Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser la dynamique du calcium directement dans la lumière du réticulum endoplasmique des cellules vivantes. Ceci est réalisé en transduisant les cellules avec le colorant induit par l’estérase ciblée ou la construction du vecteur TED pour surexprimer l’estérase de carbox CS deux dans le réticulum endoplasmique. Ensuite, les cellules sont incubées avec l’indicateur d’ester méthylique acéto de calcium grippe oh cinq NA, qui se diffuse à travers les membranes plasmiques et RE.

Ensuite, la carboxylestérase se cvine. Le groupe ester libère l’indicateur sensible au calcium dans le re. Des complexes de calcium fluorescent et de lumière se forment.

On obtient des résultats qui montrent des changements dans la concentration de calcium libre dans le RE sur la base de l’imagerie de cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la régulation de l’homéostasie calcique cellulaire. Les signaux calciques sont le plus souvent surveillés dans le cytosol, il est donc difficile de distinguer où le calcium s’écoule dans le cytosol à partir de l’espace extracellulaire ou de la réserve intracellulaire de calcium du RE.

Pour pallier cette limitation, nous avons développé un téléchargement ciblé induit par l’estérase. Avec cette méthode, le calcium libéré par le RE est surveillé directement. L’approche n’est pas perturbatrice.

La membrane plasmique reste intacte et les cascades de signalisation intracellulaire sont préservées. En général, les individus auront du mal parce qu’ils ont besoin d’expérience. Dans l’expression vectorielle TED, nous avons développé des constructions vectorielles exprimant une protéine cent fusionnée à la Carboxylase CES deux.

Cela nous permet d’identifier facilement les cellules appropriées pour l’imagerie calcique AR au cours des expériences, qui seront des cellules caractérisées par une forte fluorescence rouge et une fluorescence indicatrice de calcium modérée à forte. Ces marqueurs fluorescents doivent être répartis uniformément dans tout le réticulum endoplasmique et sont absents dans la région nucléaire. Avant de commencer.

Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel ou un LCR et une grippe oh cinq NAM selon le protocole de texte. Préchauffez le LCR A à température ambiante et ajoutez-y du glucose profond, aérez le LCR A avec du carbogène pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite une solution mère molaire de chlorure de calcium et de chlorure de magnésium à des concentrations finales de deux millimolaires chacune.

Après avoir démarré le microscope d’imagerie en direct et le programme informatique, commencez la profusion sur une chambre d’imagerie factice et équilibrez le système de tubes, préchauffez le réchauffeur de solution en ligne et la chambre d’imagerie sur la platine du microscope et équilibrez le système à 32 à 37 degrés Celsius. Avant de commencer la procédure de téléchargement pour charger le colorant dans les cellules, ajoutez 100 microlitres de LCR A préchauffé à une aliquote de 0,5 microlitre de grippe millimolaire ou cinq NAM, et solubilisez la solution dans un sonicate de bain-marie pendant 90 secondes, transférez 400 microlitres de solution d’imagerie préchauffée dans un puits d’une plaque à quatre ou 24 puits. Ajoutez la solution D dans le même puits pour produire 500 microlitres d’une solution à cinq micromolaires.

Ensuite, placez soigneusement une lamelle avec des cellules dans le puits d’incubation pendant une période de temps appropriée Dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, le temps de chargement DI et la concentration D dépendent du type de cellule, de la densité cellulaire et des besoins spécifiques des expériences. De longues durées d’incubation peuvent endommager les cellules, en particulier les nuances primaires et les cellules gliales, ce qui est essentiel pour la réponse aux stimuli physiologiques. Une incubation de plus de 30 minutes ne sera utile que pour les expériences de localisation du calcium du RE afin d’étudier la distribution du calcium du RE dans de petits microdomaines, par exemple, les MUE des épines. Immédiatement après l’incubation, transférez la lamelle de couverture dans un autre puits de culture cellulaire contenant une solution d’imagerie.

Pour préparer le montage des cellules dans la chambre d’imagerie, utilisez un pinceau pour appliquer de la graisse sous vide poussé sur la chambre d’imagerie. Nous utilisons des chambres d’imagerie fabriquées par nos soins pour des lamelles de recouvrement de 10 à 12 millimètres avec un petit volume, permettant ainsi des vitesses de perfusion élevées allant jusqu’à 15 fois par minute d’échange de tampon. Ramassez la fiche de couverture avec la grippe oh cinq et les cellules chargées et ajoutez une petite goutte de solution d’imagerie pour la garder humide.

Ensuite, retournez la lamelle et montez les cellules dans la chambre d’imagerie. À l’aide d’un coton-tige, enfoncez la lamelle dans la colle silicone et essuyez le tampon résiduel du bas de la lamelle en verre. Ensuite, remplacez la chambre d’imagerie factice par la chambre d’imagerie expérimentale.

Lavez les cellules pendant cinq à 10 minutes par perfusion continue pour la sélection des cellules. Utilisez une quantité minimale d’éclairage laser pour éviter le photoblanchiment rapide de la grippe oh cinq et du calcium deux dans le RE, une fréquence de balayage élevée de deux à quatre hertz, une petite taille d’image et un gain élevé configuré au microscope. Selon l’expérience de la plante.

Au début de l’expérience, documentez la distribution cellulaire de l’étiquette de la grippe et du calcium et l’étiquette fluorescente rouge de la construction de la carbox rouge cel esterase. Dans la cellule qui vous intéresse ici, des neurones représentatifs par des piles d’images X, YZ à haute résolution effectuent une imagerie XYT pour surveiller la dynamique du calcium du RE dans des conditions expérimentales spécifiques. Les paramètres typiques de notre système sont énumérés dans le tableau deux du protocole textuel Surveiller les changements de calcium RE sous perfusion continue avec solution d’imagerie Les taux d’échange de tampon sont de 1,5 millilitre par minute pour le lavage cellulaire et l’épuisement des réserves en bloquant le réticulum endoplasmique sarco calcique, deux a TPA et trois millilitres par minute pour la stimulation par un TP et un DHPG et un agoniste pour le récepteur métabotropique du glutamate.

Ici, les cellules gliales sont stimulées avec 200 micromolaires A TP pendant 10 secondes. Pour traiter les images, ouvrez la pile d’images dans le programme Image J pour l’imagerie multicolore. Divisez les canaux RBG lorsque le logiciel vous le demande.

Identifiez les régions d’intérêt. Selon l’objectif, dessinez des régions d’intérêt autour de l’ensemble du RE ou de petites régions du RE. Utilisez le plug-in d’analyse de séries chronologiques pour lire l’intensité moyenne des pixels dans une région d’intérêt.

Calculez les changements relatifs corrigés du bruit de fond en fluorescence par delta F sur F zéro à l’aide de cette formule. Présentez les changements relatifs de fluorescence sous forme de trace avec delta F sur F zéro pour l’axe Y et le temps pour l’axe X. Sur cette figure, les astrocytes corticaux des cellules A et les neurones de l’hippocampe expriment un vecteur TED fluorescent rouge et sont marqués avec l’indicateur de calcium de faible affinité.

Grippe oh cinq N.Le complexe indicateur de calcium fluorescent est localisé dans le réticulum endoplasmique de tous les types de cellules. Cette figure montre la grippe à cinq cellules gliales marquées N. Au cours du traitement CIN, un marquage cytosolique brillant est observé si la membrane plasmique d’une cellule est endommagée avant et après le traitement CIN.

Cela révèle que la grippe oh cinq N est également libérée dans le cytosol par des estérases endogènes. Dans cette expérience, après le marquage TED avec la grippe, la déplétion en calcium de cinq ans de neurones de l’hippocampe en culture est causée par l’acide cyclonique circa bloquant. Notez que l’énorme changement de densité de fluorescence moyenne par région d’intérêt qui est observé ici est une série de laps de temps avec des cellules GL cortico de souris qui sont stimulées avec un TP. Simultanément, la fluorescence de la protéine fluorescente rouge diminue légèrement en raison des diagrammes de blanchiment de l’ardoise montrant le changement de l’intensité de la fluorescence au fil du temps dans certaines expériences, mais pas toutes.

Les valeurs de fluorescence ne reviennent pas aux niveaux d’intensité de fluorescence initiaux car certains complexes de cinq N sont perdus lors de la stimulation. Ce film montre une cellule BHK 21 infectée par la carboxylase à haute résolution marquée par la grippe et stimulée par un TP. Notez qu’une libération de calcium induite par TP et un remplissage des réserves de calcium ER sont visualisés dans les structures fines des tubules RE. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que seules les cellules parfaitement saines présentent des réponses physiologiques au calcium.

Nous recommandons donc d’effectuer une série d’expériences interdépendantes sur l’homéostasie calcique en une journée avec le même lot de cellules. D’après notre expérience, la grippe colorante de cinq N fonctionne le mieux, mais cet indicateur de calcium n’est pas très résistant aux brèches. Par conséquent, cette méthode bénéficiera du développement d’indicateurs de calcium de faible affinité plus résistants à l’eau de Javel.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager le calcium E transitoire avec des indicateurs de calcium synthétiques de faible affinité. Ces indicateurs vous permettent de suivre la dynamique du calcium avec une haute résolution temporelle. Pour cette raison, notre méthode peut être bénéfique pour l’étude des cascades de signalisation calcique impliquées dans la plasticité synaptique et pour surveiller les changements dans l’homéostasie calcique dans des modèles cellulaires pour les maladies neurodégénératives.