In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et spécifique

- [Narrateur] L’objectif global de l’expérience suivante est de tester la pathogénicité de changements non synonymes cliniquement significatifs en utilisant la complémentation in vivo chez le poisson-zèbre. Ceci est réalisé en générant d’abord un ARNm humain mutant pour récapituler les lésions génétiques humaines. Ensuite, l’ARNm et les morpholinos humains de type sauvage et mutant sont injectés dans des embryons de poisson-zèbre et traduits en protéines fonctionnelles ou utilisés pour bloquer la traduction respectivement. Ensuite, les embryons sont phénotypés afin d’évaluer les effets de la protéine mutante sur le développement. On obtient des résultats qui montrent les effets délétères des mutations sur les séquences de protéines humaines qui peuvent être confirmés sur la base de la capacité de sauvetage de l’ARNm humain mutant.

- Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le modèle murin, est que les allèles potentiellement dommageables peuvent être dosés plus rapidement à un niveau de débit moyen à élevé, et aussi, les séries alléliques au sein d’un seul gène peuvent être évaluées pour mieux comprendre l’effet directionnel au niveau cellulaire, tel que la perte de fonction ou le gain de fonction.

- [Narrateur] Pour commencer, déterminez si le gène humain d’intérêt a une orthologue de poisson-zèbre, et si oui, combien de copies. Nous recommandons le BLAST réciproque de la protéine humaine contre le génome du poisson-zèbre, et le BLAST ultérieur du poisson zèbre contre le génome humain. Les vrais orthologues seront les meilleurs dans chaque cas. Obtenir ou générer une construction à l’aide du cadre de lecture ouvert humain pour le gène souhaité de moins de six kilobases de longueur, ainsi qu’un site de transcription SP6 5' et un signal polyA 3'. Ensuite, concevez un morpholino pour bloquer l’épissage ou la traduction du gène du poisson zèbre ciblé. À l’aide de zfin.org déterminer si l’orthologue du poisson zèbre est exprimé dans un contexte spatio-temporel pertinent pour la lecture phénotypique. Vous pouvez également effectuer une RT-PCR en utilisant de l’ADNc d’embryons entiers de poisson-zèbre ou une hybridation in situ. Pour réaliser une mutagénèse dirigée, commencez par concevoir des amorces de mutagenèse de 25 à 45 bases de longueur avec la mutation souhaitée au centre qui recuitra sur les brins opposés du plasmide. La température de fusion de l’amorce doit être supérieure ou égale à 78 degrés Celsius. Assemblez la réaction de mutagénèse avec une polymérase haute fidélité, et cyclez-le à l’aide du programme présenté ici. Lorsque la réaction PCR est terminée, ajoutez un microlitre d’endonucléase de restriction DpnI par réaction pour retirer la matrice méthylée du barrage. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Transformer deux microlitres de la réaction de mutagénèse en 20 microlitres de cellules compétentes selon les protocoles standards. Une fois que la mutation d’intérêt et la séquence de l’ensemble de l’ORF sont confirmées à partir de cultures nocturnes, linéarisez la matrice pCS2+ et générez de l’ARNm coiffé. Après avoir déterminé la concentration d’ARNm et vérifié son intégrité par électrophorèse sur gel, stockez les échantillons dans trois aliquotes ou plus à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Pour des expériences de perte de fonction variante, obtenez des embryons à partir d’accouplements naturels de poissons-zèbres et maintenez-les à 28 degrés Celsius dans de l’eau embryonnaire dans des boîtes de six ou dix centimètres. Effectuez une courbe dose-réponse morpholino en injectant au moins trois concentrations différentes comprises entre un et dix nanogrammes dans 50 à 100 embryons de poisson-zèbre par dose. Des morpholinos efficaces devraient donner lieu à des augmentations dose-dépendantes de la proportion d’embryons affectés dans un lot. Lors de la réalisation d’une analyse quantitative ou qualitative, si vous notez les embryons 24h après la fécondation ou plus tard, traitez les embryons avec de la phénylthiourée 24h après la fécondation pour réduire la formation de mélanocytes. Pour les morpholinos bloquant l’épissage, testez le déficit en morpholino en extrayant l’ARN total des lysats d’embryons entiers au moment de l’évaluation phénotypique. Générez de l’ADNc et effectuez une RT-PCR du gène cible à l’aide d’amorces flanquant le site cible morpholino. Pour vérifier l’efficacité de suppression d’un morpholino bloquant la traduction, ou TBMO, si un anticorps qui réagit de manière croisée avec la protéine de poisson-zèbre est disponible, prélevez des lysats de protéines embryonnaires entiers et effectuez un immunotransfert pour comparer les niveaux de la protéine ciblée par rapport au contrôle. Si aucun anticorps n’est disponible, co-injectez l’ARNm de type sauvage avec le TBMO pour montrer qu’il sauve le phénotype, ou démontrer une dépendance au dosage comme décrit précédemment. Si un phénotype qualitatif a été observé, choisir une dose de morpholino dans laquelle 50 % à 75 % des embryons sont affectés. Pour les phénotypes quantitatifs, choisissez une dose dont la mesure phénotypique est significativement différente de celle du type sauvage. Ensuite, injectez de nouveaux lots d’embryons avec un cocktail contenant la dose d’essai de morpholino et la courbe de dosage d’ARNm humain de type sauvage. Ensuite, effectuez un scoring masqué des lots d’injection pour déterminer la dose d’ARNm de type sauvage avec le sauvetage le plus significatif par rapport à l’OM seul. Il s’agira de la dose d’essai d’ARNm. Injectez de nouveaux lots d’embryons avec les doses de dosage de morpholino et d’ARNm humain mutant. Phénotypez les embryons au stade approprié et, à l’aide d’un test du chi carré ou d’un test t, comparez les résultats à ceux d’un sauvetage avec de l’ARNm humain de type sauvage. Si aucun phénotype de perte de fonction n’est observé à la suite de l’injection de morpholino, ou si l’ARNm mutant donne lieu à des phénotypes non significativement différents de l’OM seul, injecter une courbe de dosage d’ARNm humain de type sauvage dans des lots d’embryons. Effectuer une notation phénotypique et déterminer la dose la plus élevée à laquelle il n’y a pas un nombre statistiquement significatif d’embryons morts et/ou affectés par rapport aux témoins non injectés. Il s’agit de la dose de dosage. Injectez la dose d’essai d’ARNm humain mutant, phénotypez les embryons et comparez les résultats à l’évaluation de la dose d’essai d’ARNm humain de type sauvage ou de la concentration morpholino du test. Si les résultats sont impossibles à distinguer de ceux du morpholino, titrer l’ARNm mutant avec de l’ARNm de type sauvage et comparer aux injections humaines d’ARNm de type sauvage et mutant. L’amélioration des phénotypes avec des lots injectés d’ARNm mutants et de type sauvage indique un négatif dominant. Aucune amélioration n’indique un gain de fonction. Enfin, pour intégrer les données de pathogénicité in vivo du poisson-zèbre à d’autres sources de preuves, comparez-les aux données génétiques du pedigree, aux données de fréquence de la population de contrôle et aux études de protéines in vitro basées sur des cellules. Voici une évaluation quantitative et qualitative des mutations humaines de MKS1 modélisées dans des embryons de poisson-zèbre. En fonction de leur gravité, les phénotypes sont classés en 3 groupes : les embryons injectés par Morpholino avec des phénotypes de classe I avaient une morphologie grossièrement normale, mais étaient plus courts avec un excès de tissu embryonnaire sur le jaune par rapport aux embryons injectés témoins. Les morphants de classe II étaient minces, courts et avaient des structures de tête et de queue peu développées, et en outre, manquaient de définition et de symétrie somitiques. Les embryons de classe III étaient sévèrement retardés avec des somites mal développés et difformes, des notocordes ondulées et ne survivaient généralement pas au-delà du stade 10 = somite. La co-injection d’ARNm humain et d’ARNm KS1 a sauvé chacun de ces défauts, démontrant la spécificité des phénotypes à la suppression de MKS1. Les phénotypes ont été quantifiés en mesurant la distance entre le premier et le dernier somite appréciable dans des embryons colorés avec des riboprobes krox20, pax2 et myoD au stade 11-somite. On voit ici un modèle de poisson-zèbre de la dismorphologie craniofaciale humaine. Des embryons témoins et mutants injectés d’ARNm ont été colorés au bleu d’Alcian cinq jours après la fécondation. Les embryons mutants présentaient des têtes nettement plus petites et difformes, et une désorganisation générale du squelette craniofacial cartilagineux, y compris des arcs branchiaux évasés et des structures manquantes ou malformées. Cinq jours après la fécondation, un embryon morphant de macrocéphalie injecté présente un élargissement de la tête comme le montre l’espace entre les yeux. Dans cet exemple d’intégrité vasculaire réduite deux jours après la fécondation, les morphants présentent une germination altérée des vaisseaux intersegmentaires et d’autres structures vasculaires. L’hybridation in situ d’embryons de type sauvage non injectés montre l’expression de spaw dans le mésoderme de la plaque latérale gauche, un contrôle pour une boucle cardiaque correcte. Les embryons morphants Ccdc39 ont montré une expression bilatérale ou, dans la plupart des cas, indétectable. Voici un exemple de morphant Ift80 qui développe de gros kystes rénaux, un œdème péricardique et une queue recourbée. Pour visualiser la réduction de la filtration glomérulaire, la rhodamine dextran a été injectée dans le cœur et la fluorescence a été visualisée 24 heures plus tard. La fluorescence est absente de l’embryon témoin, où elle se disperse dans tout le système vasculaire et est presque complètement évacuée par le rein. L’embryon morphant Ift80 présente un signal fluorescent persistant de dextran suggérant une filtration glomérulaire réduite. Dans ce modèle de dystrophie musculaire, les embryons injectés de type sauvage présentent des myofibres lentes normales couvrant les somites entre les myosepta adjacents, comme déterminé par immunocoloration à l’aide d’un anticorps anti-myosine lente. Les embryons mutants injectés ont montré un détachement partiel à complet des myofibres des myosepta dans un ou plusieurs somites. On voit ici des vues latérales en direct d’un témoin non injecté et d’un morphant Kif7 30 heures après la fécondation. Comme le montre la comparaison de l’angle du somite, les morphants présentent des somites de forme anormale, attribuables à la signalisation ectopique Hedgehog dans le myotome du poisson zèbre.

- Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de développer des tests in vivo physiologiquement pertinents, sensibles et spécifiques pour interpréter la variation humaine de la pathologie en utilisant le poisson-zèbre comme modèle d’organisme.