Name: Évaluer phénotypes neurodégénératives en Drosophila Neurones dopaminergiques par des tests descalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez comment évaluer la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez Drosophila grâce à des tests d'escalade et une immunocoloration cérébrale complète. Cette méthode permet d'étudier les effets du vieillissement sur la fonction motrice.

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Nous remercions Leo Pallanck pour les stocks de mouche, Christine Sommers pour l&#39;assistance technique et Gerasimos P. Sykiotis pour des discussions utiles. Ce travail a été financé par le NIH formation subvention T32CA009363 de MCB

1. Sursaut induite Assay géotaxie négative <ol><li> Sélectionnez mouches du génotype désiré, séparez-les par genre, au hasard de les regrouper dans des cohortes de 20-30 animaux et retournez-les dans de nouveaux flacons de nourriture tous les 2-3 jours; essai, chaque groupe de mouches (c. cohortes d&#39;âge comparable, une cohorte / génotype) au moins une fois par semaine. </li><li> Trente minutes avant le test de géotaxie négatif, anesthésier les mouches avec du CO 2 et de les placer dans des tubes en plastique transparent pré-étiquetés faites avec deux flacons vides de nourriture (voir le tableau des matériaux) réunis à leurs ouvertures avec du ruban adhésif transparent (dimensions de la chambre: 19 cm x 2,85 cm). Dans nos tests, nous utilisons habituellement 25 mouches / tube. Remarque. Le temps de récupération de l&#39;anesthésie peut varier de quelques minutes à plusieurs heures (par exemple O / N) et doit être optimisé pour les génotypes spécifiques testés. </li><li> Marquer différentes hauteurs (de 1 à 20 cm) sur un morceau de papier buvard et la bande du papier sur une surfac verticale, perpendiculaire à la table. </li><li> Placer les tubes devant le papier: les tubes doivent être tous alignés et aussi près que possible du papier pour permettre une mesure précise de la hauteur. </li><li> Placez l&#39;appareil photo numérique (voir l &#39;«équipement spécial» Table) en face des tubes, à une distance de 20-30 cm du papier, sur un support (par exemple, une boîte d&#39;embouts de pipettes), sélectionnez l&#39;option &quot;film&quot; et commencer enregistrement, à ce moment vous devriez également commencer une minuterie pour garder une trace du temps entre essais consécutifs. </li><li> Laisser les mouches pour recueillir au bas du tube en appuyant sur ​​le tube de quelques secondes (par exemple 10 s). Cette étape doit être effectuée régulièrement (c. même durée, même force, même opérateur) pendant toute l&#39;expérience. </li><li> Les mouvements du disque vole avec l&#39;appareil photo numérique pendant 10 secondes. </li><li> Répétez les étapes 1.5-1.7 quatorze fois à intervalles d&#39;une minute. </li><li> Analyser les données: <ol type="a"><li> Comptez le nombre de mouches qui sont au-dessus de la2 cm marque après 10 secondes par inspection visuelle des vidéos enregistrées. Remarque: Dans nos conditions de test de comportement géotaxie négatif des mouches n&#39;a pas duré au-delà des 10 premières secondes après la surprenante (c.-à-mouches commencé à se déplacer dans toutes les directions 10 sec après les effrayer). La distance minimale a augmenté de mouches de contrôle (c. âgé de 1 semaine mouches exprimant le conducteur THGal4, voir la légende de la figure 1) dans ce laps de temps était de 2 cm. Ainsi, nous avons utilisé la marque de 2 cm comme référence pour analyser les activités d&#39;escalade de mouches de différents âges et les génotypes 10 sec après le début du comportement. Ces paramètres peuvent être adaptés de tenir compte des différences dans le comportement des mouches testés (en raison par exemple de différentes origines génétiques ou des conditions de laboratoire). Notez que dans nos conditions de test, tous les génotypes testés effectué pire ou même les mouches du génotype de la commande. </li><li> Prendre la moyenne des résultats de la quinzaineessais. </li><li> Moyenne express en tant que pourcentage du nombre total de mouches dans le tube (= activité escalade%), le nombre de répétitions (N) est donnée par le nombre de cohortes indépendantes testées pour chaque génotype </li><li> Évaluer la signification statistique entre les différents génotypes au fil du temps. Ceci peut être accompli avec le test t de Student (lorsque l&#39;on compare deux génotypes) ou une analyse ANOVA 2-way suivie par Bonferroni test post-hoc (lorsque vous effectuez des comparaisons multiples) en utilisant des logiciels commerciaux tels que GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA). </li></ol></li></ol> Remarque Nous réalisons tous nos tests en même temps de la journée, à la température ambiante et dans les mêmes conditions d&#39;éclairage. Garder les mouches dans un environnement de cycle lumière / obscurité de 12 heures est conseillé de contrôler l&#39;effet des rythmes circadiens sur le comportement locomoteur des mouches. 2. Immunofluorescence de la tyrosine hydroxylaseDosage des Monts du cerveau entier Solutions et tampons Solution de fixation: 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) Tampon de lavage: 0,1% de Triton X-100 dans du PBS Le tampon de blocage: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 et de 0,5% de BSA Milieu de montage: Mowiol-Dabco (voir protocole décrit dans Harlow E, D. Lane, Antibodies-A manuel de laboratoire, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988)) Procédure <ol><li> Mettez mouches dans un plat de dissection rempli avec 70% EtOH pendant environ 1 min pour éliminer la cire cuticule. </li><li> Transfert vole vers un autre plat de dissection rempli de PBS glacé. </li><li> Disséquer le cerveau: <ol type="a"><li> Placez la volée avec le haut de la face ventrale (en option: ailes et les pattes supprimer). </li><li> Tirez la tête loin du corps: utiliser un ensemble de forceps àtenir sur le corps et un autre pour s&#39;accrocher à la cuticule sous l&#39;oeil pour éviter d&#39;endommager le cerveau </li><li> Retirez la trompe. </li><li> Tenir à la cuticule de la tête sur des côtés opposés de la fente reste ouvert après avoir enlevé la trompe et tirer dans des directions opposées jusqu&#39;à ce que le cerveau est prélevé à partir de la capsule de la tête. </li><li> Retirez tous les cuticule du cerveau. </li><li> Retirez tout le tissu trachéal rempli d&#39;air, ce qui permettra d&#39;éviter le cerveau de flotter pendant les étapes d&#39;incubation suivantes. </li></ol></li><li> Couper quelques millimètres de la pointe d&#39;une pointe de pipette P-200 et s&#39;équilibrer avec une solution à 0,1% de Triton X-100/PBS </li><li> Avec la pointe P-200 pipette préparé, transférer le cerveau à un tube Eppendorf 0,5 ml remplie avec 0,5 ml de PFA 4% / PBS et garder sur la glace jusqu&#39;à ce que la dissection est terminée. </li><li> Fixer les cerveaux à température ambiante pendant 20 min: appliquer une légère rotation en mettant les tubes Eppendorf sur une grille et placer la grille sur un nutator. </li><li> Retirez le fixateurl&#39;aide d&#39;une micro pipette P-1000, ajoutez 0,5 ml de 0,1% X-100/PBS Triton, mélanger par inversion et laisser incuber pendant 1 min; répéter cette étape de lavage une fois. </li><li> Retirez le tampon de la deuxième lavage, ajouter 0,5 ml de 0,1% X-100/PBS Triton et laisser incuber à température ambiante pendant 20 min; répéter cette étape deux fois. </li><li> Retirez le tampon de lavage et de laisser les cerveaux incuber dans un tampon de blocage (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 et de 0,5% de BSA) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuber les cerveaux avec une dilution 1:100 d&#39;anticorps anti-TH (voir le &quot;Tableau des réactifs spécifiques») dans une solution de blocage, pendant deux jours, à 4 ° C, avec une légère rotation (voir l&#39;étape 2.6.). </li><li> Répétez les étapes de lavage 2.7. et 2.8 .. </li><li> Equilibrer les cerveaux avec une dilution de 1:200 d&#39;une solution de blocage antibodyin secondaire, pendant deux jours, à 4 ° C, avec une légère rotation. </li><li> Répétez les étapes de lavage 2.7. et 2.8 .. </li><li> Préparer les lames de fixation comme illustré à la figure 2A: <ol type="a"><li> Add 2 x 25 gouttes ul de milieu de montage à un couvercle en verre (24 x 60 mm, no. 1.5). </li><li> Placez deux verres de couverture (taille 18 x 18 mm, no. 2) sur le support de montage en laissant un espace au milieu de la diapositive et laisser sécher. </li></ol> Remarque. Vérifiez le porte-échantillon sur la scène de votre microscope confocal. Vous pouvez faire le couvercle en verre de la même taille d&#39;un x 75 mm diapositive 25 en attachant un x 1,5 mm couvercle en verre 22 22 à l&#39;une des extrémités (utiliser le vernis à ongles et bande). </li><li> Retirer le tampon de lavage, ajouter 50 ul de milieu de montage et permettent le cerveau de s&#39;équilibrer avec elle par aspiration et refoulement. </li><li> En utilisant une coupe P-200 pointe de pipette (voir l&#39;étape 2.4) transférer le cerveau à la diapositive dans l&#39;espace entre les deux lamelles et les couvrir avec une lamelle pas. 1.5 (voir Figure 2A; d&#39;orienter le cerveau sur la diapositive voir 7). Remarque: les échantillons sont montés entre deux verres de couverture pour permettre la visualisation à la fois la partie antérieure et la posterieur latéral du cerveau. </li><li> Remplir tout l&#39;espace entre les lamelles avec les médias de montage; pipette d&#39;un coin à enlever tout l&#39;air; laisser sécher et le joint avec le vernis à ongles. </li><li> Pour évaluer le nombre de neurones dopaminergiques dans une grappe spécifique acquérir une série de sections optiques le long de l&#39;axe z avec un 1,0 um étape de taille à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal (pour l&#39;identification anatomique des grappes dopaminergique dans le cerveau adulte drosophile voir 7). </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
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<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
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<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

Nous déclarons que nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Les tests décrits ici de fournir une approche utile pour étudier le rôle des gènes spécifiques, les voies de signalisation ou de petits composés dans l&#39;entretien des neurones dopaminergiques dans le vieillissement ainsi que dans différents fonds génétiques de maladies liées (revue en 5). Le comportement de géotaxie négatif sursaut induite de la drosophile a été largement utilisé comme fonctionnel lecture de toutes les fonctionnalités de neurones dopaminergiques dans d...

La spécificité des essais décrits ici repose sur l&#39;utilisation d&#39;une ligne à mouche Gal4 qui exploite les séquences régulatrices du gène de la tyrosine hydroxylase pour obtenir une expression spécifique dans les neurones dopaminergiques 3. Tyrosine hydroxylase catalyse la première et étape limitante dans la synthèse de la dopamine. immunoréactivité de TH dans les recouvrements du cerveau des mouches adultes avec celle de la dopamine, rendant TH un bon candidat pour identifier les neurones dopaminergiques in vivo (voir par exemple 6). En outre, le profil d&#39;expression de THGal4 est plus spécifique que celle des autres Gal4 lignes telles que DdcGal4, qui contient des séquences régulatrices du gène de la dopa décarboxylase et conduit l&#39;expression transgénique non seulement dans les neurones dopaminergiques, mais aussi dans les neurones sérotoninergiques et sous-ensembles de cellules gliales 3 . Feany et Bender (2000) ont observé que la première expression pan-neuronal du gène α-synucléine humaine PD-lié accélère la perte progressive de la stacomportement de géotaxie négatif rtle induite chez la drosophile. Nous avons observé des résultats similaires en utilisant spécifique de la ligne DA-neurone THGal4 à conduire le ExpressionOf une α-synucléine transgène 10 et utilisé cette fonction de lecture d&#39;étudier le rôle neuroprotecteur de la voie Nrf2 dans ce Drosophila modèle de PD 14. Le dosage spécifique décrit ici est adapté de 2 et 3. Le cerveau Drosophila contient plus de 100 neurones dopaminergiques, disposés dans au moins 5 groupes différents (PPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) qui peuvent être visualisées dans les montagnes entières du cerveau par microscopie confocale (voir par exemple 11 et 7). Il est encore controversée si oui ou non le nombre de neurones dopaminergiques dans le cerveau diminue avec la drosophile âge de 9 ans, 11; toutefois, la neurodégénérescence liée à l&#39;âge est observée chez les mouches où les gènes PD-linked ont été mutés / surexprimé pour modéliser les maladies humaines5. L&#39;expression de l&#39;α-synucléine humaine dans les neurones DA a un tel effet et, par conséquent, a été utilisé comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Nous décrivons ici un essai de neurones dopaminergiques dans le cerveau entier comptent monte utilisant TH comme un marqueur de cellule. Ce test a été adapté à partir de 13 et 10 ans.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Équipement</td></tr><tr><td>Polystyrene vials</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (modèle)</td><td>12,1 Mégapixels 4X Zoom Optique</td></tr><tr><td>Glass coverslips no. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>Tailles : 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Glass coverslips no. 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>Taille : 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Dissection dishes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>Taille : 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Dumostar No. 5 tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (modèle)</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP2 ou SP5 (modèle)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table des matériaux.</td></tr></tbody></table>

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; drosophila</em&gt; neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et immunocoloration du cerveau entier

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster est un organisme modèle précieux pour étudier le vieillissement et les processus pathologiques dégénératives du système nerveux. Les avantages de la mouche comme un système expérimental comprennent sa puissance de sa génétique, courte durée de vie et la possibilité d&#39;observer et d&#39;analyser quantitativement des comportements complexes. L&#39;expression des gènes liés à la maladie dans les populations neuronales spécifiques du cerveau chez la drosophile, peut être utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines telles que la maladie de Parkinson et la maladie d&#39;Alzheimer 5. Neurones dopaminergiques (DA) sont parmi les populations les plus vulnérables de neurones dans le cerveau humain vieillissement. Dans la maladie de Parkinson (PD), le trouble le plus fréquent neurodégénératif du mouvement, la perte accélérée des neurones DA entraîne une diminution progressive et irréversible de la fonction locomotrice. Outre l&#39;âge et l&#39;exposition à des toxines environnementales, la perte de neurones DA est exacerbée par des mutations spécifiques dans le codageou régions promotrices de plusieurs gènes. L&#39;identification de ces allèles PD-associés fournit la base expérimentale pour l&#39;utilisation de la drosophile comme modèle pour étudier la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques in vivo. Par exemple, l&#39;expression du gène α-synucléine humaine PD-lié chez la drosophile neurones DA reprend certaines caractéristiques de la maladie chez l&#39;homme, par exemple la perte progressive des neurones dopaminergiques et déclin de la fonction locomotrice 2. En conséquence, ce modèle a été utilisé avec succès pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans PD 8. Nous décrivons ici deux essais qui ont été couramment utilisées pour étudier la neurodégénérescence liée à l&#39;âge des neurones dopaminergiques chez la drosophile: un essai d&#39;escalade basée sur la réponse de géotaxie négatif sursaut induite et immunomarquage de la tyrosine hydroxylase de tout le cerveau adulte monte sur surveiller le nombre de DA neurones à des âges différents. Dans les deux cas, l&#39;expression in vivo du SAMU transgenes spécifiquement dans les neurones dopaminergiques peuvent être obtenus en utilisant une tyrosine hydroxylase (TH) promoteur Gal4 ligne de conducteur 3, 10.

Nous avons utilisé les tests décrits ici d&#39;étudier le rôle de la voie Nrf2 protection des contraintes dans un modèle drosophile de PD 14. Ce modèle repose sur l&#39;expression du gène α-synucléine humaine dans les neurones DA l&#39;aide d&#39;un TH Gal4 conducteur 2, 10. La figure 1 montre un résultat représentatif d&#39;un sursaut géotaxie négatifs induits (escalade) analyse dans les mouches mâles exprimant différents transgènes sous le co...

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l&#39;âge des neurones dopaminergiques (DA) dans<em&gt; Drosophila</em&gt;: L&#39;escalade / test de géotaxie négatif sursaut induite qui permet d&#39;étudier les effets fonctionnels de neurones DA dégénérescence et l&#39;immunomarquage de la tyrosine hydroxylase qui est utilisé pour identifier et compter les neurones dopaminergiques dans les montagnes entières du cerveau.

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

L'objectif global de cette procédure est d'évaluer la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez la drosophile transgénique. Cela est réalisé en exprimant d'abord les transgènes souhaités sous le contrôle du promoteur tyrosine hydroxylase via le système GAL quatre UAS. La deuxième étape de la procédure consiste à collecter les mouches du génotype souhaité, les séparer par sexe et les vieillir.La troisième étape consiste à tester l'activité de grimpe des mouches par axe géo négatif à mesure qu'elles vieillissent. La dernière étape consiste à compter le nombre de neurones dopaminergiques à partir de cerveaux disséqués collectés à différents âges. En fin de compte, les résultats montreront des changements dans le comportement locomoteur de l'animal et dans la taille de leur population de neurones dopaminergiques.Les implications de cette approche s'étendent vers la thérapie des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson. Cette approche peut aider à identifier des gènes neuroprotecteurs et des interventions pharmacologiques Pour mettre en place l'essai, sélectionnez des mouches d'âge équivalent des génotypes souhaités. Séparez-les par sexe et regroupez-les au hasard en cohortes de 20 à 30 animaux.Chaque cohorte représente un échantillon statistique. Maintenez les cohortes sur un cycle lumière-obscurité de 12 heures pour contrôler les effets des rythmes circadiens sur le comportement locomoteur, et à une température qui peut être reproduite dans la salle de test. Changez les flacons de la cohorte tous les deux à trois jours et testez-les chaque semaine à un moment précis.30 minutes avant le test, anesthésiez chaque cohorte avec du dioxyde de carbone et transférez-les dans un tube en plastique étiqueté fabriqué à partir de flacons de nourriture vides joints avec du ruban adhésif. Les mouches devraient être éveillées après cinq à 10 minutes, mais la récupération complète de l'anesthésie varie selon l'âge et le génotype et doit être optimisée. Maintenant. Créez une échelle de hauteur pour voir derrière les flacons de test.Marquez les distances entre un et 20 centimètres sur un morceau de papier blanc. Fixez ensuite l'échelle en position. Alignez maintenant les tubes à tester sur l'échelle à environ 20 à 30 centimètres de distance.Positionnez une caméra numérique avec une vue carrée des flacons. Assurez-vous que les étiquettes sur les tubes et l'échelle sont clairement visibles. Une fois en place, lancez l'enregistrement et démarrez un minuteur numérique.Maintenant, tapotez un tube pendant quelques secondes. Toutes les mouches devraient recueillir le fond du tube. Assurez-vous de faire cette étape de manière cohérente avec la même durée et la même force tout au long de l'expérience.Après une minute, répétez le knockdown pour la deuxième des 15 essais consécutifs. Lorsque les 15 essais sont tous terminés, remettez les mouches dans des flacons frais en inspectant visuellement les films. Pour chacun des 15 essais effectués par cohorte, comptez le nombre de mouches au-dessus de la marque de deux centimètres.Après 10 secondes, la marque de deux centimètres est déterminée empiriquement, c'est la distance que tous les contrôles franchissent après 10 secondes à de nombreux âges testés. Prenez le score moyen des 15 essais et exprimez-le en pourcentage de membres de la cohorte ayant franchi la marque. Le nombre de répétitions statistiques est égal au nombre de cohortes testées pour chaque groupe, pas aux 15 essais.Évaluez la signification statistique entre différents génotypes en utilisant un test T de Student, une anova ou d'autres méthodes d'analyse appropriées. Mettez les mouches dans un plat de dissection avec 70% d'éthanol pendant environ une minute. Pour éliminer la cire cuticulaire.Ensuite, transférez les mouches dans un autre plat de dissection rempli de PBS glacé, et procédez à la dissection du cerveau. Positionnez la mouche avec le côté ventral vers le haut et enlevez éventuellement les ailes et les pattes. Utilisez un ensemble de pincettes pour tenir le corps et une autre pour tenir la cuticule sous l'œil.Puis retirez la tête du corps. Ensuite, retirez la trompe en la tirant de la tête. Saisissez ensuite la cuticule de la tête sur les bords opposés du nouveau trou et tirez dans des directions opposées jusqu'à ce que le cerveau soit retiré de la capsule de la tête.Maintenant, retirez délicatement la cuticule restante de la surface du cerveau. Ensuite, retirez tous les tissus trachéaux remplis d'air. Cela empêchera le cerveau de flotter pendant les étapes d'incubation suivantes.Préparez une pipette de manipulation du cerveau à partir d'une pointe de pipette P 200. Coupez quelques millimètres et équilibrez-la avec 0,1% de Triton X 100 dans du PBS. Transférez les cerveaux dans un tube d'un demi-millilitre complètement rempli de 4% de PFA dans du PBS.Fixez les cerveaux à température ambiante pendant 20 minutes avec une rotation douce. Après 20 minutes, utilisez une pipette P 1000 pour remplacer le fixateur par un demi-millilitre de tampon de lavage contenant 0,1% de Triton X 100 dans du PBS. Mélangez par inversion et laissez les cerveaux incuber pendant une minute avant de remplacer le tampon de lavage.Après une minute, remplacez le tampon de lavage une deuxième fois et incubez les cerveaux à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, remplacez le tampon de lavage pour la troisième fois et incubez les cerveaux pendant encore 20 minutes. Maintenant, retirez le tampon de lavage et laissez les cerveaux incuber dans un demi-millimètre de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.Après une heure, ajoutez une dilution de un à 100 d'anticorps antit dans la solution de blocage. Laissez-le incuber pendant deux jours à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Pour éliminer le bloc, répétez les lavages utilisés pour éliminer le fixateur.Ensuite, équilibrez les cerveaux avec un demi-millilitre d'une dilution d'un à 200 d'anticorps secondaire dans la solution de blocage pendant deux jours à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Quelques jours plus tard, retirez l'anticorps secondaire en utilisant le même procédé de lavage. Pour préparer les lames de montage, ajoutez 2 gouttes de 25 microlitres de média de montage sur un verre de couverture.Placez deux verres de couverture sur le média de montage avec un écart au milieu. Laissez les lames sécher. Si la largeur de la lame de montage ne correspond pas à la scène du microscope confocal, utilisez du vernis à ongles pour fixer un verre de couverture de 22 sur 22 millimètres sur la lame afin qu'elle s'adapte correctement.Maintenant, remplacez la solution dans laquelle se trouvent les cerveaux par 50 microlitres de média de montage. Équilibrez les cerveaux avec le média de montage en pipetant avec une pointe P 200 coupée. Ensuite, utilisez une pointe P 200 coupée pour transférer les cerveaux dans la tranchée.Dans la lame de montage, orientez les cerveaux pour voir leur côté antérieur ou postérieur. Couvrez-les ensuite d'un couvercle de verre numéro

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