Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser l’interaction typique entre les plaquettes et les neutrophiles sur l’endothélium activé au cours d’une maladie vasculaire. Ceci est réalisé par microscopie intra-vitale à fluorescence en temps réel chez des souris vivantes pour visualiser la microvascularisation dans le muscle crémaster. Dans un deuxième temps, des anticorps marqués par fluorescence sont perfusés et une inflammation ou une lésion oculaire est initiée pour faciliter la visualisation directe des interactions typiques des plaquettes neutrophiles qui en résultent.

Ensuite, les données sauvegardées sont analysées afin de quantifier le nombre de cellules et leur dynamique. En fin de compte, les interactions typiques directes entre les plaquettes et les neutrophiles sur l’endothélium activé peuvent être évaluées sur la base du signal fluorescent des anticorps perfusés en microscopie intravitale en temps réel. Notre technique microscopique intravitale peut fournir un aperçu des interactions en temps réel entre les plaquettes et les neutrophiles sur l’endothélium activé pendant l’inflammation vasculaire et la formation de thrombus.

Cette technologie peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’évaluation des interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules sanguines. Avant de commencer l’expérience, allumez le système de microscope pour le modèle d’inflammation vasculaire. Injection intra growly miroir du TNF alpha trois heures avant l’injection IP des anesthésiques.

Une fois que la sédation a été confirmée par pincement des orteils, canulez un tube PE 90 dans la trachée de la souris pour éliminer toute difficulté respiratoire. Ensuite, canulez un tube PE 10 dans la veine jugulaire gauche pour la perfusion d’anticorps marqués par fluorescence et d’anesthésiques supplémentaires. Ensuite, tirez doucement et incissez horizontalement la peau du scrotum et utilisez un tampon de préchauffage sur le champ chirurgical.

Maintenant, en appuyant sur le bas-ventre avec une pince, retirez soigneusement un testicule avec l’autre pince de la taille d’une pince, la voiture maître le muscle verticalement et aplatit le muscle sur un couvercle en verre sur un plateau de microscope intra-flacon en épinglant le tissu périphérique au plateau. Commencez cette étape en injectant d’abord des anticorps conjugués DITE 4 88 rat, anti souris CD 42 C et Alexa floor 6 47 conjugués anti souris GR one à travers la canule jugulaire préalablement réglée. Ensuite, dans le jeu de filtres du microscope, cochez la case des canaux qui seront exposés et réglez le temps d’exposition pour chaque capture time-lapse sélectionnée.

Pour définir le nombre de points temporels sur 1000 à 1500 avec un intervalle de 200 millisecondes pour un temps écoulé total de cinq minutes. Une fois que tous les paramètres ont été définis dans la capture d’image, sélectionnez Démarrer pour commencer la capture à un grossissement de 60 x avec une fenêtre de 157 micromètres sur 118 micromètres. Surveillez les plaquettes dominantes et adhérentes dans les neutrophiles pendant cinq minutes dans la moitié supérieure d’un lieu de crémaster enflammé.

Pour analyser la formation du thrombus plaquettaire, allez dans masque et sélectionnez créer. Ensuite, sous l’outil de sélection dans la vue principale, cliquez sur la grande icône en forme de crayon. Utilisez le crayon pour colorier une région à l’extérieur du récipient dans la vue principale.

Pour définir un masque d’arrière-plan, allez dans masque, cliquez sur copier ce plan, cliquez sur copier le masque. Dans Point temporel actuel, sélectionnez tous les points temporels et cliquez sur OK. Pour calculer le signal d’arrière-plan, allez dans statistiques et cliquez sur statistiques de masque.

Ensuite, dans la portée de l’image, cliquez sur le time-lapse 2D actuel, ou sur quatre images D dans la portée du masque, sélectionnez le masque entier dans les fonctionnalités. Sous la date de capture, sélectionnez temps écoulé. Sous la géométrie de morphing, sélectionnez la zone en pixels et sous l’intensité, sélectionnez l’intensité maximale.

Cliquez maintenant sur Exporter. Ouvrez le fichier texte dans un tableur et calculez la valeur moyenne du signal de fond tout au long de la période d’enregistrement. Déterminer l’intensité de fluorescence de fond.

Après avoir calculé l’intensité de la fluorescence de fond pendant le thrombus plaquettaire, comme cela vient d’être démontré dans le modèle d’inflammation ularique, allez dans le masque, cliquez sur le segment, sélectionnez ajuster e et canal, et insérez la valeur moyenne du signal de fond sur un clic faible pour appliquer et d’accord. Allez ensuite dans les statistiques et cliquez sur Statistiques de masque. Maintenant dans la portée de l’image, cliquez sur le time-lapse 2D actuel ou sur quatre images D dans la portée du masque, sélectionnez le masque entier dans les fonctions sous la date de capture, sélectionnez le temps écoulé sous la géométrie de morphing, sélectionnez la zone en pixels et sous l’intensité, sélectionnez une certaine intensité.

Cliquez ensuite sur Exporter. Ouvrez le fichier texte dans le tableur et calculez l’intensité de fluorescence du thrombus plaquettaire. Pour analyser la thrombose artérielle, commencez par perfuser des anticorps anti-souris conjugués DITE 4 88 CD 42 C ANDOR 6 47 anti souris conjugués GR one comme nous venons de le démontrer.

Après avoir cliqué sur Démarrer pour lancer le processus de capture d’image, double-cliquez sur un point situé à deux ou trois micromètres à l’intérieur de la paroi du récipient pour déclencher le laser. La lésion des cellules endothéliales artériolaires provoque un changement de forme visuelle qui devrait être apparent dans l’image en fond clair, suivi d’une accumulation de plaquettes. Cinq minutes après la blessure causée par le laser, faites une pause et annulez la capture.

Par la suite, commencez une capture avec 2 400 points temporels avec un intervalle de 500 millisecondes pour enregistrer les plaquettes adhérentes et les neutrophiles en roulement et adhérents pendant 20 minutes. Après avoir calculé l’intensité de la fluorescence de fond pendant le thrombus plaquettaire de la même manière que dans le modèle d’inflammation ulaire, allez dans le masque, cliquez sur le segment, sélectionnez fite et canal et insérez la valeur moyenne du signal de fond sur le clic bas pour appliquer et ok. Maintenant dans le champ d’image, cliquez sur le time-lapse 2D actuel ou sur les images 40D dans le champ de masquage, sélectionnez le masque entier dans les fonctions sous la date de capture, sélectionnez le temps écoulé sous Morpho, sélectionnez la zone en pixels et sous Intensité, sélectionnez une certaine intensité.

Cliquez ensuite sur Exporter. Ouvrez le fichier texte dans le tableur et calculez l’intensité de fluorescence du thrombus plaquettaire. Pour quantifier le roulement et l’adhérence des neutrophiles, jouez au time lapse et comptez le nombre de cellules qui se retournent visiblement.

Le thrombus plaquettaire sur 20 minutes de roulement est défini comme une diminution de la vitesse des neutrophiles lors de l’interaction avec le thrombus plaquettaire pendant au moins deux secondes. Les neutrophiles adhérents sont définis comme tous les neutrophiles qui restent attachés au thrombus plaquettaire pendant au moins deux minutes. Ici, des images représentatives de l’apparition de signaux fluorescents associés aux neutrophiles en rouge et aux plaquettes en vert.

Lors de l’inflammation oculaire est montrée, la flèche indique la direction du flux sanguin dans le vaisseau. Le nombre de neutrophiles roulants et adhérents sur les cellules endothéliales enflammées a été déterminé à 0,25 cellule par minute et 18,5 cellules par cinq minutes respectivement. Les données sont représentatives de la moyenne plus ou moins l’erreur-type de la moyenne de 30 E différents chez quatre souris de type sauvage.

Ici, le signal fluorescent intégré médian des plaquettes est tracé en fonction du temps. Il a été constaté que la plupart des plaquettes en rouge adhèrent aux neutrophiles adhérents et rampants en vert plutôt qu’à la paroi du vaisseau enflammé. Passons maintenant aux interactions plaquettaires des neutrophiles à la suite d’une lésion artériolaire induite par laser.

Ces images illustrent un seul neutrophile en rouge et indiqué par la flèche jaune roulant sur le thrombus plaquettaire en vert avec un deuxième neutrophile en rouge et indiqué par la flèche blanche roulant rapidement sur les cellules endothéliales artériolaires, les deux sur un intervalle de capture de cinq secondes ici, un seul neutrophile à nouveau en rouge est montré en train de rouler et d’adhérer à un thrombus plaquettaire en vert sur un intervalle de 15 secondes. La pointe de la flèche identifie les neutrophiles qui roulent et un neutrophiles adhérents et l’épaisse flèche grise indique la direction du flux sanguin. Ici, le signal fluorescent intégré médian des plaquettes est tracé en fonction du temps.

Le nombre de neutrophiles roulants et adhérents a été déterminé à 21,5 et 1,6 cellules sur 20 minutes respectivement. Le roulement rapide initial des neutrophiles s’est produit sur les cellules endothéliales. Une fois que les neutrophiles sont entrés en contact avec le thrombus plaquettaire, la vitesse de roulement des neutrophiles sur le thrombus plaquettaire a été modifiée avec une plage de 8,2 micromètres par seconde et est médiée par l’interaction de la pectine et du psgl L one.

Les données sont représentatives de la moyenne plus ou moins, l’erreur type de la moyenne de 14 thrombus différents chez sept souris de type sauvage cinq minutes après une blessure au laser. La taille du thrombus plaquettaire reste relativement constante pendant l’imagerie, et les neutrophiles roulent sur le thrombus et y adhèrent. Le signal fluorescent des plaquettes en circulation est négligeable.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration du système de microscope intravital avec des souris vivantes, ce qui vous permettra de visualiser en temps réel les interactions hétérotypiques entre les plaquettes et les neutrophiles sur l’endothélium activé au sein de la microvascularisation.