Évaluer phénotypes neurodégénératives en Drosophila Neurones dopaminergiques par des tests d'escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez la drosophile transgénique. Ceci est accompli en exprimant d’abord les transgènes souhaités sous le contrôle du promoteur de la tyrosine hydroxylase via le système GAL four UAS. La deuxième étape de la procédure consiste à collecter des mouches du génotype souhaité, à les séparer par sexe et à les dater.

La troisième étape consiste à tester l’activité grimpante des mouches par un axe géographique négatif à mesure qu’elles vieillissent. La dernière étape consiste à compter le nombre de neurones dopaminergiques provenant de cerveaux disséqués collectés à différents âges. En fin de compte, les résultats montreront des changements dans le comportement locomoteur de l’animal et dans la taille de sa population de neurones dopaminergiques.

Les implications de cette approche s’étendent au traitement des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson. Cette approche peut aider à identifier les gènes neuroprotecteurs et les interventions pharmacologiques. Pour mettre en place le test, sélectionnez des mouches du même âge des génotypes souhaités. Séparez-les par sexe et regroupez-les au hasard en cohortes de 20 à 30 animaux.

Chaque cohorte représente un échantillon statistique. Maintenez les cohortes sur un cycle d’obscurité légère de 12 heures pour contrôler les effets des rythmes circadiens sur le comportement locomoteur, et à une température qui peut être reproduite dans la salle d’essai. Changez les flacons de la cohorte tous les deux ou trois jours et testez-les chaque semaine à un moment régulier.

30 minutes avant le test, anesthésie chaque cohorte avec du dioxyde de carbone et transfère-les dans un tube en plastique étiqueté fabriqué à partir de flacons alimentaires vides reliés par du ruban adhésif. Les mouches devraient être réveillées après cinq à 10 minutes, mais la récupération complète de l’anesthésie varie avec l’âge et le génotype et doit être optimisée. Maintenant. Créez une échelle de hauteur à afficher derrière les flacons de test.

Marquez des distances comprises entre un et 20 centimètres sur une feuille de papier blanc. Fixez ensuite la balance en position. Alignez maintenant les tubes à tester contre l’échelle à environ 20 à 30 centimètres.

Placez un appareil photo numérique avec une vue carrée des flacons. Assurez-vous que les étiquettes sur les tubes et la balance sont bien visibles. Une fois positionné, démarrez l’enregistrement et démarrez une minuterie numérique.

Tapotez maintenant un tube pendant quelques secondes. Toutes les mouches doivent se rassembler au fond du tube. Assurez-vous de faire cette étape de manière cohérente avec la même durée et la même force tout au long de l’expérience.

Au bout d’une minute, répétez le renversement pour le deuxième de 15 essais consécutifs. Lorsque les 15 essais sont terminés, remettez les mouches dans des flacons frais en inspectant visuellement les films. Pour chacun des 15 essais réalisés par cohorte, comptez le nombre de mouches au-dessus de la marque des deux centimètres.

Après 10 secondes, la marque des deux centimètres est déterminée empiriquement, c’est la distance que tous les contrôles franchissent après 10 secondes à de nombreux âges testés. Prenez le score moyen des 15 essais et exprimez-le en pourcentage des membres de la cohorte qui ont franchi la marque. Le nombre de répétitions statistiques est égal au nombre de cohortes testées pour chaque groupe, et non par les 15 essais.

Évaluez la signification statistique entre différents génotypes à l’aide du test T d’un élève, de l’anova ou d’autres méthodes d’analyse appropriées. Mettez les mouches dans une boîte de dissection avec de l’éthanol à 70 % pendant environ une minute. Pour enlever la cire à cuticules.

Ensuite, transférez les mouches dans une autre boîte de dissection remplie de PBS glacé, et procédez à la dissection du cerveau. Positionnez la mouche avec le côté ventral vers le haut et retirez éventuellement les ailes et les pattes. Utilisez un ensemble de pinces pour tenir le corps et un autre pour tenir la cuticule sous l’œil.

Retirez ensuite la tête du corps. Ensuite, retirez le probos en le retirant de la tête. Saisissez ensuite la cuticule de la tête sur les bords opposés du nouveau trou et tirez dans des directions opposées jusqu’à ce que le cerveau soit retiré de la capsule céphalique.

Maintenant, délicatement, retirez la cuticule restante de la surface du cerveau. Retirez ensuite tout le tissu trachéal rempli d’air. Cela empêchera le cerveau de flotter pendant les étapes d’incubation suivantes.

Préparez une pipette de manipulation du cerveau à partir d’une pointe de pipette P 200. Coupez quelques millimètres et équilibrez-le avec 0,1 % de Triton X 100 en PBS. Transférez les cerveaux dans un tube d’un demi-millilitre complètement rempli de 4 % de PFA dans du PBS.

Fixez le cerveau à température ambiante pendant 20 minutes avec une rotation douce. Après 20 minutes, utilisez une pipette P 1000 pour remplacer le fixateur par un demi-millilitre de tampon de lavage étant 0,1 % Triton X 100 en PBS. Mélangez par inversion et laissez les cerveaux incuber pendant une minute avant de replacer le tampon de lavage.

Au bout d’une minute, replacez le tampon de lavage une deuxième fois et incubez les cerveaux à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, remplacez le tampon de lavage une troisième fois et incubez les cerveaux pendant encore 20 minutes. Maintenant, retirez le tampon de lavage et laissez les cerveaux incuber dans un demi-millimètre de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.

Après une heure, ajoutez une dilution de un à 100 d’anticorps antit dans une solution bloquante. Laissez-le incuber pendant deux jours à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Pour retirer le bloc, répétez les lavages utilisés pour retirer le correctif.

Ensuite, équilibrez les cerveaux avec un demi-millilitre de dilution de un à 200 d’anticorps secondaires dans une solution bloquante pendant deux jours à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Quelques jours plus tard, retirez l’anticorps secondaire en utilisant la même procédure de lavage. Pour préparer les glissières de montage, ajoutez 2 gouttes de 25 microlitres de support de montage dans un verre de protection.

Placez deux verres de protection sur le support de montage avec un espace au milieu. Laissez sécher les lames. Si la largeur de la lame de montage ne correspond pas à la platine du microscope confocal, utilisez du vernis à ongles pour fixer une lamelle de 22 x 22 millimètres à la lame afin qu’elle s’adapte correctement.

Remplacez maintenant la solution dans laquelle se trouvent les cerveaux par 50 microlitres de support de montage. Équilibrez le cerveau avec le support de montage en pipetant avec une pointe coupée P 200. Ensuite, utilisez une pointe P 200 coupée pour transférer les cerveaux dans la tranchée.

Dans la glissière de montage, orientez les cerveaux pour voir leur face antérieure ou postérieure. Ensuite, couvrez-les avec une lamelle de protection numéro 1,5 et d’un coin, remplissez l’espace entre les lunettes de protection avec un support de montage pour éliminer tout l’air. Laissez sécher les lames puis scellez-les avec du vernis à ongles avant leur examen.

L’alpha-synucléine humaine a été exprimée dans les neurones DA à l’aide du pilote TH GAL quatre dans le test d’escalade. Les mâles exprimant ce transgène ont montré un déclin accéléré par rapport aux témoins appariés selon l’âge et au vol en tant que coex exprimant le partenaire de liaison NRF 2D NA. Les femelles Math S ont montré des résultats similaires en comparant des mouches mâles de quatre semaines de génotypes différents.

Le nombre de neurones DA basé sur l’immunofluorescence a été utilisé pour quantifier le nombre de neurones PPL un. Une perte faible mais significative de neurones PPL a été observée chez les mouches exprimant l’alpha-synucléine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la neurodégénérescence des neurones varg dans les zoa transgéniques par des dosages CLA et l’immunofluorescence de la tyrosine aase.

Merci d’avoir regardé.