Name: Recombineering homologues constructions de recombinaison Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Apprenez à générer des vecteurs de recombinaison homologue dans Drosophila par recombinaison pour créer des mutations nulles et marquer des protéines endogènes. Cette méthode précise facilite l'étude des fonctions géniques.

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Nous tenons à remercier Hugo Bellen et l&#39;Bloomington Stock Center for réactifs. Nous remercions encore Koen Venken, Hugo Bellen et tous les membres du laboratoire Buszczak et Hiesinger pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national de la santé de l&#39;ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) et Mo (RO1GM086647), une subvention de l&#39;Institut de recherche sur la prévention du cancer du Texas à Mo et PRH (RP100516), et le Welch Foundation (I-1657) à PRH. MB est un EE et Greer Garson Fogelson Scholar dans la recherche biomédicale et PRH est un McDermott Scholar Eugene dans la recherche biomédicale à l&#39;UT Southwestern Medical Center.

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<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
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<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas des intérêts divergents en ce qui concerne les techniques décrites ici.

La puissance des organismes modèles génétiques dans la recherche biomédicale repose en grande partie sur les outils disponibles pour la manipulation génétique. Les petits modèles C. elegans et Drosophila en particulier permettre des analyses génétiques moléculaires peu coûteux et rapide des parcours complets et des familles de gènes impliqués dans le développement ou la fonction multicellulaire. Ces dernières années ont vu des avancées significatives dans le développement d&#39;outils pour la manipulat...

Nettoyez manipulations moléculaires définis de gènes uniques à leurs loci endogènes offrent un outil précieux pour étudier une multitude de questions pertinentes à la biologie eucaryote. Drosophila inverser techniques génétiques pour générer des allèles de perte de fonction s&#39;était avéré être difficile jusqu&#39;à ce que Golic et ses collègues ont introduit dans génique in vivo en utilisant le ciblage recombinaison homologue chez la drosophile 1-3. Ils ont démontré que loci génomiques spécifiques pourraient être ciblés en utilisant un fragment linéaire d&#39;ADN à partir d&#39;une construction transgénique intégré. Cet ADN «donneur» linéaire est généré in vivo par recombinaison FRT à médiation (pour exciser l&#39;ADN du chromosome en une molécule circulaire) puis linéarisation avec la méganucléase I-Scel. Bien que cette méthode a été utilisée avec succès pour produire une variété de lésions définies, la technique n&#39;a pas été facilement évolutive pour la manipulation de nombreux gènes en parallèle car chaque indiviconstruction double KO nécessite une conception distincte et personnalisée. Par exemple, des difficultés à manipuler de façon transparente grands fragments d&#39;ADN (&gt; 5 ko) in vitro en utilisant l&#39;enzyme classique de restriction / ligature clonage ou PCR, ainsi que les limitations de taille de traditionnel dans des vecteurs de transformation in vivo interfèrent souvent avec la création rapide d&#39;une recombinaison homologue ciblage vecteurs. Pour surmonter ces limitations, nous avons combiné le système P [ACMAN] de recombineering / de transgénèse, qui permet au sous-clonage et la transgenèse jusqu&#39;à 100 kb d&#39;ADN, avec le gène extrémités-out méthodologie de ciblage d&#39;établir une plate-forme efficace et relativement rapide que facilite le ciblage génique Drosophila. Recombinaison induite par génie génétique (recombineering) est un puissant recombinaison homologue basé sur la technologie du clonage 4,5. Contrairement aux enzyme / ligase clonage de restriction conventionnelle, recombineering n&#39;est pas limitée par la séquence ou Size de l&#39;ADN manipulée. Recombineering utilise un E. spéciale coli souche qui abrite les machines de recombinaison fourni par un λ défectueux prophage 4. Cette technique a récemment été adopté pour une utilisation chez la drosophile 6,7. Recombineering chez la drosophile repose sur un chromosome modifié conditionnellement amplifiable artificiel bactérien (BAC) de vecteur appelé P [ACMAN] 6,7. Ce vecteur porte deux origines de réplication: oriV, qui produit nombre élevé de copies lors de l&#39;induction chimique pour la purification de grandes quantités d&#39;ADN nécessaires pour le séquençage et l&#39;injection de l&#39;embryon et Oris, qui maintient faible nombre de copies dans des conditions basales. En outre, le P [ACMAN] vecteur est équipé d&#39;un site de fixation des bactéries (attB). Le site attB sert de substrat pour la transgenèse OC31 intégrase à médiation qui permet l&#39;incorporation de grands fragments d&#39;ADN dans un site d&#39;atterrissage prédéterminée à l&#39;intérieur du génome de la drosophile 8,9. Nous avons généré un P [ACMAN] vecteur (dénommé P [ACMAN] KO 1.0) qui peut être utilisé comme un vecteur de ciblage à des fins départ recombinaison homologue 10,11. Pour intégrer extrémités-out ciblage génique technologie dans le système, nous avons ajouté deux deux sites I-Scel FRT et. Nous avons également inclus une cassette Gateway dans ce vecteur modifié pour simplifier le processus d&#39;incorporation des bras d&#39;homologie en P [ACMAN] KO 1.0. Cela fournit un moyen rapide et simple d&#39;introduire pratiquement n&#39;importe quelle région génomique d&#39;intérêt dans le vecteur de ciblage. Dans ce protocole, nous allons décrire comment concevoir un vecteur de ciblage en utilisant P [ACMAN] KO 1.0, et comment mobiliser ce vecteur in vivo pour cibler le locus endogène. Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser la cassette DDP / Kan pour remplacer un gène d&#39;intérêt, mais une variété de cassettes qui contiennent un marqueur de sélection antibiotique peut être utilisé avec ce protocole. Nous avons conçu et utilisé avec succès une série de cassettes pourremplacement d&#39;un gène et l&#39;étiquetage 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Bactéries compétentes en recombinaison</td><td>NCI-Frederick</td><td>Bactéries de recombinaison (SW102, SW105 et SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx » target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Comprend CopyControl solution d’induction</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS ADN polymérase</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit de récupération d’ADN</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Kit enzymatique</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak et Hiesinger Labs</td><td>Sur demande</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak et Hiesinger Labs</td><td>Upon demande</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomington stock center</td><td>Numéros de stock : 25680, 25679</td><td>y1 w* / Dp(2 ; Y)G, P{hs-hid}Y ; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2 ; Y)G, P{hs-hid}Y ; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Machine d’électroporation</td><td>Biorad GenePulser Xcell avec module PC</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Brand</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

La poursuite du développement des techniques de manipulation rapide et à grande échelle des loci des gènes endogènes permettra d&#39;élargir l&#39;utilisation de Drosophila melanogaster comme un organisme modèle génétique pour la recherche liée à la maladie humaine. Ces dernières années ont vu des progrès techniques comme la recombinaison homologue et recombineering. Cependant, générant des mutations nulles équivoques ou des protéines endogènes de marquage reste un effort substantiel pour la plupart des gènes. Ici, nous décrivons et démontrer les techniques pour l&#39;utilisation de méthodes de clonage recombineering basés à générer des vecteurs qui peuvent être utilisés pour cibler et manipuler des loci endogènes in vivo Plus précisément, nous avons mis en place une combinaison de trois technologies:. (1) BAC transgénèse / recombineering, ( 2) extrémités-out recombinaison homologue et (3) la technologie de passerelle de fournir une méthode robuste, efficace et flexible pour manipuler des loci génomiques endogènes. Dans ce protocole, nous fournissons des détails étape par étape sur la façon de (1) la conception individuaL vecteurs, (2) comment cloner de grands fragments d&#39;ADN génomique dans le vecteur de recombinaison homologue en utilisant gap repair, et (3) comment remplacer ou étiqueter les gènes d&#39;intérêt au sein de ces vecteurs à l&#39;aide d&#39;un second tour de recombineering. Enfin, nous allons également fournir un protocole pour savoir comment mobiliser ces cassettes in vivo pour produire un knock-out ou un gène marqué par knock-in. Ces méthodes peuvent facilement être adoptées pour plusieurs cibles en parallèle et fournissent un moyen pour manipuler le génome de la drosophile dans une manière opportune et efficace.

Amplification de la LA et bras d&#39;homologie RA devrait produire 500 produits BP et la réaction de PCR-SOE devrait donner une kb produit 1.0 (Sections 2.1-2.4; figure 2). La réaction BP effectué dans la section 2.5 est généralement très efficace et transformation bactérienne des rendements des produits 5-100 des colonies en moyenne. Presque toutes les colonies testées par PCR cochez la case Afficher le produit de PCR attendu. Lors du premier tour de recombineering (Section...

Techniques de recombinaison homologue progresser considérablement<em&gt; Drosophila</em&gt; Génétique en permettant la création de mutations moléculaires précises. L&#39;adoption récente de recombineering permet de manipuler de gros morceaux de l&#39;ADN et les transformer en<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. Les méthodes présentées ici combiner ces techniques afin de générer rapidement de grands vecteurs de recombinaison homologue.

Recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

L'objectif général de cette procédure est de générer rapidement de grands vecteurs de recombinaison homologue pouvant être utilisés pour cibler et manipuler des loci oph endogènes. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord un clone vecteur couvrant la région génomique d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à cloner des bras d'homologie dans un vecteur de recombinaison homologue.La troisième étape consiste à cloner l'ADN génomique dans le vecteur de recombinaison homologue par réparation de lacune. La dernière étape consiste à remplacer la région génomique par la cassette de ciblage. En définitive, ces procédures permettront de concevoir un vecteur de ciblage pour la recombinaison homologue Enzo afin de générer des mutations nulles incontestables ou de marquer des protéines endogènes chez Drosophila en utilisant des techniques basées sur la recombinaison.En outre, le manuscrit écrit inclut également un protocole détaillant comment mobiliser ces cassettes in vivo afin de générer un gène nul ou un gène marqué par insertion ciblée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle peut facilement être adaptée à plusieurs cibles en parallèle, et qu'elle offre un moyen de manipuler le génome d'oph de manière rapide et efficace. Pour atteindre cet objectif, nos méthodes combinent les technologies de recombinaison et d'entrée (gateway) afin de produire les vecteurs destinés à la recombinaison homologue.Contrairement à la restriction classique utilisée dans le clonage par ligase, ces technologies ne sont pas limitées par la taille ou la séquence de l'ADN, facilitant ainsi le processus de clonage. Bien que ce protocole décrive une méthode pour générer une cassette d'adressage destinée à l'inactivation génique, il peut également être utilisé pour manipuler n'importe quel locus endogène de manière pratiquement souhaitable. Cela inclut le marquage d'un gène d'intérêt, le remplacement d'un gène d'intérêt par GAL quatre, ou la génération de lignées exprimant des protéines tronquées ou des lignées rapporteuses. Pour obtenir un retour sur le gène d'intérêt, qui est CG 3 2 0 9 5.Dans cet exemple, ouvrez une recherche pour le gène@flybased.org. Pour obtenir la liste des souches. Consultez la section « Stocks et réactifs » et examinez la section intitulée « Clones génomiques ».À partir des options disponibles, sélectionnez un clone qui inclut au moins 10 kilobases en amont et cinq kilobases en aval du gène d'intérêt. Ces régions sont utilisées comme bras d'homologie. Cela peut être réalisé en alignant les séquences des extrémités 5' et 3' du dos contre le génome de drosophile.Alternativement, les clones dans le vecteur Pac-Man peuvent également être trouvés@pacmanfly.org. Sélectionnez maintenant des amorces pour amplifier les 500 paires de bases situées à l'extrémité de chacun des bras d'homologie. Ces fragments, appelés LA et RA, sont utilisés pour recombiner la région génomique située entre les bras d'homologie dans le Pacman.Plasmide KO 1,0. Veillez à ce que les bras d'homologie de 500 paires de bases ne contiennent pas de sites de restriction BAM H1, car ceux-ci seront digérés pour linéariser le plasmide. Préparez deux réactions PCR individuelles afin d'amplifier les fragments LA et RA ; pour le fragment LA, incorporez une séquence TTV1 dans l'amorce sens et une séquence ISC1 dans l'amorce antisens.Incorporez le site AB MH un à sept bases en aval (en direction 3') de la séquence complémentaire correspondant au bras d'homologie opposé. Pour le fragment RA, incluez le site AB MH un à sept bases en aval (en direction 3') de la séquence complémentaire correspondant au bras opposé dans l'amorce directe, ainsi que les séquences at TB deux et I sce E un dans l'amorce inverse comme matrice. Utilisez un microlitre d'ADN génomique provenant d'une préparation mini sale, ou un demi-microlitre de bactéries contenant l'ADN qui ont été cultivées toute la nuit et portées à ébullition, pour cette étape et toutes les PCR ultérieures.Veillez à utiliser une ADN polymérase dotée d'une capacité de correction. Cela n'est toutefois pas nécessaire pour les contrôles par PCR. Faites migrer les échantillons de PCR sur un gel d'agarose à 1 % et extrayez les produits à l'aide d'un kit de récupération d'ADN XMO clean.Éluez l'ADN avec 10 microlitres d'eau stérile. Ensuite, à l'aide de 10 à 30 nanogrammes de chaque ADN amplifié, effectuez un assemblage par PCR par extension par recouvrement.Cela utilise généralement environ un vingtième des produits PCR purifiés. À présent, en utilisant une réaction BP selon le protocole du fabricant, cloner le fragment fusionné LARA dans le plasmide Pacman KA. Ce plasmide peut être demandé au laboratoire Boost Truck. Inoculer des cellules SW102 contenant le fragment d'intérêt dans quatre millilitres de LB additionné de l'antibiotique de sélection approprié, dans ce cas précis, 25 microgrammes par millilitre.Chloramphénicol : faire croître la culture à 32 degrés Celsius pendant la nuit à 250 tr/min. Veiller à ce que la température ne dépasse pas 32 degrés Celsius, sinon le mécanisme de recombinaison des cellules sera activé le jour suivant. Digérer 0,4 microgramme du Pac-Man KO contenant les séquences LA et RA avec environ 20 unités de bmh.Une réaction de 25 microlitres à 37 degrés Celsius. Effectuer une réaction prolongée d'au moins trois heures, car cela est essentiel pour éliminer les faux positifs. Ensuite, ensemencer un millilitre de la culture arrière saturée SW 1 0 2 dans 44 millilitres de LB contenant du chloramphénicol.Incubez-le à 32 degrés Celsius sous agitation jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,2 et 0,3, ce qui prend généralement entre 60 et 90 minutes. Démarrez également une culture parallèle comme témoin négatif sans choc thermique. L'apparition de nombreuses colonies sur ce témoin indique généralement une transformation avec un plasmide non digéré.Pendant la croissance de la culture, faites migrer le plasmide digéré par BAM H1 sur un gel, puis extrayez l'ADN du gel et diluez-le dans 10 microlitres d'eau chauffée, mais certainement pas dans un tampon. À des températures allant jusqu'à 55 degrés Celsius, les sels et les tampons risquent de provoquer des interférences.L'électroporation soumet la culture à un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant exactement 15 minutes dans un bain-marie, tandis que la culture témoin non soumise au choc thermique est maintenue à 32 degrés. Transférez ensuite immédiatement les deux cultures dans des tubes coniques de 50 millilitres refroidis et laissez-les reposer dans un mélange glace-eau pendant cinq minutes. Il est essentiel de maintenir les cellules à basse température pour préserver leur compétence.Ne jamais resuspendre les cellules par pipetage répété ou vortexage. Centrifuger maintenant les cultures, jeter le surnageant et laver le culot dans du glycérol à 10 % glacé ; ajouter d'abord cinq millilitres de glycérol. Ensuite, resus. Suspendez les cellules en tapotant et en agitant, puis ajoutez encore 20 millilitres de glycérol. Répétez la centrifugation et la resuspension dans du glycérol à 10 % deux fois supplémentaires, puis centrifugez les cellules une fois de plus. À ce stade, le culot cellulaire peut être très lâche et il convient de faire attention lors de l’élimination du surnageant.Suspendez maintenant le culot dans un millilitre de glycérol froid à 10 % et transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez les cellules pendant 30 secondes à 12 000 ×g et à 4 °C, puis jetez la majeure partie du surnageant en laissant environ 90 microlitres de cellules dans le glycérol. À ce stade, les cellules peuvent être conservées à −80 °C.Cependant, cela peut réduire leur compétence. Ajoutez maintenant deux microlitres ou 50 nanogrammes du plasmide digéré par BAM H1 aux cellules et mélangez délicatement à l’aide d’une pipette. Transférez le mélange dans une cuvette d’électroporation de un millimètre et faites électroporater les cellules.Ensuite, ajoutez 300 microlitres de SOC et laissez les cellules se recouvrer pendant deux heures à 32 degrés Celsius sans agitation. Après la période de récupération, étalez les cellules sur un milieu gélosé LB contenant 50 microgrammes d'ampicilline par millilitre de solution. Incubez ensuite les cellules à 32 degrés Celsius pendant 24 à 30 heures le jour suivant.Effectuer un criblage des colonies présentant une réparation correcte de l'intervalle par PCR. Utiliser les amorces T three et RA check pour le fragment RA et les amorces T seven et LA check pour le fragment LA. Il est essentiel de tester les deux bras pour le fragment LA, car l'incorporation d'un seul bras, mais pas de l'autre, est parfois observée.Les amorces de contrôle doivent être conçues à 100 à 200 paires de bases du région ciblée. Si les étapes suivantes échouent, ces amorces peuvent être validées à l'aide d'amorces voisines et de l'original comme matrice. Les colonies positives issues de la PCR montreront une bande qui migre à 800 à 1000 paires de bases.Faire pousser les colonies positives à 32 degrés Celsius dans quatre millilitres de milieu contenant de l'ampicilline pendant la nuit ; une conservation congelée de ces cellules peut être préparée pour une utilisation ultérieure. Commencer par amplifier le cassette de disruption du gène RFP à partir du plasmide linéarisé en utilisant les amorces appropriées. Ensuite, purifier le produit sur gel et le resuspendre dans 20 microlitres d'eau stérile.Le cassette RFP avec les bras d'homologie devrait avoir une taille d'environ trois kilobases. Inoculer un millilitre de la culture saturée SW102 Pac-Man KO dans 44 millilitres de milieu LB contenant de l'ampicilline. Faire croître la culture à 32 degrés Celsius sous agitation jusqu'à une DO600 comprise entre 0,2 et 0,3.Inclure également un échantillon identique comme témoin négatif non soumis au choc thermique. Une fois que les cultures ont atteint la densité souhaitée, les purifier pour l'électroporation comme décrit dans la section précédente. Ensuite, électroporer environ 100 nanogrammes de la cassette d'adressage dans 90 microlitres de cellules électrocompétentes en utilisant la même méthode décrite précédemment.Après avoir laissé les cellules se recouvrer pendant deux heures, ensemencez-les sur des géloses LB contenant de l'ampicilline et de la canamycine, puis incubez les boîtes pendant 24 à 30 heures à 32 degrés Celsius. Le jour suivant, faites croître des cultures de cinq millilitres à partir de cinq colonies différentes à 32 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, réalisez une minipréparation brute et déposez la moitié de l'ADN obtenu sur un gel d'agarose à 1 % afin de rechercher la présence d'un plasmide de faible poids moléculaire.Il ne devrait y avoir aucun plasmide migrant en dessous de 12 kilo bases, comme observé dans la piste deux de ce gel. Préparez maintenant une dilution au 1/500 de l'ADN provenant d'un clone positif et utilisez un microlitre de l'ADN dilué pour transformer 50 microlitres de cellules Tmax epi 300. Plaquez les cellules epi 300 récupérées sur un milieu gélosé LB contenant de l'ampicilline et de la canamycine, puis incubez-les 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, inoculez une colonie isolée dans 10 millilitres de LB additionné d'antibiotiques et faites-la croître toute la nuit. Le lendemain matin, ensemencez 100 millilitres de LB à partir de la culture saturée.Ajoutez les antibiotiques appropriés et ajoutez 100 microlitres de solution de contrôle de copie à 1000 x. Incubez la culture à 37 degrés Celsius pendant cinq à six heures avec agitation plus tard dans la journée. Effectuez une préparation maxi et vérifiez l'insertion du cassette au site correct par séquençage.Concevez et réalisez maintenant un test de digestion par enzymes de restriction en utilisant un clone aux résultats de séquençage corrects afin de caractériser le vecteur combier. Dans cet exemple, le vecteur d'adressage CG 3 2 0 9 5 a été digéré en série avec PAC un, ASC un, BH un et une T deux. L'apparition de toutes les bandes prédites et l'absence de toute bande incorrecte confirment que le vecteur d'adressage a été correctement combier.Le vecteur peut désormais être transformé dans des mouches. Les mouches transformées exprimant la recombinase peuvent être sélectionnées parmi leur descendance. Remarquez que les grands vecteurs sont sensibles au cisaillement.Nous évitons les cycles de congélation-décongélation et préparons de l'ADN frais pour l'injection. Les mouches transgéniques obtenues contiennent le construct ciblé à un site d'insertion prédéfini, mais pas encore au locus endogène dans le génome. L'étape finale, qui consiste à remplacer le locus endogène, ne nécessite aucune biologie moléculaire supplémentaire, mais uniquement des méthodes standards publiées sur la drosophile, incluant la mobilisation du cassette ciblé par choc thermique et un criblage des mouches pour la réintégration du cassette ciblé à l'écart du site d'insertion d'origine.Ces méthodes sont décrites dans des publications récentes. L'amplification des bras d'homologie LA et RA doit produire des produits de 500 paires de bases, et la réaction P-C-R-S-O-E doit générer un produit d'un kilobase. La réaction BP est généralement très efficace.La transformation bactérienne de son produit donne généralement cinq à cent colonies. Presque toutes les colonies testées par contrôle PCR présentent le produit attendu lors du premier cycle de recombinaison. Prévoir d'obtenir de 20 à 40 colonies après la transformation du Pacman KO 1,0 digéré, contenant les bras LA et RA, dans des cellules SW102 contenant le gène d'intérêt. De 40 à 60 % de ces clones porteront le produit de recombinaison souhaité.Dans cet exemple, environ 60 colonies ont été obtenues et le contrôle par PCR a montré qu'environ 60 % des colonies portaient le produit de recombinaison souhaité. Le deuxième tour de recombinaison est généralement beaucoup plus efficace. Habituellement, trois à 50 colonies sont observées après la transformation, dont 90 à 95 % contiennent la construction souhaitée. Le plasmide inférieur à 12 kilobases permet d'identifier les colonies faussement positives, comme le clone deux.Dans cet exemple, lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de garder à l'esprit que, chez les bactéries, la recombinaison de grands fragments d'ADN est très inefficace. Par conséquent, pour obtenir des résultats optimaux, il est essentiel de préparer des cellules compétentes de haute qualité et d'utiliser de l'ADN frais.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de générer un vecteur de ciblage pour la recombinaison homologue N out dans Drosophila. Ce vecteur pourrait être utilisé pour produire toute manipulation propre et définie sur le plan moléculaire de gènes uniques au niveau de leurs loci endogènes.

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