Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

L’objectif global de cette procédure est de récolter et de quantifier les bactéries traitables par fluorescence d’un hôte intermédiaire pour l’infection ultérieure des cellules hôtes de mammifères. Ici, Legionella mala exprimant la GFP sont utilisés pour infecter l’hôte naturel, le protozoaire, l’amibe, l’amibe, les monocouches castelliennes. Les el mala sont ensuite récoltés par lyse sélective et la concentration de bactéries est ensuite calculée à l’aide d’une formule basée sur la dilution par émission de fluorescence des protozoaires.

Les bactéries amorcées sont ensuite utilisées pour infecter les monocouches de cellules de mammifères. Enfin, le nombre de bactéries infectieuses dans les cellules de mammifères est déterminé à l’aide d’une combinaison de microscopie à fluorescence, de cytométrie en flux et de lysats de placage pour récupérer les unités formant des colonies. Les données résultantes démontrent un avantage pathogène acquis pour les bactéries qui ont été cultivées dans des cellules de protozoaires au stade de l’amorçage par rapport à la même souche qui a été cultivée dans un milieu artificiel.

Nous avons développé cette technique en observant que l’expression de facteurs de virulence particuliers chez les bactéries ne pouvait pas être induite par la seule culture in vitro. Les modèles d’infection typiques de monocouches de cellules cultivées utilisent des bactéries cultivées in vitro pour les légionelles et plusieurs autres bactéries. Les protéasomes fournissent un réservoir naturel pour la prolifération où la bactérie obtient un avantage pathogène.

La technique que nous allons décrire permet de quantifier les bactéries premières du protéasome afin de mesurer avec précision la contribution d’un facteur de virulence qui n’est produit que dans le cadre de la croissance intracellulaire. La démonstration de la procédure sera le bendon. Un assistant de recherche, Sam Renan, également assistant de recherche, et amri lama, un boursier postdoctoral, commencent cette procédure en utilisant l’électroporation pour transformer toutes les souches de L pneumophila utilisées dans l’essai avec le plasmide PAM 2 39, qui code pour la GFP inductible IPTG, incubent les bactéries pendant trois heures sur un agitateur à 37 degrés, en utilisant un propagateur de traînées de bactéries de chaque transformation sur une seule plaque et incuberont pendant 72 heures à 37 degrés Celsius.

Après trois jours, transférez une seule colonie de la souche bactérienne dans trois millilitres de milieu contenant un IPTG millimolaire, et cultivez pendant la nuit jusqu’à la phase stationnaire sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez 10 microlitres de la culture sur une lame de verre et appliquez une lamelle. Visualisez ensuite la lame au microscope pour confirmer l’expression de la GFP.

À l’aide d’un objectif 60x sous les filtres d’excitation et d’émission appropriés, de nombreux bâtonnets bactériens doivent être observés qu’un vert fluorescent pur, lorsqu’il est observé à l’aide du canal GFP du microscope, si toutes les bactéries sont fluorescentes, se prépare à infecter l’amobi en diluant une aliquote de 100 microlitres de chaque culture in vitro à un à 10 dans du H2O stérile. Faites un blanc en utilisant 100 microlitres Un milieu YE contenant un IPTG millimolaire 6,25 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 900 microlitres d’eau. Ensuite, effectuez des mesures de dilution OD 600 à l’aide d’un spectrophotomètre, en utilisant la formule fournie dans le document d’accompagnement.

Calculer le volume nécessaire pour infecter un puits à une multiplicité d’infection ou MOI de 20 pour chaque culture in vitro. 24 heures avant de commencer, les cultures liquides bactériennes remplacent le milieu dans les cultures ABI acan MEbA castellani. Le lendemain, prélevez et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Pour ce faire, délogez les cellules en tapotant le ballon et transférez un échantillon dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, mélangez une aliquote avec le colorant trian blue et chargez-la sur la lame du cytomètre hémologique. Après avoir compté les cellules au microscope optique, diluez l’amobi avec du milieu frais jusqu’à une concentration finale de 1 fois 10 à six cellules par millilitre à l’aide d’une graine de pipette répétée.

12 plaques de culture d’âme bien avec des aliquotes d’un millilitre de l’ABI incubées à température ambiante pendant la nuit. L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’infection robuste lors de l’étape d’amorçage. Pour ce faire, nous utilisons une pipette manuelle lors du lavage de l’amibe afin d’éviter toute perte.

Les amibes ne sont pas particulièrement adhérentes et peuvent être facilement perdues ou enlevées lors des étapes de lavage ou de remplacement des supports. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres et d’une pipette manuelle, laver trois fois les puits des plaques de culture cellulaire à 12 puits avec un millilitre de PBS stérile. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez un millilitre de milieu d’infection à chacun.

Ensuite, incubez les plaques à température ambiante pendant une heure. Ensuite, infectez chacun des puits à un MOI de 20 en ajoutant la suspension bactérienne au milieu d’infection dans chaque puits centrifugez la plaque à 400 fois G pendant cinq minutes. Après l’essorage, faites flotter l’assiette dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 18 heures. Après l’incubation, un microscope à fluorescence confirme l’infection après une étape d’amorçage réussie. 90 % des cellules hôtes doivent contenir de grandes VAE peuplées de bactéries exprimant la GFP qui apparaissent comme un croissant vert comme le montrent ces images fusionnées en contraste de phase et en fluorescence.

À l’heure actuelle, la plupart des cellules oculaires en castin ont atteint des charges bactériennes maximales, mais la lyse de la population est minime. Sous microscopie optique, l’amobi doit apparaître arrondi et détaché. Le point, une souche mutante qui ne peut pas supporter la translocation des effecteurs médiée par l’ICM, ne doit pas se développer dans un œil plâtré.

Par conséquent, une fluorescence minimale doit être détectée. L’amobi apparaîtra plat et la monocouche doit être intacte. La leucémie monocytaire aiguë humaine ou cellules THP one, qui servent de cellules cibles, aurait dû être préparée sur une plaque à 12 puits, comme décrit dans le document d’accompagnement.

Lavez les cellules THP trois fois avec du PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de RPMI 1640 frais avec 10 % FBS à chaque puits Incuber TP une cellule pendant une heure à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Pour préparer le lysat bactérien, aspirez le milieu de prime à Tobi.

Ensuite, pour les écorcher, ajoutez 500 microlitres de glace, de l’eau froide, stérile, ultra filtrée et mettez sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, tirez les lysats en fonction de la déformation. Tapez des tubes coniques de 15 millilitres pour déterminer la fluorescence totale.

Mesurer l’émission à 512 nanomètres pour chacun des lysats regroupés. À l’aide d’une plaque à 96 puits dans un lecteur de plaques de fluorescence, calculez une mesure OD 600 pour les lysats regroupés selon la formule. Dans le document d’accompagnement, utilisez les lysats d’amobi non infectés soumis aux mêmes conditions expérimentales que l’amibe infectée pour déterminer le fond de lysat

Ensuite, pour chaque pool de lysat, calculez le volume nécessaire pour infecter un puits de cellules cibles à un moment d’inertie de 20. Gardez les lysats sur de la glace pour limiter tout changement dans l’expression des gènes bactériens. Avant l’infection, dans les 30 minutes suivant la lyse, infecter trois puits de TP une cellule par condition au MOI calculé.

L’utilisation des lysats regroupés permet à l’ensemble des puits de ne pas être infectés, servant de contrôle négatif. Pour l’analyse cytométrique en flux. Centrifugez la plaque à 400 fois G pendant cinq minutes.

Après l’essorage, faites flotter l’assiette dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure, une heure après l’infection. Aspirez le milieu et lavez les puits trois fois.

Avec le PBS, ajoutez un millilitre de RPMI 1640 frais contenant 10 % de FBS dans les puits et remettez la plaque dans l’incubateur. Incuber les cellules TP one pendant 14 à 16 heures pour déterminer les niveaux d’infection à la fois au stade d’amorçage et au stade des infections cellulaires cibles. Imagez les puits infectés à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un grossissement de 10 x ou 20 x.

Ensuite, pour quantifier l’infection cellulaire cible par cytométrie en flux, la trypsine oculaire (trypsine) infectée (yeux trypsine) infectée (THP) infectée (THP) est appliquée à des cellules et les lave doucement des puits en les mélangeant à du PBS. À l’aide d’une pipette, tirez les cellules dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre, puis centrifugez-les à 1 800 fois G pendant deux minutes. Après l’essorage, remettre les granulés en suspension dans un millilitre de PBS essorage à nouveau à 1 800 fois G.Si après la suspension des granulés dans le PBS, les suspensions résultantes sont très troubles.

Ils doivent être dilués un à trois dans du PBS supplémentaire pour éviter l’obstruction des lignes du cytomètre en flux à l’aide de cellules cibles non infectées, tracer la diffusion vers l’avant sur un cytomètre en flux une fois réglé, collecter 20 000 événements au total pour chaque échantillon d’infection cellulaire cible à l’aide d’une excitation laser de 488 nanomètres et du canal FL un. Après avoir transféré les données vers un ordinateur distinct pour l’analyse, après la capture des populations de cellules afin d’exclure les cellules non infectées et de tracer l’intensité de la fluorescence dans un histogramme, comme indiqué ici, examinez l’efficacité de l’infection par placage UFC des cellules récoltées pour la cytométrie en flux. Préparez une dilution en série des échantillons dans de l’eau ultra filtrée à 10 puissance moins un, 10 à moins deux et 10 à moins trois plaque : 20 microlitres de chaque dilution sur un tiers de plaque A-C-Y-E-A avec 6,25 microgrammes par millilitre de chloramphénicol.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 72 heures après l’incubation. Comptez les colonies à l’aide d’un cure-dent et d’un compteur de cellules pour obtenir une population de bactéries amorcées par des protozoaires. Souches sauvages de type L induites à exprimer la GFP.

Ils ont été utilisés pour infecter une monocouche castellienne pendant 18 heures à un moment d’inertie de 20. Les bactéries exprimant la GFP ont ensuite été utilisées pour réinfecter l’amobi dans une infection au stade cellulaire cible afin de comparer les bactéries amorcées par les protozoaires avec les bactéries cultivées in vitro. Une monocouche de castella a été incubée.

18 heures à un moment d’inertie de 10 : comme on peut le voir sur ces micrographies, les bactéries amorcées par les protozoaires présentent un avantage pathogène significatif par rapport aux bactéries cultivées in vitro au même moment d’invocation pour quantifier l’infection des macrophages cellulaires cibles à l’aide de protosomes et de bactéries amorcées. Les macrophages THP différenciés par PMA ont été infectés par une pneumophile sauvage de type L prélevée à partir du protéasome et de l’infection au stade d’amorçage pendant 14 heures. Une cytométrie en flux a ensuite été effectuée pour quantifier l’infection, comme on le voit ici.

Le décalage de fluorescence vers la droite est une mesure du nombre total de cellules infectées dans la population. L’intensité croissante du signal fluorescent peut être corrélée avec le nombre de bactéries par macrophage : la fluorescence du TP non infecté, un macrophage est représenté en rouge et la fluorescence des cellules infectées est indiquée en vert. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en environ deux semaines au total si tout est exécuté avec précision.

N’oubliez pas que cette procédure est importante pour ne pas perturber le protéasome et la monocouche. L’utilisation d’une pipette manuelle pendant vos étapes de lavage aidera à augmenter le rendement de vos infections amorcées. N’oubliez pas que travailler avec des légionelles peut être dangereux.

Prenez donc des précautions telles que prévenir la production d’aérosols lors de cette procédure.