Revêtements de graphène pour les implants biomédicaux

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode permettant de recouvrir un alliage métallique à mémoire de forme, le nitinol, de graphène afin d'améliorer sa compatibilité hémodynamique dans les matériaux d'implants en contact avec le sang. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, la croissance du graphène sur des feuilles de cuivre par dépôt chimique en phase vapeur, puis, deuxièmement, la gravure du cuivre et le transfert du graphène préparé vers des substrats en nitinol.

Ensuite, les substrats de nitinol revêtus de graphène sont utilisés pour la culture de cellules endothéliales et de cellules musculaires lisses. Afin de quantifier la cyto-compatibilité, un autre test consiste à évaluer l'hémo-compatibilité en fixant les deux protéines, le fibrinogène et l'albumine, sur les substrats de nitinol revêtus de graphène. Enfin, la spectroscopie micro-Raman, la microscopie confocale, les tests d'otoxicité in vitro et l'analyse protéique par électrophorèse SDS-PAGE sont utilisés pour démontrer un revêtement de graphène réussi, une morphologie cellulaire améliorée, une viabilité cellulaire accrue et une meilleure hémo-compatibilité.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes, comme le revêtement polymère, est que les revêtements en graphène sont extrêmement durables et résistants à la corrosion. Les implications de cette technique s'étendent à l'amélioration des technologies de stents, car les propriétés intrinsèques du matériau graphène devraient réduire l'absorption des protéines et limiter l'activation des facteurs de coagulation due au changement de conformation des protéines. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les stents en nitinol revêtus de graphène, elle peut également être utilisée pour d'autres systèmes, tels que les valves cardiaques ou les cathéters.

Pour commencer, placez des feuilles de cuivre d'un centimètre sur un centimètre dans un four en tube de quartz d'un pouce et chauffez à 1000 degrés Celsius en présence de 50 SCCM d'hydrogène et de 450 SCCM d'argon. Ensuite, introduisez du méthane à raison de un à quatre SCCM dans le four à 1000 degrés Celsius à différents débits pendant 20 à 30 minutes. Refroidissez les échantillons à température ambiante à l'intérieur du four sous un courant d'hydrogène, d'argon et de méthane.

Après avoir retiré les échantillons du four, découpez-les en carrés de 4,5 millimètres et utilisez du PMMA dilué avec 4 % Anole pour déposer par centrifugation sur les feuilles de cuivre à 4 000 tr/min, suivi d'un traitement thermique de cinq minutes à 150 degrés Celsius. Gravez la feuille de cuivre à l'aide de l'agent de gravure CE 100 jusqu'à ce que la feuille de cuivre soit entièrement gravée. Rincez dans de l'acide chlorhydrique à 10 % pendant 10 minutes, puis dans de l'eau déionisée pendant 10 minutes.

Pour obtenir l'échantillon de graphène transféré sur PMMA, transférez les échantillons de graphène sur des substrats en nitinol de 4,5 millimètres carrés. Ensuite, traitez-les à 450 degrés Celsius sous 300 SCCM d'argon et 700 SCCM d'hydrogène pendant deux heures. Pour éliminer le PMMA, lavez enfin les substrats en nitinol avec de l'acétone afin de dissoudre le PMMA résiduel et d'obtenir l'échantillon de graphène sur nickel-titane.

Pour commencer les tests de toxicité, ajouter des substrats de nitinol vierge, du nitinol avec un SCCM ou du nitinol avec quatre SCCM de graphène, dans des plaques de 96 puits, où le SCCM indiqué correspond au débit de méthane utilisé lors de la croissance du graphène par dépôt chimique en phase vapeur. Ensuite, ensemencer des cellules endothéliales aortiques de rat à raison de 10⁵ cellules par puits dans certains puits contenant du nitinol vierge, du nitinol avec un SCCM ou du nitinol avec quatre SCCM de graphène. Dans un autre ensemble de puits, ensemencer des cellules musculaires lisses aortiques de rat de manière similaire.

Faites croître les cellules pendant trois jours ou sept jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en renouvelant le milieu tous les deux jours. Au moment final, retirez le milieu des puits contenant les cellules musculaires lisses et ajoutez un milieu frais contenant 0,5 milligramme par millilitre de MTT à chacun. Incubez les cellules pendant trois heures supplémentaires.

Ensuite, retirez délicatement le milieu et ajoutez 100 microlitres de diméthylsulfoxyde dans chaque puits. Après avoir laissé les cristaux de MTT se dissoudre pendant 10 minutes, transférez la solution dans une autre plaque de puits. Pour le test MTS, retirez le milieu des puits contenant les cellules endothéliales au moment final.

Remplacer par 120 microlitres de solution MTS et incuber pendant trois heures. Ensuite, transférer le contenu des puits dans une nouvelle plaque. Lire l'absorbance à 490 nanomètres et déterminer le pourcentage de viabilité en normalisant l'absorbance par rapport à l'absorbance moyenne de l'échantillon de nitinol vierge.

Répétez cette étape au moins cinq fois pour chaque échantillon. Pour l'imagerie confocale de cellules musculaires lisses aortiques de rat, placez les substrats dans une lame à huit chambres, en laissant une chambre vide comme témoin. Ensuite, semez les cellules dans toutes les chambres à raison de 25 000 cellules par chambre et incubez pendant trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après avoir retiré le milieu des lames, fixer les cellules sur le substrat avec du formaldéhyde 4 % dans un tampon PBS pendant 20 minutes. Rincer avec du PBS, puis rendre les cellules perméables avec du Triton X 0,1 % pendant une minute. Après un rinçage avec du PBS, ajouter 100 microlitres de la solution LOR 4 88 PHIN à 1,9 millilitre de tampon PBS.

Pour visualiser l'actine, colorer les cellules avec 250 microlitres de LOR 4 88 Phin pendant 45 minutes, puis laver deux fois avec du tampon PBS. Ensuite, colorer les noyaux avec un milieu de montage fluorescent contenant du dpi. Acquérir les images confocales à l'aide d'un Nikon confocal ti.

Avant de commencer les expériences d'absorption des protéines albumine et fibrinogène, mesurer les dimensions du substrat à l'aide d'un pied à coulisse. Effectuer trois mesures pour chaque côté des échantillons approximativement carrés et en calculer la moyenne. Pour obtenir la longueur et la largeur, placer l'échantillon de nitinol vierge, l'échantillon de nitinol avec graphène SCCM, et l'échantillon de nitinol avec graphène SCCM quadruple dans deux 12.

Ajouter dans les puits du tampon PBS contenant un milligramme par millilitre d'albumine. Ajouter de la température ambiante à l'une des plaques et incuber séparément pendant trois heures. Incuber les trois types d'échantillons avec du tampon PBS contenant un milligramme par millilitre d'albumine.

Fibrinogène à température ambiante pendant trois heures après lavage des échantillons au PBS, combiner les échantillons similaires dans un tube de microcentrifugeuse contenant 200 microlitres de tampon d'échantillonnage réducteur et faire bouillir pendant cinq minutes. Diluer les échantillons selon un rapport volumique de un à neuf de tampon SDS glycine T dans de l'eau déionisée et les faire migrer sur un gel d'électrophorèse en polyacrylamide tris à 4-15 % à 90 volts pendant 100 minutes. Diluer la solution mère de Spro red selon un rapport de un à 5 000 dans de l'acide acétique à 7,5 %.

Ensuite, colorer les gels pendant 60 minutes avec la solution SPro Red diluée. Envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger la SPro Red de la lumière, puis imager les gels à l'aide d'un Fluor chem SP et quantifier l'intensité fluorescente à l'aide du logiciel Image J. Normaliser ensuite l'intensité fluorescente de chaque échantillon par rapport à la surface totale du substrat, puis comparer l'absorption du fibrinogène à celle de l'albumine.

La méthode de dépôt chimique en phase vapeur a permis d'obtenir des échantillons de graphène polycristallin imitant les grains cristallins du cuivre. La spectroscopie Raman a été utilisée pour confirmer la présence de graphène monocouche sur les échantillons à un SCCM et à quatre SCCM. L'échantillon à un SCCM présente une bande GPR intense, indiquant la nature monocouche du graphène ainsi préparé. En revanche, l'échantillon à quatre SCCM montre une bande GPR relativement plus faible, ce qui confirme la présence de quelques couches de graphène. L'image ici présentée est une image de microscopie à force atomique du graphène transféré sur des substrats en nitinol.

Des mesures détaillées de l'échantillon ont donné une valeur de rugosité de surface d'environ cinq nanomètres. Voici les images de microscopie optique confocale de cellules musculaires lisses cultivées sur une lame de verre contrôlée, sur des substrats de nitinol vierges, sur des substrats de nitinol avec un SCCM de graphène, et sur des substrats de nitinol avec quatre SCCM de graphène. Les cellules sont denses et sphériques sur les deux surfaces de nitinol avec graphène, ce qui démontre une meilleure morphologie cellulaire.

Les tests MTT et MTS montrent qu'un et quatre substrats de nitinol avec graphène à SCCM n'exhibent aucune différence significative de viabilité des cellules musculaires lisses par rapport au nitinol vierge. Les tests MTS montrent que la viabilité cellulaire des cellules endothéliales après trois jours n'était pas significativement différente de celle des témoins. Les images de microscopie électronique à balayage montrent que les cellules endothéliales cultivées sur des substrats de nitinol vierge sont clairsemées et allongées, tandis qu'elles sont ellipsoïdales et denses sur les substrats de nitinol avec graphène à un et quatre SCCM.

Ces résultats démontrent que les revêtements de graphène conduisent à une morphologie cellulaire sphérique améliorée des cellules endothéliales ; les échantillons de nitinol-graphène à 1 SCCM et à 4 SCCM présentent un rapport faible entre la fibrinogène et l'albumine par rapport à l'échantillon de nitinol vierge, suggérant une hémocompatibilité accrue due au graphène. L'équilibrage du niveau de Fermi est illustré par le diagramme des niveaux d'énergie pour la fibrinogène et la densité des états électroniques du graphène. Un transfert d'électrons de la fibrinogène vers le nitinol-graphène n'est possible qu'à partir des états électroniques occupés de la molécule de fibrinogène vers des états électroniques vides du nitinol-graphène situés au même niveau d'énergie.

Le graphène mono- et oligocouches est un semi-métal à température ambiante, avec une faible densité d'électrons au niveau de Fermi, ce qui entraîne un faible transfert de charge du fibrinogène vers le graphène. Le graphène ne présente aucune modification de la forme ou de la fréquence de la bande GB, indiquant un faible transfert de charge en provenance des protéines plasmatiques. Les pics D déconvolués obtenus par ajustement de courbe sont représentés en noir afin de démontrer l'utilité et la viabilité du graphène comme revêtement d'implant.

Une pièce de cuivre revêtue de graphène a été exposée à du peroxyde d'hydrogène à 5 %. La partie recouverte de graphène est restée inchangée, tandis que la partie non recouverte a été décolorée par la solution de peroxyde d'hydrogène. De plus, du nitinol recouvert de graphène immergé dans de l'acide nitrique à 70 % n'a montré aucune modification de la fréquence de la bande GB, confirmant que le revêtement de graphène est extrêmement durable.

De plus, le revêtement de graphène dans le nitinol graphéné a réduit au taux X la corrosion du cuivre sous-jacent, indiquant l'imperméabilité des membranes de graphène. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transférer le graphène sur des implants biomédicaux afin d'améliorer leur biocompatibilité.