone intermédiaire (iz). Les dendrites s'étendaient également dans la zone moléculaire (MZ), où la protéine matricielle extracellulaire réidine est correctement localisée par immunomarquage.

Ainsi, les conditions d'électroporation et d'explant permettent un développement normal des neurones corticaux. Comme prévu, les neurones post-mitotiques positifs pour la GFP ont colonisé le cp en formation. Par conséquent, ce protocole peut cibler de manière fiable les neurones corticaux de couche six pour l'étude de leur migration et de leur maturation.

Une utilisation extensive de cette procédure a permis d'obtenir un taux de réussite de 79 %. 195 tentatives sur 248 se sont révélées appropriées pour l'imagerie et l'analyse. La moitié des échecs sont attribuables à une absence d'expression de la GFP ou à une ciblage manqué de la GFP. Une fois maîtrisée,

Cette technique peut être réalisée en 90 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de s'entraîner aux dissections afin que les hémisphères électroporés puissent être cultivés avec des méninges intactes après cette procédure. D'autres méthodes, comme la microscopie en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont les mutations d'intérêt perturbent la migration neuronale ou l'agenèse dendritique.