Name: Ex méthode in vivo pour limagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez une méthode ex vivo pour imager et quantifier la motilité des cils respiratoires dans la trachée de souris. Cette technique permet d'analyser la fréquence des battements et le flux généré par les cils avec une microscopie vidéo haute vitesse.

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Le projet a été soutenu par le NIH subvention U01HL098180 du National Heart, Lung, and Blood Institute. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Heart, Lung, and Blood Institute ou le National Institutes of Health

1. Réactifs Setup 1.1 Dissection et l&#39;imagerie moyen L-15 du milieu de Leibovitz (L15) est complété avec du FBS (10%) et pénicilline-streptomycine (100 unités / ml de pénicilline G sodique et 100 pg / ml de sulfate de streptomycine) est utilisé à la fois pendant la récolte et de l&#39;imagerie d&#39;échantillons trachée. 2. Shallow fortifiée hémicycle de la culture La chambre utilisée pour maintenir le tissu trachée est illustré à la figure 1. Le sol de la chambre est le fond de verre 35 mm boîte de culture. Le haut et le côté de la chambre est généré en plaçant un petit morceau de 0,3 mm feuilles de silicone épaisse sur le plat en verre. Le bord de la feuille est coupée pour s&#39;adapter à la coupelle à fond rond et le centre est en outre découpé pour former une chambre centrale peu profonde (voir les étapes 2.1 à 2.3). Au sommet de cette assemblée, une lamelle de verre ronde de 18 mm est placé à générer une enceinte appropriée pour l&#39;imagerie. <ol><li> Recouvrir complètement un mm en verre ronde glissement 18 de couverture avec un carré de 0,3 mm feuilles de silicone épais. </li><li> Avec des ciseaux de dissection standards couper les feuilles de silicone excès de partout dans le bord de la lamelle (résultant en une couche circulaire de feuilles de silicone). </li><li> Avec un scalpel découper et enlever une place centrale de feuilles de silicone (environ 10 mm de côté) à partir du milieu de la lamelle couvert (formant ainsi le dessus et les côtés de la chambre d&#39;imagerie). </li></ol> 3. Trachée récolte et préparation <ol><li> Euthanasier les souris en conformité avec les soins aux animaux institutionnelles locales et utiliser comité et / ou les directives gouvernementales et enlever la trachée en plastique 35 mm boîte de culture standard avec suffisamment L15 médias au tissu de plonger (auteurs ont utilisé des souris juste avant la naissance au jour de gestation 16.5, par le biais de animaux nouveau-nés, néonatale et adulte 2). </li><li> Enlever le tissu non associé trachée fixé à l&#39;extérieur dela trachée en utilisant dissection. </li><li> Retirez le larynx avec une coupe transversale juste au-dessous du cartilage cricoïde l&#39;aide de micro ciseaux de dissection (figure 2A, ligne 1). </li><li> Retirez les branches bronchiques primaires à gauche et à droite avec une coupe transversale juste au-dessus de la carène avec des micro ciseaux de dissection (figure 2A, ligne 2). </li><li> Tenir délicatement la trachée avec une pince fine et rincer la lumière 2-3 fois avec environ 1 ml du milieu L15 de bain avec un P1000 et P1000 Pipteman pointe pour dégager le mucus et du sang. </li><li> Découpez un segment d&#39;anneau 3-4 de la trachée avec une coupe transversale avec micro ciseaux de dissection (figure 2B, ligne 1). </li><li> Couper longitudinalement à travers le milieu du muscle trachéal de ce segment trachée court l&#39;aide de micro ciseaux de dissection (figure 2B, ligne 2). </li><li> Couper longitudinalement au milieu des anneaux de cartilage trachéal l&#39;aide de micro ciseaux de dissection (figure 2C </strong&gt;, ligne), laissant deux morceaux de tissu trachée adapté pour l&#39;imagerie (section unique montre la figure 2D). </li></ol> 4. Imagerie par Cilia <ol><li> Transfert segments de tissu trachée, côté lumière vers le bas, sur le milieu d&#39;un mm à fond de verre plat 35 de culture avec 100-200 pi de milieu L-15. </li><li> Pour quantifier les cils flux généré ajouter une petite quantité de fluorescence 0,20 um microsphères dans le milieu L-15 baignant l&#39;échantillon de tissu trachée (~ 1 x 10 11 particules / ml ou de 20 ul / ml de la suspension à 2,5% de microsphères aqueuse Fluoresbrite). </li><li> Placer la chambre d&#39;imagerie préparé précédemment (voir procédure 3.1 ci-dessus) au-dessus de l&#39;échantillon côté de la feuille de silicone trachée vers le bas, avec l&#39;échantillon trachée située au milieu de la chambre à paroi peu profonde formée par la fenêtre découpée dans la feuille de silicone (Figure 1 ). </li><li> Appuyez doucement sur la lamelle pour sécuriser en place et enlever l&#39;excédent L-15 médias de l&#39;usin bordsga P1000 et P1000 pointe Pipetman. </li><li> Monter le fond de verre plat de culture de 35 mm et un échantillon de trachée sur un microscope inversé avec optique 100X objectifs et DIC. </li><li> En utilisant une caméra à haute vitesse et le logiciel d&#39;acquisition de film recueillir films de la motilité des cils à 200 + images par seconde le long de l&#39;épithélium trachéal ciliées de l&#39;recroquevillés bord du muscle trachéal (figure 2D Décrit boîte, E: par exemple image fixe de vidéo enregistrée) (Film supplémentaire 1). </li><li> En utilisant l&#39;imagerie à fluorescence FITC et une caméra CCD bas de lumière (voir la liste des équipements ci-dessus), rassembler films de mouvement de microsphères fluorescentes à travers la surface de l&#39;épithélium trachéal ciliée pour permettre la quantification des cils plus tard flux généré (Movie supplémentaire 2). </li></ol> 5. La quantification de la motilité Cilia <ol><li> Chargez films imagés DIC dans le logiciel ImageJ et suivant la technique décrite par Iain Drummond 13 utiliser l&#39;outil Ligne pour tracer une ligne de trame traversant les cils battant. Un &quot;retrancher&quot; de cette ligne génère une image du type à kymographe où le mouvement des cils sur la ligne génère un motif d&#39;onde. Le nombre de pixels entre chaque crête de l&#39;onde est leur mesurés (un pixel = une séquence vidéo) à partir de laquelle le nombre de battements par minute (soit Hz) peut alors être calculée. </li><li> Pour mesurer les cils ont généré des flux de charge films perles fluorescentes dans le logiciel ImageJ, et utiliser le plugin MTrackJ 14 pour suivre manuellement billes fluorescentes sur la surface de l&#39;épithélium de la trachée et de laisser le logiciel génère vitesse perle et la directivité pour chaque perle suivi. </li></ol> Des précautions doivent être prises lors de l&#39;utilisation des billes fluorescentes pour quantifier le débit comme la distance entre les cils battant peut fortement influencer l&#39;ampleur du débit mesuré. Le mouvement bourrelet supplémentaire Movie 2 est un bon exemple de cela. Dans cet exemple perlele mouvement est rapide à la surface des cils battant et diminue considérablement hors de perles plus loin dans les médias de bain. Pour contrôler cela, tracés de perles ne devraient être collectées à une distance fixe au-dessus de l&#39;épithélium cilié dans tous les échantillons pour permettre des comparaisons appropriées à prendre. Enfin, pour obtenir des données représentatives sur l&#39;écoulement du fluide, perles devraient être suivis aussi longtemps que possible, nous préférons utiliser des pistes de perles qui couvrent les cellules ciliées 10 + pour le calcul de l&#39;écoulement du fluide.

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<li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li>
<li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Mesure de la fréquence de battement des cils (CBF) est relativement facile en utilisant objectifs de microscope haute puissance et l&#39;image matériel d&#39;acquisition rapide 13,15, et explique pourquoi les mesures CBF forment la base de la plupart des études portant sur ​​la clairance mucociliaire pendant la santé et la maladie. Cependant, alors que la mesure CBF est essentielle pour comprendre clairance muco-ciliaire, la mesure de CBF seul ignore l&#39;importance fondamentale des deux flux générés ciliair...

Analyse de la fonction de cils mobiles dans l&#39;épithélium des voies respiratoires est expérimentalement importantes pour comprendre les facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent affecter la clairance muco-ciliaire et la santé pulmonaire 1. Le protocole simple mis au point pour l&#39;imagerie de la souris épithélium des voies respiratoires constitue une méthode efficace pour interroger voies cils motilité des modèles mutants et KO souris et ne nécessitent que des compétences de base chez la souris dissection du tissu trachéal et l&#39;imagerie ex vivo des voies respiratoires cils motilité avec vidéo-microscopie à haute résolution. Ce protocole a été établi et perfectionné au cours d&#39;un écran de mutagenèse souris à grande échelle pour permettre une évaluation rapide de la fonction de cils mobiles (fréquence de battement de cils, la forme de battement de cils, cils flow généré) dans des mutants présentant une cardiopathie congénitale associée à hétérotaxie 2-5. Les techniques actuelles utilisées pour étudier la motilité des cils des voies aériennes peuvent être regroupées en deux l&#39;ancien type vivo ou lon aiguëger terme dans les approches expérimentales in vitro. Expériences aigus comprennent visualisation ex vivo de nasales / voies aériennes biopsies humaines brosse 6,7 et une analyse des sections transversales des voies respiratoires simples 8. Les approches in vitro utilisent diverses techniques de culture cellulaire pour générer des feuilles de l&#39;épithélium cilié différenciée comme dans les cultures de l&#39;interface air liquide ou respiratoires cultures de suspension 9-11. Cependant, ces techniques de reciliation épithélium des voies respiratoires nécessitent des investissements très importants en temps et en formation avant les cellules épithéliales ciliées utilisables sont produites pour l&#39;expérimentation (4-6 semaines 9,10). Bien que l&#39;analyse ex vivo aiguë des voies respiratoires biopsies de pinceau épithéliales sont couramment utilisées pour les études cliniques chez l&#39;homme, cette méthode n&#39;est pas utilisable dans les études de souris dues à une lésion tissulaire mécanique exacerbée 12. La technique décrite dans ce protocole pour l&#39;analyse des protocoles d&#39;ententee trachéale épithélium des voies respiratoires n&#39;est pas seulement simple à réaliser, mais il ne nécessite pas de compétences particulières de dissection, ni aucun équipement spécialisé en dehors de celles norme d&#39;imagerie par vidéo-microscopie. Il ya de nombreux avantages à ce protocole très simple. Tout d&#39;abord, comme la récolte de tissus trachée de la souris est rapide et facile à réaliser, il permet une évaluation rapide de la fonction des cils des voies aériennes dans un grand nombre de souris. Cela peut inclure une analyse aiguë des effets à court terme des différents traitements in vitro. D&#39;autre part, étant une technique ex vivo, l&#39;épithélium respiratoire cilié reste attaché à elle sous-jacent tissus de soutien et de conserver ainsi les voies de signalisation cellulaire associées. Par conséquent, en comparaison avec in vitro reciliated épithélium des voies respiratoires, cette préparation est une meilleure représentation de la nature dans un environnement de tissus in vivo. Troisièmement, ce protocole permet l&#39;acquisition d&#39;un certain nombre de paramètres quantitatifs qui peuvent fournir une évaluation objective de la motilité ciliaire fonction. Enfin, contrairement à d&#39;autres méthodes actuelles de voies cils visualisation, ce protocole permet de visualiser des cils perpendiculairement à la direction de battement de cils, ce qui permet la vue de profil des cils qui est optimale pour l&#39;imagerie à haute résolution de battement de cils et de génération d&#39;ondes metachronal . Ce protocole peut être modifié dans un certain nombre de façons d&#39;aborder un large éventail de besoins expérimentaux tels que le rôle des agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus sur la fonction des cils des voies respiratoires et de la production / maintenance de voies respiratoires battement de cils et de la propagation des ondes metachronal.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Sans phénol rouge </td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x pince fine </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de micro-dissection </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>pointes P1000 </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm rond en verre Couvercles </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Plastique 35 mm Boîtes de culture </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Fond en verre 35 mm Boîtes de culture </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Feuille de silicone 0,012" (0,3 mm) d’épaisseur </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0,20 &mu ; m de diamètre Fluoresbrite YG Carboxylate Microsphères Polysciences </td><td></td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé, avec objectif à huile 100x et filtres DIC </td><td>La marque Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>n’est pas critique. </td></tr><tr><td>Lampe au mercure de 100 watts, filtres d’excitation/émission FITC épifluorescents</td> La marque <td>Lecia n’est</td><td></td><td>pas critique.</td></tr><tr><td>Platine de microscope Incubateur</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Non requis si l’imagerie des cils à température ambiante</td></tr><tr><td>Caméra haute vitesse à champ lumineux </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>La marque n’est pas critique. Doit être plus rapide que 125 fps</td></tr><tr><td>Caméra fluorescente à grande vitesse </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>La marque n’est pas critique. Doit être plus rapide que 10 fps</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de films</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ avec plugin</td><td></td> MtrackJ</tr></tbody></table>

ex méthode in vivo pour l&#39;imagerie haute résolution de la motilité cilia dans rongeur épithélium des voies respiratoires

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Une technique ex vivo pour l&#39;imagerie souris épithélium des voies respiratoires pour l&#39;analyse quantitative de la fonction de cils mobiles importante pour comprendre la fonction de la clairance mucociliaire a été établi. Fraîchement récoltées souris trachée est coupé longitudinalement à travers le muscle trachéal et monté dans une chambre fortifiée peu profonde sur un plat à fond de verre. L&#39;échantillon trachée est positionné le long de son axe pour tirer profit du muscle trachéal à se recourber longitudinalement. Cela permet à l&#39;imagerie du mouvement ciliaire dans la vue de profil sur toute la longueur trachéale. Vidéos à 200 images / sec sont obtenus en utilisant l&#39;interférence différentiel microscopie en contraste et une caméra numérique à haute vitesse pour permettre une analyse quantitative de la fréquence de battement des cils et forme d&#39;onde ciliaire. Avec l&#39;ajout de billes fluorescentes lors de l&#39;imagerie, les cils écoulement de fluide générée peut également être déterminé. Le temps de protocole couvre environ 30 min, à 5 min de préparation chambre, 5-10 min pour l&#39;échantillonmontage et 10-15 min pour vidéomicroscopie.

Contrôle des voies aériennes cils doit être clairement visible et vu à battre de manière coordonnée (Film 1 supplémentaire; la lecture du film est ralentie à 15% en temps réel), avec un débit notable dans le sens du battement de cils (Film complémentaire 2; la lecture du film est de 100% temps réel). La quantification des films de cils devrait donner des résultats similaires à ceux observés dans la figure 3. Collection de films DIC à grande vitesse permet la quantificat...

Une technique simple et fiable pour la visualisation et quantification des voies respiratoires motilité des cils et cils de flux générés en utilisant la souris trachée est décrite. Cette technique peut être modifiée pour déterminer comment un grand nombre de facteurs influencent la motilité des cils, y compris les agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus.

Ex méthode in vivo pour l&#39;imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier la motilité des CLIA respiratoires et les flux générés par les CLIA à l'aide de trachées de souris fraîchement isolées. Cette opération s'effectue en préparant tout d'abord une chambre d'imagerie peu profonde. Les étapes suivantes consistent à récolter et à monter le tissu trachéal pour l'imagerie.Ensuite, on montre comment visualiser et enregistrer la motilité C et l'écoulement généré par les CLIA à l'aide d'un microscope inversé équipé d'une vidéographie à grande vitesse à travers un objectif 100 XDIC. La dernière étape consiste à analyser la vidéo en quantifiant la fréquence de battement des CLIA et l'écoulement généré par les CLIA à l'aide du logiciel Image J. En définitive, les résultats peuvent montrer des modifications de la motilité respiratoire des CLIA et de l'écoulement généré par les CLIA grâce à la microscopie vidéo à grande vitesse.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à permettre une imagerie reproductible de l'épithélium tra des rongeurs, permettant ainsi des évaluations quantitatives cohérentes du mouvement cilié. Cela peut être réalisé en 20 à 30 minutes avec une formation minimale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles concernant les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant l'élimination du mucus dans les voies respiratoires, particulièrement lorsqu'elle est utilisée en combinaison avec différents modèles de souris génétiquement modifiées ou mutantes.Commencez par construire la chambre utilisée pour contenir les échantillons de trachée servant de base ou de plancher de chambre. Utilisez une boîte de culture de 35 millimètres à fond en verre pour la partie supérieure. Utilisez une feuille de silicone d'une épaisseur de 0,3 millimètre.Placer la feuille sur une lamelle ronde en verre de 18 millimètres et découper le bord. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, découper un carré de 10 millimètres à partir du milieu du silicone. La lamelle en verre et le silicone forment le dessus et les côtés de la chambre de culture.Ils seront placés au-dessus de l'échantillon disposé dans la boîte de culture. Après avoir euthanasié une souris conformément aux directives institutionnelles, isoler chirurgicalement la trachée. Prélever la trachée dans une boîte de culture plastique de 35 millimètres avec suffisamment de milieu L 15 pour la recouvrir entièrement.À l’aide d’une dissection émoussée, retirez tous les tissus non trachéaux situés autour de la trachée. Ensuite, à l’aide de ciseaux de microdissection, retirez le larynx par une coupe transversale juste en dessous du cartilage cricoïde. Retirez maintenant les branches bronchiques primaires gauche et droite par une coupe transversale juste au-dessus de la carène, à l’aide d’une pince fine.Tenez délicatement la trachée. Ensuite, à l’aide d’une pipette de un millilitre, rincez la lumière deux ou trois fois avec du milieu L 15 pour éliminer tout mucus et tout sang. Puis, à l’aide de ciseaux de microdissection, effectuez une incision transversale pour prélever un segment de trois ou quatre anneaux de trachée.Ensuite, dans le petit segment de trachée, effectuez une incision longitudinale au milieu du muscle trachéal. Enfin, coupez longitudinalement au milieu des anneaux cartilagineux de la trachée à l’aide de ciseaux de microdissection, laissant deux sections de tissu trachéal adaptées à l’imagerie. Après la dissection, transférez les segments de tissu trachéal, côté lumière vers le bas, au centre de la boîte avec fond en verre contenant environ 100 microlitres de L 15.Pour quantifier le débit généré par la CLIA avec 20 microlitres d'une suspension à 2,5 % de microbilles fluorescentes par millilitre de milieu L 15. Placez maintenant la couverture en silicone et en verre sur la trachée et appuyez doucement pour la fixer en place. Ensuite, le long des bords, retirez tout excès de milieu à l’aide d’une pipette de un millilitre.Maintenant, transférez la chambre vers un microscope inversé équipé d'un objectif 100 x et d'optiques DIC. À l'aide d'une caméra haute vitesse et d'un logiciel d'acquisition vidéo, enregistrez des vidéos de la mobilité CLIA à 200 images par seconde ou plus, le long des épithéliums trachéaux ciliés au niveau du bord recourbé du muscle trachéal. À l'aide d'une imagerie épifluorescente FS et d'une caméra CCD sensible à faible luminosité, enregistrez des vidéos des microsphères fluorescentes se déplaçant à la surface des épithéliums trachéaux ciliés.À l'aide de ces vidéos, procédez à la quantification des échantillons de flux générés par CLIA. Les échantillons peuvent être observés pendant jusqu'à une heure sans altération notable de la fonction ciliaire. Commencez par calculer le nombre de battements CLIA par minute. Chargez les vidéos en contraste interférentiel différentiel (DIC) dans le logiciel ImageJ.Suivez la technique décrite par Aian Drummond. Utilisez l'outil de ligne pour dessiner une ligne raster. Traversant les cils battants.Créez une tranche d'image de cette ligne afin de générer une image de type graphique où le mouvement du CA le long de la ligne produit un motif ondulatoire. Comptez ensuite le nombre de pixels entre chaque sommet d'onde le long de cette ligne. À partir de ce comptage.Calculez les battements par minute en sachant que chaque image de la vidéo est représentée par un pixel le long de la ligne. Ensuite, mesurez le débit de flux C Cate généré. Chargez les vidéos des billes fluorescentes dans le logiciel Image J.À l'aide du plugin MT Track J, suivre manuellement les billes fluorescentes à la surface de l'épithélium trachéal. Le logiciel calculera la vitesse et la directionnalité de chaque bille suivie. Veiller à noter que la distance par rapport aux cils en bâtonnet peut fortement influencer l'amplitude du flux mesuré.Dans cet exemple, le mouvement des billes est rapide à la surface des cils batteurs et diminue pour les billes situées plus loin dans le milieu ambiant ; afin de contrôler ce phénomène, les trajectoires des billes doivent être enregistrées uniquement à une distance fixe au-dessus de l'épithélium cilié pour tous les échantillons, afin de permettre des comparaisons correctes. Enfin, concernant l'écoulement du fluide, suivre les billes pendant la durée la plus longue possible. Il est préférable d'utiliser des billes qui traversent plus de 10 cellules ciliées pour effectuer ces calculs.En utilisant le protocole décrit, les cils des voies respiratoires doivent être clairement visibles et présenter un mouvement coordonné. De même, un flux notable dans la direction du battement doit être observable. Généralement, l'acquisition de films en contraste interférentiel différentiel à haute vitesse permet la quantification de la fréquence de battement des cils et fournit de bonnes images.Pour l'évaluation qualitative de la forme des battements du CLIA. Le suivi de billes fluorescentes fournit une mesure de la vitesse d'écoulement générée par le CLIA. La directionnalité est calculée en divisant le déplacement total d'une bille fluorescente par la longueur de la trajectoire d'une bille fluorescente.Ainsi, une trajectoire rectiligne obtient un score de un, tandis qu'un parcours sinueux obtient une valeur beaucoup plus faible. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de bien débarrasser le muscle trachéal de tous les tissus conjonctifs et adipeux environnants avant de le sectionner.Le recourbement du muscle trachéal après son incision étant essentiel pour positionner le CLIA respiratoire de manière optimale afin d'en permettre une visualisation idéale. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des études pharmacologiques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple comment ou pourquoi les agents pharmacologiques modulent-ils l'activité respiratoire de C ?

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Source : Al Omran, A. J., et al. Imagerie en direct des cils épendymaux dans les ventricules latéraux du cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2015). Cette vidéo montre une technique d’imagerie en direct utilisant la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) pour observer le battement des épendymes cils dans les sections sagittales du cerveau de souris. Les cils épendymaires propulsent le liquide céphalo-rachidien (LCR), et leur activité est enregistrée dans des coupes cérébrales...

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