Ex méthode in vivo pour l'imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de quantifier la motilité respiratoire de la CLIA et le flux généré par la CLIA à l’aide d’une trachée de souris fraîchement isolée. Pour ce faire, il faut d’abord préparer une chambre d’imagerie peu profonde. Les prochaines étapes de la procédure consistent à prélever et à monter le tissu trachéal pour l’imagerie.

On montre ensuite comment visualiser et enregistrer la motilité C et l’écoulement généré par CLIA à l’aide d’un microscope inversé avec vidéographie à grande vitesse à travers un objectif 100 XDIC. La dernière étape consiste à analyser la vidéo en quantifiant la fréquence des battements CLIA et le flux généré par CLIA à l’aide du logiciel Image J. En fin de compte, les résultats peuvent montrer des changements dans la motilité respiratoire de la CLIA et le flux généré par la CLIA grâce à la vidéomicroscopie à grande vitesse.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet une imagerie reproductible du tra-épithélium du rongeur pour des évaluations quantitatives cohérentes du mouvement ciliaire. Cela peut être accompli en 20 à 30 minutes avec une formation minimale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés relatives aux mécanismes cellulaires et moléculaires régulant l’élimination des muci dans l’eWAY, en particulier lorsqu’elle est utilisée en combinaison avec différents modèles de souris génétiquement modifiées et mutantes.

Commencez par construire la chambre utilisée pour contenir les échantillons de trachée pour une base ou un plancher de chambre. Utilisez une boîte de culture de 35 millimètres à fond de verre pour le haut. Utilisez une feuille de silicone de 0,3 millimètre d’épaisseur.

Posez la feuille sur une lamelle en verre rond de 18 millimètres et coupez le bord. Ensuite, avec un scalpel au milieu du silicone, découpez un carré de 10 millimètres. La lamelle de couverture en verre et le silicone constituent le haut et les côtés de la chambre de culture.

Ils seront placés sur l’échantillon qui est placé dans la boîte de culture. Après avoir euthanasié une souris conformément aux directives de l’établissement, isolez chirurgicalement la trachée. Récupérez la trachée dans une boîte de culture en plastique de 35 millimètres avec suffisamment de milieu L 15 pour l’immerger complètement.

À l’aide d’un curage émoussé, retirez tout le tissu non trachéal autour de la trachée. Ensuite, à l’aide de ciseaux de microdissection, retirez le larynx avec la coupe transversale juste en dessous du cartilage cricoïde. Retirez maintenant les branches bronchiques primaires gauche et droite avec une coupe transversale juste au-dessus de la carène avec une pince fine.

Tenez doucement la trachée. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, rincez la lumière deux ou trois fois avec du milieu L 15 pour éliminer le mucus et le sang. Ensuite, à l’aide de ciseaux de micro-dissection, faites une coupe transversale pour retirer un segment de trachée à trois ou quatre anneaux.

Ensuite, dans le petit segment trachéal, faites une coupe longitudinale au milieu du muscle de la traches. Enfin, coupez longitudinalement au milieu des anneaux cartilagineux trachéaux à l’aide de ciseaux de microdissection, en laissant deux sections de tissu de la trachée adaptées à l’imagerie. Après la dissection, transférez les segments de tissu de la trachée, côté lumière vers le bas, au centre de la boîte à fond en verre avec environ 100 microlitres de L 15.

Pour quantifier le débit généré par CLIA à 20 microlitres d’une suspension de 2,5 % de microsphères fluorescentes par millilitre de milieu L 15. Placez maintenant le couvercle en silicone et en verre sur la trachée et poussez-le doucement pour le fixer en place. Ensuite, le long des bords, retirez tout excès de support à l’aide d’une pipette à un moulin.

Transférez maintenant la chambre dans un microscope inversé équipé d’une optique subjective et DIC 100 x. À l’aide d’une caméra haute vitesse et d’un logiciel d’acquisition de vidéos, collectez des vidéos de la motilité CLIA à plus de 200 images par seconde le long de l’épithélium de la trache ciliée du bord recroquevillé du muscle de la traches. À l’aide de l’imagerie fluorescente FS e epi et d’une caméra CCD à faible lumière, collectez des films de la microsphère fluorescente se déplaçant à la surface des épithéliums de la trachée ciliée.

À l’aide de ces films, procédez à la quantification du flux généré par CLIA Les échantillons peuvent être imagés jusqu’à une heure sans aucune modification notable de la fonction Celia Beat. Commencez par calculer les battements CLIA par minute. Chargez les vidéos imagées DIC dans le progiciel Image J.

Suivez la technique décrite par Aian Drummond. Utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne raster. Croisement de la clia battante.

Faites une tranche de résolution de cette ligne pour générer une image de type graphique où le mouvement de l’AC sur la ligne génère un motif d’onde. Comptez maintenant le nombre de pixels entre chaque pic d’onde le long de cette ligne. De ce compte.

Calculez les battements par minute en sachant que chaque image vidéo est représentée par un pixel le long de la ligne. Ensuite, mesurez le débit généré par C Cate. Chargez les films à billes fluorescentes dans le progiciel Image J.

À l’aide du plug-in MT track J, suivez manuellement les billes fluorescentes à la surface de l’épithélium de la trachée. Le logiciel calculera la vitesse et la directionnalité de chaque cordon suivi. Prenez soin de noter que la distance par rapport aux cils perlants peut fortement influencer l’amplitude du débit mesurée.

Dans cet exemple, le mouvement des billes est rapide à la surface des cils perlants et diminue pour les billes plus éloignées dans le milieu de bain pour contrôler ce billes Les tracés ne doivent être collectés qu’à une distance fixe au-dessus de l’épithélium cilié dans tous les échantillons pour permettre des comparaisons correctes. Enfin, pour l’écoulement du fluide, suivez les billes le plus longtemps possible. Il est préférable d’utiliser des billes qui passent plus de 10 cellules ciliées pour effectuer ces calculs.

À l’aide du protocole de contrôle décrit, les cils des voies respiratoires doivent être clairement visibles et être vus de manière coordonnée. De même, il doit y avoir un écoulement notable dans la direction du battement. En règle générale, la collection de films DIC à grande vitesse permet de quantifier la fréquence de battement C et donne de bonnes images.

Pour l’évaluation qualitative de la forme du battement CLIA. Le suivi des billes fluorescentes permet de mesurer la vitesse d’écoulement générée par CLIA. La directionnalité est calculée en divisant le déplacement total d’une perle fluorescente par la longueur de la trace d’une perle fluorescente.

Ainsi, une ligne de trajectoire droite marque un. Alors qu’un chemin sinueux obtient une valeur beaucoup plus faible. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de dégager correctement le muscle de la trache de tout le tissu conjonctif et adipeux environnant avant de couper.

Comme l’enroulement du muscle de la traches après qu’il a été coupé est essentiel pour positionner le CLIA respiratoire pour une visualisation idéale. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que des études pharmacologiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que comment ou pourquoi les agents pharmacologiques modulent-ils l’activité respiratoire C ?