Name: In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Apprenez à évaluer la pathogénicité des mutations humaines in vivo en utilisant des embryons de zebrafish Danio rerio. Cette méthode permet une analyse génétique à haut débit pour étudier les troubles du développement.

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Nous reconnaissons l&#39;appui de Summer Research Fellowship d&#39;un Duke University Dean (AN), l&#39;American Heart Association (AHA) bourse 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) des subventions R01-EY021872 du National Eye Institute (EED), R01HD04260 de l&#39; Institut national de la santé infantile et le développement (NK), R01DK072301 et R01DK075972 de l&#39;Institut national de la Digestive du diabète et des troubles rénaux (NK), et l&#39;Union européenne (Financé par l&#39;UE 7 e PC sous AG nr 241955, projet SYSCILIA;. EED, NK) NK est un éminent Jean et George W. Brumley professeur.

1. Bioinformatique Analyse <ol><li> Déterminer si le gène humain d&#39;intérêt a un orthologue poisson zèbre, et si oui, combien de copies. Nous recommandons BLAST réciproque ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ) de la protéine humaine contre génome du poisson zèbre, et BLAST ultérieure du meilleur poisson-zèbre frapper contre le génome humain. Vrai orthologues sera le meilleur succès dans chaque cas. </li><li> Déterminer la taille de la phase ouverte de lecture (ORF) du gène humain. Si plus de 6 kb, ce modèle est intraitable à l&#39;heure actuelle en raison des limitations de haute qualité dans la transcription in vitro de longues modèles. </li><li> Obtenir ou générer une construction contenant l&#39;ORF humains dans le pCS2 + squelette du vecteur (ou vecteur équivalent avec un 5 &#39;SP6 site de transcription et 3 «signal polyA). </li><li> Concevoir un MO pour bloquer l&#39;épissage ou la traduction du gène de poisson zèbre ciblée. Si plusieurs copies existent dans le génome du poisson zèbre, there sont deux options: a) la conception d&#39;OM supplémentaire, ou b) l&#39;identification d&#39;un site d&#39;épissage entièrement conservée entre copies contre lequel un seul MO peuvent être efficaces. Certaines séquences MO publiés sont disponibles à <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a> . </li></ol> 2. analyse de l&#39;expression dans l&#39;embryon de poisson zèbre développement <ol><li> Déterminer si le poisson zèbre orthologue est exprimé dans un contexte spatio-temporel pertinent pour la lecture phénotypique. S&#39;il n&#39;y a pas de données d&#39;expression sont disponibles pour le gène d&#39;intérêt, effectuer la transcription inverse (RT)-PCR en utilisant l&#39;ADNc à partir de l&#39;ensemble des embryons de poisson zèbre ou l&#39;hybridation in situ. (Voir 2,3). </li></ol> 3. Mutagenèse dirigée <ol><li> Concevoir des amorces de mutagenèse 25-45 bases de longueur, avec la mutation désirée dans le centre. La température de fusion de l&#39;amorce doit être supérieure ou égale à 78 ° C. Concevoir une amorce de mutagenèse avant et arrière pour recuire à facebrins du plasmide. </li><li> Amorces pour obtenir confirmation de la séquence de l&#39;ORF post-mutagenèse, qui devraient tuile à travers environ 300 sections de paires de bases pour couvrir l&#39;ensemble de l&#39;ORF. </li><li> Monter la réaction de mutagenèse d&#39;une polymérase haute fidélité et le cycle qui suit (1: 95 ° C 30 sec, 2: 95 ° C 30 sec, 3: 55 ° C 1 min, 4: 68 ° C 6 minutes, 5: Go à 2 x18, 6: 4 ° C pour toujours, 7: fin). </li><li> Ajouter 1 ul endonucléase de restriction DpnI par réaction d&#39;enlever barrage modèle méthylé; incuber à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Transformer 2 pi de réaction de mutagenèse en 20 cellules compétentes ul selon des protocoles standards. </li><li> Choisissez 3-4 colonies et inoculer 5 ml de milieu LB contenant de l&#39;antibiotique approprié. Agiter à 37 ° C pendant la nuit à 225 rpm. </li><li> ADN Miniprep et déterminer la concentration. </li><li> Séquence du site de mutation pour confirmer la présence de la mutation d&#39;intérêt. </li><li> Toute la séquence de l&#39;orf pour confirmer l&#39;intégrité de la séquence. </li></ol> 4. ARNm transcription in vitro en <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un linéarisé pCS2 + modèle, générer des ARNm coiffé en utilisant le kit SP6 mMachine mMessage (Ambion). Nous vous recommandons d&#39;utiliser la moitié des quantités de composants de la réaction. </li><li> Purifier l&#39;échantillon d&#39;ARN avec des précipitations LiCl ou phénol-chloroforme comme décrit dans les instructions du kit. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ARNm en utilisant l&#39;absorbance, d&#39;assurer l&#39;intégrité de l&#39;ARNm par électrophorèse sur gel, et stocker l&#39;échantillon en trois ou plusieurs portions à -80 ° C jusqu&#39;au moment de son utilisation. Nous ne recommandons pas de multiples cycles de gel-dégel des portions d&#39;ARNm. </li></ol> 5. Essai in vivo de la variante Perte fonctionnelle <ol><li> Obtenir des embryons de poisson zèbre à partir de croisements de poisson zèbre naturelles, et de les maintenir à 28 ° C dans l&#39;eau de l&#39;embryon dans 6 ou 10 plats cm. </li><li> Réaliser une courbe dose-réponse morpholino d&#39;évaluer la spécificité du phénotype, l&#39;efficacité et la toxicité MO MO. Injecter une courbe de dosage d&#39;autrois concentrations moindres différents entre 1-10 ng MO dans 50-100 (stade de la cellule 1-4) poisson zèbre embryons / batch. OM efficaces devraient donner lieu à une augmentation dose-dépendante de la proportion d&#39;embryons affectés dans un lot. </li><li> embryons phénotypiques au stade de développement approprié basé sur l&#39;expression du gène de poisson zèbre ciblée d&#39;intérêt et le stade auquel un phénotype pertinent sera observée. Cela peut être soit quantitative (comme une mesure entre les structures anatomiques) ou qualitative (basée sur des critères phénotypiques standardisés). Pour toutes les injections ont marqué&gt; 24 HPF: embryons doivent être traités avec PTU (0,003% 1-phényl-2-thiourée dans les médias d&#39;embryons) à 24 HPF pour réduire au maximum la formation des mélanocytes. </li><li> Pour épissure-blocage OM, tester l&#39;efficacité MO par extraction de l&#39;ARN total de l&#39;ensemble embryon lysats au point de marquer phénotypique de temps, générer et diriger ADNc par RT-PCR du gène cible en utilisant des amorces flanquant le site cible MO. </li><li> Pour vérifier l&#39;effic de suppressioniency d&#39;un TB-MO, récolte lysats protéiques de l&#39;embryon et de mener des immuno pour comparer les niveaux de la protéine par rapport à un contrôle ciblé. Cependant, cette approche ne se prête pas à tous les gènes cibles parce qu&#39;il ya une réactivité croisée limitée pour de nombreux anticorps commerciaux aux protéines de poisson zèbre. Deux méthodes indirectes de montrer MO spécificité, notamment: a) démontre qu&#39;il existe un effet dose-dépendant sur le phénotype, et b) montrant que la co-injection de l&#39;ARNm de type sauvage avec TB-MO sauve le phénotype efficacement. Pour ces raisons, nous recommandons un bloqueur d&#39;épissure lorsque cela est possible parce que l&#39;efficacité peut être contrôlé directement. </li><li> Si un phénotype est observé passez à l&#39;étape 5.7, si aucun phénotype est observé passez à l&#39;étape 6.1. </li><li> Pour phénotypes qualitatifs, sélectionnez une dose MO où 50-75% des embryons sont touchés, car phénotypes quantitatifs, sélectionnez une dose MO dans lequel la mesure phénotypique est significativement différente de type sauvage (p &lt;0,001). Injecter de nouveaux lots de poisson zèbre embryô (étape 4.1 de cellules, n = 50-100/batch) avec un cocktail contenant la dose &quot;d&#39;essai&quot; de la MO et une courbe de dosage de l&#39;ARNm de WT humaine (variant de 10 à 200 pg de l&#39;ARNm; ces doses assurer surexpression substantielle au-dessus la base d&#39;une seule transcription, soit 0,25-0,5% de l&#39;ARNm total polyA dans un embryon de poisson zèbre). 4 </li><li> Mener notation masqué des lots d&#39;injection; choisir la dose de l&#39;ARNm WT avec le sauvetage le plus important par rapport à MO seul, c&#39;est la dose »de dosage&quot; de l&#39;ARNm. </li><li> Injecter de nouveaux lots (stade de la cellule 1-4, n = 50-100/batch) avec la dose d&#39;essai de MO et de la dose d&#39;essai de l&#39;ARNm humain mutant. embryons phénotypiques au stade approprié et comparer les résultats à WT sauvetage de l&#39;ARNm humain à l&#39;aide d&#39;un test statistique approprié (t-test ou chi-carré). Voir la Figure 1 pour les résultats et passez à l&#39;étape 7. Injecter les doses d&#39;essai de WT et de l&#39;ARNm mutant seul à contrôler les effets de la toxicité de l&#39;ARNm. </li></ol> 6. Essai in vivo de la variante Dominante négative ou Gain des effets de fonction <ol><li> Si aucune perte de fonction phénotype est observé (étape 5.5) ou si l&#39;ARNm mutant donne lieu à des phénotypes pas significativement différentes de MO seul (étape 5.7), injecter une courbe de dosage allant de 10 à 200 pg WT ARNm humain (nous recommandons 25, 50 , et 100 pg comme un test initial) en lots d&#39;embryons (stade 1-4 cellulaire; 50-100 embryons / lot). </li><li> Au stade approprié (voir 5.3 ci-dessus), effectuer score phénotypique, et de déterminer la dose la plus élevée à laquelle il n&#39;y a pas un nombre statistiquement significatif d&#39;embryons morts et / ou affectées par rapport aux contrôles non-injecté. Il s&#39;agit de la dose &quot;d&#39;essai&quot;. </li><li> Injecter la dose d&#39;essai de l&#39;ARNm humain mutant (stade 1-4 cellulaire; 50-100 embryons / lot). embryons phénotypiques et comparer les résultats à la notation de la dose d&#39;essai de l&#39;injection d&#39;ARNm humain WT ou la concentration MO de dosage. Voir la Figure 1 pour les résultats. </li><li> Si les résultats sont indiscernables de MO, titrer ARNm mutant humain avec l&#39;ARNm WTet comparez-WT humaine et injections d&#39;ARNm mutant. Amélioration des phénotypes avec des lots ARNm injectés mutantes ainsi WT indique un dominant négatif. Aucune amélioration indique un gain de fonction. </li></ol> 7. Reproduire des résultats des essais in vivo <ol><li> Répéter les essais in vivo d&#39;un minimum de trois fois. </li></ol> 8. Intégrer poisson zèbre Données de pathogénicité in vivo avec autres sources de données <ol><li> Comparer les données de pathogénicité obtenus à partir d&#39;expériences de poisson zèbre à: données génétiques au sein d&#39;un pedigree (le cas échéant), les données de fréquence de la population de contrôle, des études in vitro (tests basés sur les cellules de la stabilité des protéines, la localisation cellulaire, sortie de signalisation ou l&#39;activité enzymatique). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les méthodes décrites ici représentent un protocole général applicable à l&#39;analyse des changements non synonymes associés à une variété de phénotypes de maladies génétiques humaines (tableau 2, figure 3). Nos approches se sont révélées utiles pour évaluer l&#39;impact potentiel de variation sur les phénotypes de la maladie, et d&#39;aider à disséquer les mécanismes des maladies (telles que la contribution des mutations dominantes négatives au syndrome de Bardet-Biedl, une maladie récessive autosomique principalement 17). À ce jour, grâce à l&#39;élaboration de l&#39;arbre de décision présenté, nous avons modélisé au coût et délai raisonnable au-delà de 200 gènes causalement liés à des troubles génétiques, à un excès d&#39;allèles 1000. Bien que n&#39;étant pas discuté en détail ici, nous avons également montré que ces méthodes sont appropriées pour modéliser d&#39;autres types de lésions génétiques, comme copie variation du nombre de copies (CNV), ainsi que et génétique des interactions. Les analyses de ces événements sont au-delà de la portée dela présente description de la méthode, même si elles reposent fondamentalement sur le même principe du test systématique des gènes candidats (y compris les paires de gènes injectés simultanément) afin de déterminer l&#39;induction ou l&#39;exacerbation des phénotypes cliniquement appropriées. Par exemple, pour élucider lequel des 29 gènes dans le 16p11.2 CNV pourrait être pertinent à la microcéphalie observée chez les patients ayant des duplications d&#39;un segment génomique 660 kb, les ARNm correspondant à chacun des 29 gènes dans le secteur ont été injectés et la tête mesures de taille ont été réalisées à 2 DPF et 5 DPF, révélant une contribution majeure d&#39;un seul transcrit, KCTD13. 21 En outre, nous avons utilisé ce modèle pour les interactions génétiques d&#39;analyse de lésions génomiques chez les patients ayant à la fois le syndrome de Bardet-Biedl et la maladie de Hirschsprung. 22 En comparaison de MO suppression des gènes causaux des deux identités cliniques séparément et simultanément, nous avons pu identifier le phénotype résultant de being Une interaction synergique plutôt que de simplement la gravité de l&#39;additif. Malgré avoir établi une sensibilité élevée (98%) et la spécificité (&gt; 82%) pour les variantes qui contribuent à ciliopathies 17, nous n&#39;avons pas encore suffisamment de données pour déterminer si elles sont généralisables à tous les indicateurs phénotypiques dans les modèles de poisson-zèbre. Pour ce faire, un grand nombre d&#39;allèles, prédit génétiquement pour être bénignes ou pathogènes, doivent être testés dans chaque catégorie phénotypique. Cela sera particulièrement important pour la mise en œuvre de ces tests en milieu clinique, dans laquelle l&#39;interprétation fonctionnelle de VUSs peut informer diagnostic et le traitement seulement si une compréhension solide de faux positifs et de faux négatifs peut accompagner la livraison des résultats aux médecins et aux patients. Néanmoins, ces méthodes peuvent contribuer de manière significative à une meilleure compréhension du paysage de maladies génétiques humaines. Nous prévoyons que ces modèles ne seront pas seulement servir de fondationdation pour une meilleure interprétation de l&#39;information génétique clinique, mais également être utilisé comme des modèles utiles pour mener écrans thérapeutiques. données in vivo peut également être comparé à in silico des prédictions informatiques provenant de sources telles que PolyPhen 23, tamiser 24 SNPs &amp; GO 25, ou MutPred 26 pour montrer concordance. A noter que dans une étude précédente de prédiction bases de données SNP &amp; GO et MutPred ont été jugées les plus précis, avec une précision atteignant seulement 0,82 et 0,81, respectivement 27. Bien que nous ayons décrit la robustesse de ces méthodes pour un sous-ensemble de défauts anatomiques pédiatriques (tableau 2, figure 3), certains phénotypes sont moins dociles par ces méthodes. Certaines exceptions nonobstant, il ya trois grandes catégories de troubles ne se prêtent pas à notre protocole. Troubles à l&#39;âge adulte (comme la maladie de Parkinson) représentent un défi pour modèle dans un système embryonnaire. Ralentissez progression phénotypes dégénératives (comme la démence fronto-temporale) peuvent nécessiter plus de temps que la fenêtre du DPF sept activité MO pour produire un phénotype. D&#39;autres technologies de knockdown de gènes tels que l&#39;ARNi et siRNA sont disponibles pour interférer ou dégrader le gène cible, mais il a été démontré qu&#39;aucun n&#39;est aussi précis, stable, non toxique, ou de longue durée comme OM 28, ce qui limite aussi le calendrier pour le phénotypage. Troisièmement, certaines structures vertébrés, tels que les poumons des mammifères, n&#39;ont pas une structure suffisamment orthologue chez l&#39;embryon de poisson zèbre. Nous avons également prévu un plan d&#39;urgence proposé pour enquêter sur les cas dans lesquels l&#39;injection d&#39;ARNm humain WT conduit à un phénotype, mais nous mettons en garde s&#39;agit d&#39;une situation inhabituelle et indésirable. Certains phénotypes de la maladie peuvent alors exiger un plus grand degré d&#39;abstraction et de la maternité de substitution. Il est possible que la fonction du gène a divergé assez pour affaiblir la ressemblance phénotypique entre le modèle et true phénotype, ou que le poisson-zèbre physiologie complique intrinsèquement les effets de la maladie induite. Dans de tels cas, nous proposons en outre dissection du phénotype produite avant le licenciement. Nous avons réalisé quelques exemples réussis dans lequel phénotypes problématiques pour ce test ont été modélisés dans embryons de poissons zèbres. Par exemple, des mutations dans TCF8, un gène associé à Fuchs dystrophie cornéenne (FCD), ont été analysés en utilisant notre protocole en utilisant les défauts de gastrulation comme une lecture phénotypique de substitution basé sur les rôles connus de cette transcription dans le développement précoce. 29 Dans d&#39;autres cas, comme comme la dystrophie musculaire de l&#39;adulte causée par des mutations dans DNAJB6, nous avons pu générer des phénotypes de fibres musculaires dans les embryons 5dpf malgré le fait que les humains sont dépourvus de muscle appréciable pathologie dans leurs trois ou quatre premières années de la vie. 19 En plus des modèles mutants transitoires présentés ici, d&#39;autres ont également pris Advantage de ce système transitoire pour modéliser les maladies humaines dans une variété de systèmes de l&#39;organisme. Dans un exemple, la rétinite pigmentaire a été modélisée chez le poisson zèbre par le renversement de la RP2 du gène, entraînant la mort des cellules rétiniennes et une diminution de lamination rétine. Rescue avec l&#39;ARNm humain de type sauvage a entraîné le développement de toutes les trois couches de lamination rétine, tandis que quatre sur cinq ARNm mutant n&#39;a pas réussi à sauver. 30 Bien que ce modèle d&#39;un trouble sensoriel humain est basé sur un phénotype morphologique, il est également possible d&#39; réponse de dosage à des stimuli tels que le sursaut acoustique ou préimpulsion inhibition 47. Récemment, un modèle de poisson zèbre a été utilisée pour étudier la pathogenèse de la maladie d&#39;Alzheimer à travers la protéine précurseur de l&#39;amyloïde. 31 Les auteurs ont montré que inactivation génique a causé une déficience croissance axonale des neurones moteurs, qui pourraient être sauvées avec un ARNm humain. Ce modèle s&#39;est avéré particulièrement instructif, comme des modèles de souris affichent seulement phenot subtileYPES (knockdown simple) ou létalité post-natal (deux knockdown). La capacité d&#39;évaluer les embryons de poisson zèbre in vivo au cours du développement a permis de discerner l&#39;effet pathogène de la réduction de la protéine précurseur de l&#39;amyloïde, ainsi que fourni des preuves directes que la protéine nécessite à la fois un domaine extracellulaire et intracellulaire pour le bon fonctionnement. Autres modèles notables comprennent que des dystrophies musculaires supplémentaires 32, Blackfan Diamond anémie 33, syndrome Axenfeld-Reiger (développement oculaire et craniofaciale) 34, la maladie inflammatoire de l&#39;intestin 35 (activité antibactérienne), la maladie de Parkinson 36 (neurone et la perte de locomotion), et la saisie 37 (hydrocéphalie et l&#39;hyperactivité). Plus courantes sont les lignes de poisson zèbre mutant qui ont été montrés aussi de récapituler un phénotype de la maladie humaine. Revue en 1,38, les modèles comprennent la leucémie, le mélanome, cardiomyopathies dilatées, la dystrophie musculaire de Duchenne,et bien d&#39;autres.

L&#39;interprétation fonctionnelle de l&#39;information génétique et l&#39;affectation de la valeur clinique prédictive à un génotype représente un problème majeur en génétique médicale et devient de plus en plus poignant avec l&#39;accélération de la faisabilité technique et économique du séquençage du génome entier. Par conséquent, il est nécessaire de développer et mettre en œuvre de nouveaux paradigmes pour tester la pathogénicité des variants de signification inconnue (VUS) détectés chez les patients. Ces tests doivent alors être précis, le temps et le coût-efficacité, et le port le potentiel de catalyser une transition à l&#39;utilité clinique. Alors que la souris a été traditionnellement l&#39;outil de choix dans le domaine de la modélisation des maladies humaines, le poisson-zèbre sont en train de devenir un substitut scientifiquement et économiquement favorable. Contrairement à la souris, poisson zèbre biologie permet un accès facile et rapide à tous les stades de développement, aidés par la clarté optique d&#39;embryons qui permet l&#39;imagerie en temps réel des pathologies en développement. <sup&gt; 1 La génération relativement récente de lignes de poisson zèbre mutant a fourni des tests supplémentaires et des options de modélisation, utilisé par beaucoup dans les études fonctionnelles, mais cette technologie reste limité (revue dans 1,38). Non seulement les mutants génétiques avec Knock-in de mutations spécifiques laborieux à atteindre, ils ne sont pas favorable à l&#39;analyse à moyen ou à haut débit pour l&#39;essai d&#39;une série de mutations dans un seul gène. Surtout, une seule suite de tests peut fournir des informations non seulement pour le potentiel pathogène des allèles, mais aussi pour la direction de l&#39;effet au niveau cellulaire (par exemple, perte de la fonction vs gain de fonction), ce qui est essentiel pour le mode de transmission informer dans les familles, en particulier lorsque de petites pedigrees humaines recèlent peu d&#39;informations sur le mode de transmission génétique. Pour une comparaison de l&#39;utilisation des souris disponibles et les modèles de poisson-zèbre, voir tableau 1. Nous notons également que lere des limites inhérentes au système de modèle de poisson zèbre. Bien D. rerio ont développement initial rapide des systèmes d&#39;organes, la maturité sexuelle nécessite environ trois mois. Pour cette raison, les troubles prénataux et pédiatriques d&#39;apparition sont les plus prêtent à ce modèle d&#39;expression transitoire. Bien idéal pour faire des écrans composés de grandes chimiques, l&#39;utilisation de mutants génétiques n&#39;est pas possible pour le test systématique de milliers de variantes non synonymes qui contribuent à, et continuent d&#39;être détectés dans les troubles pédiatriques. Les tests de complémentation décrites ici profiter de cette docilité expérimental, un haut degré d&#39;homologie, et la préservation de la fonction entre les protéines humaines et le poisson zèbre, particulièrement pour les molécules nécessaires pour les processus de développement conservées. Figure 1 présente le test et la stratégie d&#39;identification des divers effets des allèles. Tant la perte de fonction (LOF) et des dosages dominantes peuvent être réalisées. Pour LOF, l&#39;expérience commence avec la suppression du gène d&#39;intérêt avec un knockdown morpholino, et dosage de phénotypes qui pourraient être pertinents pour le phénotype clinique sous enquête. Suppression peut être réalisée soit par blocage de la traduction en ciblant un MO à ou près du site d&#39;initiation de traduction du poisson zèbre locus (traduction bloquant morpholino; TBMO) ou par interférence avec l&#39;épissage en plaçant un MO sur une jonction d&#39;épissage, ce qui induit généralement soit l&#39;inscription d&#39;une intron ou exon aberrante à sauter (épissure blocage morpholino; SBMO). Par la suite, l&#39;ARNm coiffé de la transcription humain orthologue est introduit et quantifiable sauvetage du phénotype est mesurée. Une fois que le test est établie, les mutations candidats dans le message humain peuvent être introduits et testés pour leur capacité à sauver le phénotype MO-induite à la même efficacité que WT ARNm humain. En revanche, pour le candidat allèles dominants, l&#39;ARNm de l&#39;homme (mais pas MO) est introed avec une attente que l&#39;ARNm humain WT ne sera pas affecter gravement l&#39;anatomie et la physiologie du poisson zèbre, alors que l&#39;introduction de mutations de test qui ont un effet dominant va induire des phénotypes analogues à ceux observés dans l&#39;état clinique humaine. Cette expérience peut être fine davantage de disséquer si l&#39;effet dominant se fait par un gain de fonction (GOF) ou un mécanisme dominant négatif en mélangeant ARNm humain WT et mutant, pour les événements GOF, l&#39;ajout d&#39;ARNm humain WT devrait être pertinent, tandis que pour les allèles dominants négatifs, mélangeant de l&#39;ARNm WT et mutant devrait modifier la sévérité du phénotype mutant induit par un message. Dans tous les cas, nous recommandons que toutes les combinaisons d&#39;injections (MO avec WT ARNm humain vs morpholino avec mutant ARNm humain etc s&#39;effectuer, de préférence dans le même embrayage d&#39;embryons (voir Figure 1) L&#39;interprétation est comme suit.: Pour les tests LOF: <ul><li> Si le knockdownproduit un phénotype qui peut être sauvé de façon équivalente par l&#39;ARNm mutant et WT, l&#39;allèle est probablement bénigne. </li><li> Si le sauvetage mutant du phénotype knockdown est indiscernable de la phénotype knockdown lui-même, l&#39;allèle est un nul fonctionnel probable. L&#39;expérience ne peut pas distinguer entre les vraies valeurs nulles (aucune protéine fonctionnelle) et les niveaux d&#39;activité de protéines ultra-basse qui n&#39;ont pas la capacité de sauvetage. </li><li> Si le sauvetage mutant du phénotype knockdown est statistiquement meilleure que la MO, mais pire que le WT, l&#39;allèle est probablement un hypomorph que ce résultat démontre la perte partielle de la fonction. </li></ul> Pour les tests dominantes: <ul><li> S&#39;il n&#39;ya pas de phénotype knockdown, mais l&#39;injection de l&#39;ARNm WT produit un phénotype, un plan d&#39;urgence doit être utilisée si l&#39;expérience est de procéder (voir ci-dessous). </li><li> S&#39;il n&#39;ya pas de phénotype knockdown et l&#39;injection de l&#39;ARNm WT ne produit pas de phénotype, l&#39;expérience se déroule comme d&#39;habitude. </li><li> Si injectionl&#39;ARNm mutant est équivalente à celle de l&#39;ARNm de type sauvage, de l&#39;allèle peut être bénignes ou la perte de fonction, ou le dosage peut être défaillant. Cela nécessite une expérimentation plus poussée de discriminer entre ces options. </li><li> Si l&#39;injection d&#39;ARNm mutant est indiscernable de la MO knockdown, la fonction du produit du gène est probablement altéré en quelque sorte. Pour distinguer le changement de fonction, d&#39;un titrage de l&#39;ARNm mutant avec l&#39;ARNm de type sauvage ne doit être effectuée. </li><li> Si le résultat de ce titrage est indiscernable de type sauvage ARNm seul, il a été démontré que le produit de la protéine mutante utilise la protéine de type sauvage comme un substrat, comme son effet varie avec la quantité de titration. Cela indique un phénotype négatif dominant. </li><li> Si le résultat de ce titrage est indiscernable à l&#39;ARNm mutant seul, il a été démontré que le produit de la protéine mutante n&#39;a plus la même fonction que le type sauvage, et donc n&#39;est pas affecté par la quantité de type sauvage avant de produit protéiqueenvoyé. Cela démontre que l&#39;allèle est le gain probable de fonction. </li></ul> Plan d&#39;urgence: <ul><li> Si aucun phénotype présente de MO knockdown, mais ne présente avec l&#39;ARNm WT, une expérimentation plus poussée peut se produire, mais nous insistons sur le fait que cette situation n&#39;est pas idéale. ARNm humain HT doit être adaptée pour minimiser le phénotype, et peut également être utilisé en tant que nouvelle valeur de consigne. En outre coinjection de WT et ARNm humain mutant peut être évaluée en fonction de la capacité de sauvetage du mutant. </li></ul>

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>NEB</td><td>M0530S, M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DpnI restriction endonucléase</td><td>NEB</td><td>R0176L, R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Efficacité maximale DH5&alpha ; cellules compétentes</td><td>Invitrogen</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye</td><td>Terminator Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td><td>Invitrogen</td><td>AM1340, AM1344, AM1348</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gene-Tools</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>1-phényl-2-thiourée (PTU) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td>Préparer sous forme de PTU à 0,003 % dans un milieu embryonnaire </td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Pour les embryons qui doivent être fixés avant le phénotypage, préparer à 4 %</td></tr> de <tr><td>méthane de tricaïne sulfonate</td><td>Western Chemical</td><td>N/A</td><td>Pour l’anesthésie et l’euthanasie </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>PTC-225 Tetrad Thermal</td><td>Cycler BioRad</td><td>Tout thermocycleur</td><td></td>équivalent</tr><tr><td>Spectrophotomètre Nano Drop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ 745T Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ100 Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS Fi1 Appareil photo numérique</td><td>Nikon</td><td>Pour l’imagerie</td><td></td>couleur/fluorescente</tr><tr><td>DS QiMC Appareil photo numérique</td><td>Nikon</td><td>Pour l’imagerie</td><td></td>noir/blanc</tr><tr><td>Advanced Resarch 3.2 Logiciel d’imagerie</td><td>NIS- Elements</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo modélisation du génome humain morbide utilisant danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Ici, nous présentons les méthodes pour le développement de tests pour interroger des changements non synonymes potentiellement cliniquement significatives à l&#39;aide de complémentation in vivo chez le poisson zèbre. Le poisson zèbre (Danio rerio) sont un système animal utile en raison de leur docilité expérimentale; embryons sont transparents pour permettre la visualisation facile, subir ex développement rapide vivo, et peuvent être manipulées génétiquement 1 Ces aspects ont permis des avancées significatives dans l&#39;analyse de l&#39;embryogenèse. processus moléculaires et signalisation morphogénétique. Pris ensemble, les avantages de ce modèle vertébré font poisson zèbre prête très bien à la modélisation des défauts de développement dans les maladies pédiatriques, et dans certains cas, des troubles adulte. Parce que le génome du poisson zèbre est hautement conservée avec celle des humains (~ 70% orthologue), il est possible de récapituler les états de maladies humaines chez le poisson zèbre. Ceci est réalisé soit par l&#39;injection de mutant m humaineARN à induire une prise dominant négatif ou d&#39;allèles de fonction, ou l&#39;utilisation de morpholino (MO) des oligonucléotides antisens pour supprimer les gènes d&#39;imiter la perte de variantes de fonction. Grâce à la complémentarité des phénotypes MO-induite avec l&#39;ARNm humain plafonné, notre approche permet à l&#39;interprétation de l&#39;effet délétère des mutations sur la séquence de la protéine humaine basée sur la capacité de l&#39;ARNm mutant pour sauver un mesurable, phénotype physiologiquement pertinents. Modélisation des allèles humains de la maladie se fait par micro-injection d&#39;embryons de poisson zèbre avec MO et / ou de l&#39;ARNm humain au stade de cellules 1-4 et phénotypage jusqu&#39;à sept jours après la fécondation (DPF). Cette stratégie générale peut être étendue à une large gamme de phénotypes de la maladie, comme le montre le protocole suivant. Nous présentons nos modèles établis pour la signalisation morphogénétique, l&#39;intégrité craniofaciale, cardiaques, vasculaires, la fonction rénale et squelettiques phénotypes des troubles musculaires, ainsi que d&#39;autres.

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et spécifique<em&gt; In vivo</em&gt; Tests pour interpréter la variation en pathologie humaine. Manipulation génétique transitoire par microinjection d&#39;ARNm humain WT et mutant et morpholino (MO) des oligonucléotides antisens exploiter la traçabilité du poisson-zèbre développement embryon rapidement mutations d&#39;analyse de pathogènes, en particulier, mais pas exclusivement, dans le contexte des troubles du développement humain.

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

- [Narrateur] L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la pathogénicité de mutations non-synonymes cliniquement significatives à l'aide d'une complémentation in vivo chez le poisson zèbre. Cette approche consiste tout d'abord à produire un ARNm humain muté afin de recréer des lésions génétiques humaines. Ensuite, des ARNm humains de type sauvage et mutés, ainsi que des morpholinos, sont injectés dans des embryons de poisson zèbre et traduits en protéines fonctionnelles ou utilisés pour bloquer la traduction, respectivement. Puis, les embryons sont soumis à un phénotypage afin d'évaluer les effets de la protéine mutée sur le développement. Les résultats obtenus mettent en évidence les effets délétères des mutations sur les séquences protéiques humaines, ce qui peut être confirmé par la capacité de l'ARNm humain muté à assurer un sauvetage fonctionnel.- Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le modèle murin, est que les allèles potentiellement délétères peuvent être analysés plus rapidement selon un débit moyen à élevé, et que des séries alléliques au sein d'un même gène peuvent également être évaluées afin de mieux comprendre l'effet directionnel au niveau cellulaire, tel qu'une perte ou un gain de fonction.- [Narrateur] Pour commencer, déterminez si le gène humain d'intérêt possède un orthologue chez le poisson zèbre, et dans l'affirmative, combien de copies existent. Nous recommandons d'effectuer un BLAST réciproque de la protéine humaine contre le génome du poisson zèbre, puis un BLAST ultérieur du résultat chez le poisson zèbre contre le génome humain. Les véritables orthologues seront les meilleurs résultats dans chaque cas. Obtenez ou générez un vecteur utilisant le cadre ouvert de lecture humain du gène ciblé, de moins de six kilobases de longueur, comprenant un site de transcription 5' SP6 et un signal polyA 3'. Ensuite, concevez un morpholino destiné à bloquer l'épissage ou la traduction du gène ciblé chez le poisson zèbre. À l'aide de zfin.org, déterminez si l'orthologue chez le poisson zèbre est exprimé dans un contexte spatio-temporel pertinent par rapport au phénotype observé. Sinon, réalisez une RT-PCR à partir d'ADNc d'embryons entiers de poisson zèbre ou une hybridation in situ. Pour réaliser une mutagenèse dirigée, commencez par concevoir des amorces de mutagenèse de 25 à 45 bases de long, contenant la mutation souhaitée au centre, et capables de s'hybrider à des brins opposés du plasmide. La température de fusion des amorces doit être supérieure ou égale à 78 degrés Celsius. Assemblez la réaction de mutagenèse avec une ADN polymérase haute fidélité, puis effectuez les cycles selon le programme indiqué ici. Une fois la réaction PCR terminée, ajoutez un microlitre de l'endonucléase de restriction DpnI par réaction afin d'éliminer le gabarit méthylé par dam. Incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Transformez deux microlitres de la réaction de mutagenèse dans 20 microlitres de cellules compétentes selon les protocoles standards. Une fois la mutation d'intérêt et la séquence complète du COD confirmées à partir de cultures de nuit, linéarisez le vecteur pCS2+ et générez un ARNm capé. Après avoir déterminé la concentration en ARNm et vérifié son intégrité par électrophorèse sur gel, conservez les échantillons en trois aliquots ou plus à -80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Pour les expériences de perte de fonction, récupérez des embryons issus d'accouplements naturels de poissons zèbres, puis maintenez-les à 28 degrés Celsius dans de l'eau pour embryons, dans des boîtes de 6 ou 10 centimètres de diamètre. Réalisez une courbe dose-réponse au morpholino en injectant au moins trois concentrations différentes comprises entre 1 et 10 nanogrammes dans 50 à 100 embryons de poisson zèbre par dose. Les morpholinos efficaces doivent provoquer une augmentation dépendante de la dose de la proportion d'embryons affectés dans un lot. Lors de l'analyse qualitative ou quantitative, si vous évaluez les embryons à 24 heures post-fécondation ou plus tard, traitez-les avec de la phénylthiourée à 24 heures post-fécondation afin de réduire la formation de mélanocytes. Pour les morpholinos bloquant l'épissage, testez le déficit induit par le morpholino en extrayant l'ARN total à partir de lysats d'embryons entiers au moment de l'évaluation phénotypique. Générez de l'ADNc et réalisez une RT-PCR du gène ciblé à l'aide d'amorces encadrant le site cible du morpholino. Pour vérifier l'efficacité de suppression d'un morpholino bloquant la traduction (TBMO), si un anticorps réagissant avec la protéine du poisson zèbre est disponible, récoltez des lysats protéiques d'embryons entiers et réalisez un immunoblot afin de comparer les niveaux de la protéine ciblée par rapport au témoin. Si aucun anticorps n'est disponible, co-injectez l'ARNm sauvage avec le TBMO pour démontrer qu'il restaure le phénotype, ou montrez une dépendance à la dose comme décrit précédemment. Si un phénotype qualitatif est observé, sélectionnez une dose de morpholino pour laquelle 50 % à 75 % des embryons sont affectés. Pour les phénotypes quantitatifs, choisissez une dose pour laquelle la mesure phénotypique est significativement différente de celle du type sauvage. Ensuite, injectez de nouveaux lots d'embryons avec un mélange contenant la dose d'essai du morpholino et une courbe de doses d'ARNm humain sauvage. Réalisez ensuite une évaluation aveugle des lots injectés afin de déterminer la dose d'ARNm sauvage produisant la restauration la plus significative par rapport au morpholino seul. Cette dose sera la dose d'essai d'ARNm. Injectez de nouveaux lots d'embryons avec les doses d'essai du morpholino et de l'ARNm humain muté. Évaluez les embryons au stade approprié, puis comparez les résultats à une restauration obtenue avec l'ARNm humain sauvage, à l'aide d'un test du chi-deux ou d'un test t. Si aucun phénotype de perte de fonction n'est observé après injection du morpholino, ou si l'ARNm muté produit des phénotypes non significativement différents du morpholino seul, injectez une courbe de doses d'ARNm humain sauvage dans des lots d'embryons. Réalisez l'évaluation phénotypique et déterminez la dose la plus élevée pour laquelle le nombre d'embryons morts ou affectés n'est pas statistiquement significatif par rapport aux témoins non injectés. Cette dose constitue la dose d'essai. Injectez la dose d'essai d'ARNm humain muté, évaluez les embryons, puis comparez les résultats à ceux obtenus après injection de la dose d'essai d'ARNm humain sauvage ou de la concentration d'essai du morpholino. Si les résultats sont indistinguables de ceux du morpholino, titrez l'ARNm muté avec l'ARNm sauvage et comparez aux injections d'ARNm humain sauvage et muté. L'amélioration des phénotypes dans les lots co-injectés avec ARNm muté et sauvage indique un effet dominant négatif. L'absence d'amélioration indique un gain de fonction. Enfin, pour intégrer les données de pathogénicité in vivo chez le poisson zèbre avec d'autres preuves, comparez-les aux données génétiques au sein du pedigree, aux fréquences dans les populations témoins et aux études protéiques cellulaires in vitro. Illustré ici, un examen qualitatif et quantitatif de mutations humaines MKS1 modélisées chez des embryons de poisson zèbre. Selon la gravité, les phénotypes sont classés en trois groupes : les embryons injectés avec le morpholino présentant des phénotypes de classe I avaient une morphologie grossièrement normale, mais étaient plus courts et présentaient un excès de tissu embryonnaire sur le vitellus par rapport aux embryons témoins injectés. Les morphants de classe II étaient amincis, courts, présentaient des structures crânienne et caudale mal développées, et en outre, manquaient de définition et de symétrie des somites. Les embryons de classe III présentaient un retard sévère, des somites mal développés et déformés, des notocordes ondulées et ne survivaient généralement pas au-delà du stade 10-somites. La co-injection d'ARNm MKS1 humain a corrigé chacun de ces défauts, démontrant la spécificité des phénotypes à la suppression de MKS1. Les phénotypes ont été quantifiés en mesurant la distance entre le premier et le dernier somite visible chez des embryons colorés avec des riboprobes krox20, pax2 et myoD au stade 11-somites. Illustré ici, un modèle de poisson zèbre de dysmorphologie craniofaciale humaine. Des embryons injectés avec des ARNm témoins et mutés ont été colorés au bleu alcian cinq jours post-fécondation. Les embryons mutés présentaient des têtes nettement plus petites et déformées, ainsi qu'une désorganisation générale du squelette craniofacial cartilagineux, incluant des arcs branchiaux écartés et des structures manquantes ou malformées. À cinq jours post-fécondation, un embryon morphant présentant une macrocéphalie montre un élargissement de la tête, visible par l'espace entre les yeux. Dans cet exemple de réduction de l'intégrité vasculaire à deux jours post-fécondation, les morphants montrent un bourgeonnement altéré des vaisseaux intersegmentaires et d'autres structures vasculaires. L'hybridation in situ d'embryons sauvages non injectés montre une expression de spaw dans le mésoderme latéral gauche, servant de témoin pour un repliement cardiaque correct. Les embryons morphants Ccdc39 présentaient une expression bilatérale ou, dans la plupart des cas, indétectable de spaw. Illustré ici, un exemple de morphant Ift80 développant de gros kystes rénaux, un œdème péricardique et une queue recourbée. Pour visualiser la filtration glomérulaire réduite, du dextran marqué à la rhodamine a été injecté dans le cœur, et la fluorescence a été observée 24 heures plus tard. La fluorescence est absente de l'embryon témoin, où elle se disperse dans le système vasculaire et est presque entièrement éliminée par le rein. L'embryon morphant Ift80 affiche un signal persistant de dextran fluorescent, suggérant une filtration glomérulaire réduite. Dans ce modèle de dystrophie musculaire, les embryons injectés avec l'ARNm sauvage montrent des fibres musculaires lentes normales s'étendant entre les somites adjacents, comme déterminé par immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-mycine lente. Les embryons injectés avec l'ARNm muté présentaient un détachement partiel à complet des fibres musculaires des myoseptes dans un ou plusieurs somites. Illustrés ici, des vues latérales vivantes d'un témoin non injecté et d'un morphant Kif7 à 30 heures post-fécondation. Comme visible par la comparaison de l'angle des somites, les morphants présentent des somites anormalement formés, attribuables à une signalisation ectopique de Hedgehog dans le myotome du poisson zèbre.– Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de développer des tests in vivo physiologiquement pertinents, sensibles et spécifiques pour interpréter la variation humaine en pathologie en utilisant le poisson zèbre comme modèle d'organisme.

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