Name: Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Apprenez à isoler des cardiomyocytes adultes de souris par perfusion Langendorff pour étudier la contraction et le calcium. Cette méthode permet la culture, la transfection virale et l'analyse fonctionnelle des cellules cardiaques.

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<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Ballou, L. M., Lin, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR kinase inhibitors.</a> J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Tubule+Function+in+Mammalian+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes.</a> Circ Res. , (2003).</li>
<li>Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decompensation+of+pressure-overload+hypertrophy+in+G%3Fq-overexpressing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice.</a> Circulation. , (1998).</li>
<li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2%2BWavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li>
<li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li>
<li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li>
<li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+modifies+Ca+2%2B+signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li>
<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
<li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
<li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li>
<li>Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connexin+43+in+ischemic+preconditioning+does+not+involve+intercellular+communication+through+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).</li>
<li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li>
<li>Boström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PGC1-%3F-dependent+myokine+that+drives+brown-fat-like+development+of+white+fat+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis.</a> Nature. 481, 463-468 (2012).</li>
<li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li>
<li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li>
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<li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936(2008).</li>
<li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).</li>
<li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li>
<li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li>
<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
<li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy%3A+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans ce rapport, nous avons décrit les techniques nécessaires pour permettre l&#39;isolement et la culture des adultes CM du coeur de la souris. Notre technique permet une étude subséquente de la fonction et de l&#39;excitabilité CM utilisant les procédés décrits ci-dessus. Le paramètre critique pour l&#39;étude de la fonctionnalité des adultes MC est la santé et la qualité de l&#39;isolement CM. Comme décrit ci-dessus, nos techniques permettent un rendement élevé de cellules fonctionnelles qui se prêtent à une manipula...

Des modèles murins de maladie cardio-vasculaire ont servi d&#39;outils efficaces pour élucider les mécanismes de la maladie 1,2 fondamentales, ainsi que pour l&#39;identification de cibles thérapeutiques potentielles 1,3. En particulier, l&#39;utilisation des deux modèles murins de maladies cardiaques acquises (tels que la pression de surcharge) et 4,5 modèles de souris transgéniques ont fait progresser notre compréhension de la maladie cardiaque 6-8. L&#39;utilisation de techniques de culture de cellules à étudier cascades de signalisation 3,9,10 et modifications dans les protéines individuelles qui sous-tendent l&#39;excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction dans le coeur de 11 à 13 au niveau de la cellule unique ont complété les modèles in vivo de souris. Cependant, le manque de lignées cellulaires appropriées qui reflètent la structure et la fonction des adultes CM a une limitation importante. Les investigateurs ont tenté de surmonter ce par l&#39;étude de protéines individuelles, telles que des canaux ioniques, dans des systèmes d&#39;expression hétérologues <sup&gt; 14, et bien que ces études nous ont fourni des informations utiles en termes de biophysique de canaux ioniques ou le trafic de protéines, représentation inadéquate de la micro-natif de la CMS est une limitation importante. Deuxièmement, puisque la plupart de ces cellules hétérologues n&#39;ont pas un appareil contractile mature, il n&#39;a pas été possible d&#39;étudier la fonction contractile et l&#39;interaction complexe entre l&#39;excitabilité cellulaire et la contraction. Pour cette raison, les chercheurs se sont tournés vers des cultures de cellules primaires cardiaque pour beaucoup de leurs études fonctionnelles in vitro. Enfin, des études de cardiomyocytes isolés permettent d&#39;évaluer la fonction contractile sans les facteurs de confusion de préparation multicellulaire y compris l&#39;effet de cicatrice ou de la fibrose et de l&#39;orientation des fibres. Néonatales cardiomyocytes ventriculaires de rat primaires (NRVMs) sont relativement facile à la culture, peuvent être infectées par des adénovirus et lentivirus de manipuler l&#39;expression du gène 15, une ont donc été utilisée avec succès une, mais des limites de leur propre. Bien qu&#39;ils fournissent un microenvironnement physiologique 1 et ont été le cheval de bataille du champ de signalisation, des différences substantielles entre la morphologie et l&#39;organisation subcellulaire de NRVMs et cardiomyoctyes adultes en font un modèle pour l&#39;étude des flux ioniques et couplage excitation-contraction dans le coeur adulte insuffisant . Plus particulièrement NRVMs définitif n&#39;ont pas une sous-système tubulaire t-4. Depuis Ca 2 + flux et dynamique dépendent de façon critique sur des T-tubulaire maturité et le réticulum sarcoplasmique (RS) la structure 6, Ca 2 + dynamique et des études fonctionnelles de la contractilité cardiaque dans NRVMs ne sont pas un reflet exact de ces processus critiques dans les cardiomyocytes adultes. De plus, certains composants de voies de signalisation diffèrent entre les souriceaux nouveau-nés et les adultes 9, fournissant ainsi une autre limitation pour étudier les processus de la maladie et leur impact sur l&#39;excitabilité cellulaire et la contractilité dans NRVMs. Enfin, la distribution de la machinerie contractile conduit à un raccourcissement de la cellule multidirectionnel et non uniforme limitant la précision des mesures contractiles. L&#39;utilisation des cardiomyocytes adultes isolés fournit donc un système de modélisation plus précise in vitro. La croissance extraordinaire des connaissances rendue possible par la manipulation génétique de la souris souligne l&#39;importance d&#39;obtenir des cardiomyocytes isolés fonctionnels de souris. En fait, la caractérisation des adultes CM isolés à partir des modèles de souris a mis en lumière de nombreux événements biologiques et pathologiques. CM isolés à partir de modèles de souris transgéniques ont permis d&#39;études du gain ou de la perte de la fonction des protéines sur les propriétés contractiles des cellules simples 2,16, et la viabilité des modèles de maladies telles que l&#39;ischémie / reperfusion 17,18, complétant ainsi les informations obtenues à partir de Des études in vivo sur l&#39;souris soi. Utilisation d&#39;adulte isolé CM de modèles murins de maladie cardiaque acquise 3,19,20 (comme aortique surcharge transversale de pression induite par constriction, qui imite l&#39;hypertension ou la sténose aortique) ou de l&#39;exercice 5,21 (pour la modélisation de l&#39;hypertrophie physiologique) permet à l&#39;examen de l&#39;interaction des cascades de signalisation impliquées dans ces processus avec de l&#39;excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction au niveau de la cellule unique. En outre, la capacité de manipuler l&#39;expression des gènes en utilisant l&#39;expression du gène conduit adenovirus en adulte CM nous donne l&#39;occasion de disséquer les composants de voies de signalisation complexes. Du point de vue électrophysiologique, la tension de cellule entière et expériences actuelles de serrage sur adulte isolé CM ont été essentiels dans la compréhension de la nature des flux ioniques au départ et dans divers états pathologiques. En raison de la structure complexe de la membrane cellulaire et la prote différentieldans les structures d&#39;échafaudage entre adultes GC et NRVMs ou des lignées de cellules hétérologues, la possibilité de patcher les cellules adultes donne une bien meilleure représentation des effets de certaines protéines membranaires, des protéines structurelles et canaux ioniques partenaires d&#39;interaction sur les composantes électrophysiologiques du cœur adulte. En dépit de ces avantages importants dans l&#39;étude adultes cardiomyocytes murins, l&#39;isolement et la culture de cardiomyocytes de souris adultes ont été difficiles, insistant sur la nécessité d&#39;une description systématique et précise de la méthodologie pour isoler les cardiomyocytes de souris viables et à les maintenir en culture à la poursuite de la manipulation génétique en utilisant virale vecteurs. Des études antérieures ont utilisé soit des adultes de la souris aiguë isolé GC ou adulte de rat cultivés GC. Ces derniers sont plus facile à la culture de la souris adulte MC, et la plupart des expériences de manipulation expression génique in vitro ont utilisé rat adulte GC. Peu d&#39;études ont modifié avec succès et une enquête fonctil&#39;expression du gène onal des adultes de la souris CM, présentant une grande limitation dans le champ d&#39;expériences. Par conséquent, nous présentons ici en détail ces méthodes, modifiés à partir des enquêtes précédentes, pour l&#39;isolement 7,8,22, culture 3,10,15,23, infection adénoviral 11-13,15, et l&#39;analyse fonctionnelle de cardiomyoctyes ventriculaires de souris adultes. Ce protocole d&#39;isolement des résultats dans Ca 2 +, les cardiomyocytes excitables tolérantes que nous avons cultivées avec succès jusqu&#39;à 72 h et transfectées de façon transitoire avec l&#39;adénovirus. La fonctionnalité de ces cellules isolées peuvent être évaluées à l&#39;aide du système d&#39;imagerie et MMSYS 14,24 patch clamp, qui sera également discuté.

<table><tbody><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose minimum</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione Monxime</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase B</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Protéase XIV de Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Milieux essentiels minimaux</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine à partir de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Milieu insuline-transfertrine-sélénite sodique supplément</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de césium</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp ; region=US » target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate sel de magnésium</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(2-amin&#8211 ; thylether)-N,N,N',N'-acide tétraacétique</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de césium</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de tétraéthylammonium</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>OptiVisor Verre optique Visière binoculaire</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus, 5,5 », 1x2 dents</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Pince Moloney - 4,5 » (11,5 cm) de long, légère courbure, dentelée </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps, Dumostar, taille de la pointe 0,17 x 0,10 mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Packer Moustique Pince 5 » Droite Plate</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ciseaux de Dissection 4.5 » Courbé Sharp/Sharp </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ciseaux de Dissection 3.5 » Straight Sharp/Sharp20mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes cardiomyoctyes souris

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

L&#39;utilisation des cardiomyocytes primaires (CMS) dans la culture a fourni un complément puissant pour des modèles murins de la maladie de coeur dans l&#39;avancement de notre compréhension de la maladie de coeur. En particulier, la capacité à étudier l&#39;homéostasie ionique, de la fonction de canal ionique, l&#39;excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction et leurs altérations dans des conditions pathologiques et par des mutations pathogènes ont conduit à des avancées importantes au niveau des maladies cardiaques. En outre, l&#39;absence d&#39;une ligne suffisante de cellules immortalisées à imiter les adultes GC, et les limites de néonatale CM (qui n&#39;ont pas beaucoup de la caractéristique de la biomécanique structurale et fonctionnelle des adultes MC) dans la culture ont entravé notre compréhension de l&#39;interaction complexe entre les voies de signalisation, les canaux ioniques et les propriétés contractiles du coeur adulte renforcer l&#39;importance d&#39;étudier adultes cardiomyocytes isolés. Ici, nous présentons des procédés pour l&#39;isolement, la culture, la manipulation de l&#39;expression de gène par adenovirus expreprotéines sseD et analyse fonctionnelle ultérieure de cardiomyocytes de la souris adulte. L&#39;utilisation de ces techniques permettra de développer une approche mécanistique dans les voies de régulation de l&#39;excitabilité cellulaire, Ca 2 + dynamique et la contractilité de signalisation et de fournir une caractérisation beaucoup plus physiologiquement pertinents de maladies cardio-vasculaires.

L&#39;isolement des résultats cardiomyoctyes adultes dans des cellules en forme de baguette, striées, et quiescentes (pas spontanément battant) (Figure 5A). Les cellules mortes seront look arrondi et aucun stries seront présents. Cellules au repos peuvent être cultivées et transfectées avec l&#39;adénovirus de manipuler l&#39;expression des gènes (figures 5B et 5C). Après 24 heures de culture, la morphologie des cellules vivantes ne change pas, ils sont encore Ca 2...

Nous décrivons ici l&#39;isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l&#39;adénovirus ou de lentivirus de manipuler l&#39;expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler, de cultiver et de visualiser la contraction et la gestion du calcium dans les cardiomyocytes adultes de souris. Cette opération s'effectue tout d'abord en retirant le cœur de souris et en le plaçant à température ambiante dans du PBS. Le cœur peut alors être canulé dans la boîte selon ce qui est illustré dans le schéma, ou directement sur l'aiguille fixée au système de perfusion, comme montré dans la vidéo.La troisième étape consiste à laver et digérer le cœur par perfusion pulsée, en faisant circuler un tampon, puis un tampon enzymatique à travers le système. La dernière étape consiste à découper les ventricules dans une boîte contenant du tampon de transfert et à hacher délicatement le tissu à l’aide de pinces. En fin de compte, les résultats peuvent montrer la contraction des cardiomyocytes individuels et la gestion du calcium par des mesures de la cellule entière et/ou de la longueur des sarcomères ainsi que par des rapports métriques.Des indicateurs de calcium tels que le RO 2:00 AM avec le système optique ionique. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il peut être délicat de suspendre rapidement le cœur par l'aorte sans endommager le vaisseau ou le cœur lui-même. Injecter des souris adultes d'environ 12 semaines d'âge avec 150 unités USP de sodium héparine dans l'espace abdominal.Si la souris est déshydratée, injecter un cc de solution saline. Anesthésier la souris à l’aide d’une injection de mélange de kétamine et de xylazine à une dose dépendante du poids. On vérifie que la souris est profondément anesthésiée par la perte du réflexe de pincement des orteils des membres postérieurs et le ralentissement de la fréquence respiratoire. Fixer la souris sédatée sur le tapis opératoire, puis exciser le cœur et le placer dans une boîte contenant de la solution saline physiologique.À l'aide de lunettes de dissection opti vision, identifier et exposer l'aorte. La suppression du tissu entourant l'aorte n'est pas nécessaire pour l'isolement cellulaire. Dès que la racine aortique est clairement visible, amorcer la pompe avec le tampon de perfusion.Commencez à pomper à vitesse rapide pour remplir les lignes et vérifiez l'absence de bulles. Ensuite, pompez à vitesse lente afin de régler le débit pour la perfusion cardiaque. Utilisez un bain d'eau thermostaté pour maintenir la température du tampon de perfusion à 37 degrés Celsius.Utilisez une pince anatomique fine pour placer l'aorte sur l'aiguille comme une chaussette. Veillez à ce que l'extrémité de l'aiguille repose dans l'aorte ascendante, idéalement à la racine aortique en aval de l'artère innominée droite. Ensuite, fixez le cœur à l'aiguille en nouant un morceau de soie chirurgicale de 10 centimètres autour de l'extrémité supérieure de l'aorte.Veillez à ce que le ligature soit au niveau de l'aorte ascendante, sous l'artère innominée droite, mais également au-dessus de l'extrémité de l'aiguille et au-dessus de la valve aortique. Abaissez maintenant le cœur à l'intérieur du cône. Cela permet de maintenir la température ambiante.Perfuser le cœur avec le tampon de perfusion pendant cinq minutes à un débit d'un millilitre par minute, et fermer la sortie de la chambre en verre pour permettre au PERFU eight de s'accumuler dans le récipient conique en verre et d'envelopper le cœur. À ce stade, vous devriez observer un accroissement du volume du cœur. De plus, le sang présent dans le tissu cardiaque sera remplacé par le PERFU eight, entraînant une pâleur du tissu.Arrêtez la pompe pour déplacer le tube du récipient contenant le tampon de perfusion vers le récipient contenant le tampon enzymatique. Ouvrez le clamp de sortie pour vider le PERFU huit. Redémarrez la pompe pour commencer la perfusion du cœur.Avec le tampon enzymatique à un millilitre par minute, pincer à nouveau l'effluent pour permettre au tampon enzymatique d'envelopper le cœur. Ici, tandis que l'enzyme perfuse le cœur et digère les tissus conjonctifs, le cœur devient plus pâle et son intégrité structurelle diminue. Pour les débutants, il est utile de relier la ligne de perfusion à un manomètre.Le manomètre peut également être utilisé pour s'assurer que la position de l'aiguille est située au-dessus de la valve aortique et non dans le ventricule. Une pression faible indique que l'aiguille se trouve dans la chambre ventriculaire, tandis qu'une pression élevée indique que l'aiguille touche la valve. Lorsque le cœur est en cours de digestion, la pression diminuera rapidement car les tissus conjonctifs ne maintiennent plus la résistance.Pour déterminer le moment opportun pour disséquer les ventricules à partir du cœur digéré, sortez le cœur du verre conique, comprimez délicatement le cœur avec une pince et récupérez quelques gouttes de PERFU huit dans une petite boîte de Pétri afin de vérifier. Si des cellules isolées apparaissent dans un délai de huit à dix minutes, la pression ventriculaire aura chuté et vous devriez pouvoir observer des cellules uniques pénétrer dans le Perfu. Huit dès que l'un ou l'autre phénomène est observé pour la première fois, disséquez les ventricules du cœur et placez-les dans une boîte remplie de tampon de transfert A pour une préparation plus uniforme.Découper et retirer le ventricule droit, en laissant le ventricule gauche sur place pour le hacher et l'étudier. Si l'on s'intéresse au ventricule droit, celui-ci peut être haché après séparation. À l'aide de pinces de dissection microchirurgicales, hacher chaque ventricule séparément. Une digestion réussie laisse presque aucun morceau solide de tissu après le hachage, la majeure partie du tissu devenant amorphe lors de la dissociation.Pour dissocier davantage le tissu, faites-le passer à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique dont l’extrémité a été coupée. À un angle de 45 degrés, fixez un morceau de grille quadrillée sur un petit entonnoir à l’aide de pinces et placez cet appareil de filtration dans un tube de 15 millilitres. Utilisez la pipette Pasteur modifiée pour prélever la solution cellulaire depuis la boîte et filtrer la solution dans le tube de 15 millilitres.Laisser les cellules vivantes se déposer au fond du tube, ce qui prendra quelques minutes. Le fractionnement du volume en deux tubes donne des résultats plus rapides. La formation du culot après Ali.Prélevez 2,5 millilitres de chacune des quatre solutions de calcium et placez-les dans quatre tubes séparés de 15 millilitres. Utilisez la pipette standard pour transférer délicatement le culot cellulaire sédimenté vers la première des solutions de calcium. Laissez les cellules se déposer au fond du tube, puis répétez le processus.Transférer les cellules sédimentées à travers chacune des solutions de calcium. Lorsque les cellules sont transférées dans la quatrième solution de calcium, boucher le tube et le placer sur le côté. Mettre sous tension le système MM SIS en veillant à ce que la lampe à arc s'initialise en premier.Ensuite, amorcer le système avec le tampon au calcium B. Connecter les tubes de la pompe aux entrées et sorties appropriées de la chambre cis MM. Fixer une lame de verre de taille appropriée, généralement de 20 sur 25 millimètres, dans la chambre. Transférer 500 microlitres de la solution cellulaire dans un petit tube Eppendorf.Ajoutez 0,5 microlitres de PHE 2:00 AM aux cellules et laissez-les incuber à l’obscurité à température ambiante pendant cinq à sept minutes après avoir assombri la pièce. Commencez maintenant à faire circuler délicatement le tampon calcique B à travers la chambre. Dès que la circulation est amorcée, et pas avant, commencez à augmenter la température de la chambre jusqu’à 37 degrés Celsius.Utilisez une pipette modifiée pour déposer une ou deux gouttes de solution cellulaire sur la lame, en fonction de la concentration cellulaire, et laissez les cellules se déposer. La densité des cellules dans la chambre doit être telle que des cellules individuelles non superposées puissent être facilement observées sur la plateforme d'acquisition de données.Veillez à ce que la chambre soit connectée au myo Pacer à l’aide des fils de connexion, puis commencez à régler la tension et la fréquence pour l’expérience. Choisissez une cellule qui bat à la fréquence correcte et déplacez-la dans l’ouverture de cadrage. Ajustez les dimensions de la caméra et de l’ouverture de cadrage afin que la cellule entière se trouve au centre de la fenêtre, orientée horizontalement avec les miroirs sarcoplasmiques visibles.Ensuite, placez la zone dans une région de la cellule contenant des sarcomères bien définis et ajustez la mise au point pour optimiser le pic du spectre de puissance. Ajustez également la luminosité du microscope pour optimiser la fenêtre de lissage bleue et les informations de contraste en noir. Activez le photomultiplicateur et commencez l'enregistrement.Une fois suffisamment de données enregistrées, cliquez sur pause pour arrêter temporairement l'enregistrement. Ne cliquez pas sur stop. Cela mettrait fin à l'enregistrement et aucun fond ne pourrait être enregistré pour cette cellule.Maintenant, sans modifier la mise au point ni les dimensions de la fenêtre de visualisation, déplacez la platine du microscope vers une zone de la lamelle où aucun cellule ni matériel cellulaire n'est visible. Cliquez ensuite sur « reprendre » pour enregistrer une mesure du fond. Une fois que suffisamment de données de fond ont été enregistrées, cliquez sur « arrêter » pour mettre fin à l'enregistrement.Ensuite, cliquez sur enregistrer le fichier pour sauvegarder toutes les traces de cette cellule dans un seul fichier ZPT. L'isolement de cardiomyocytes adultes donne des cellules quiescentes striées de forme allongée ; ces cellules ne présentent pas de battements spontanés. La flèche indique des cellules mortes arrondies, sans striations. Les cellules quiescentes peuvent être cultivées et transfectées avec un adénovirus afin de moduler l'expression génique. Après 24 heures de culture, la morphologie des cellules vivantes ne change pas.Ils restent tolérants au calcium et peuvent être stimulés par un champ électrique. Un rendement de 85 à 90 % de cellules viables est réalisable. Le système MM SIS a été utilisé pour mesurer la contractilité et le transitoire calcique des myocytes provenant d'une souris de type sauvage C57BL/6, simultanément.La mesure de la contractilité et de la gestion du calcium a été réalisée en mesurant le rapport entre les formes liées et non liées de la fura 2. Les mesures du rapport à 00 h 00 peuvent varier légèrement selon les dispositifs expérimentaux, mais les cellules saines affichent généralement un score compris entre 1,5 et 2,5. Afin d'analyser les données issues des tracés de contractilité et de calcium, les tracés ont été moyennés pour créer un tracé caractéristique pour chaque cellule. À l'aide d'un algorithme d'analyse de transitoire unique présent dans les paramètres du logiciel sys, des paramètres relatifs à la fonction systolique et diastolique ont été générés à partir des tracés caractéristiques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cardiomyocytes marins adultes individuels.

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