Name: Recombineering homologues constructions de recombinaison Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Apprenez à générer des vecteurs de recombinaison homologue dans Drosophila par recombinaison pour créer des mutations nulles et marquer des protéines endogènes. Cette méthode précise facilite l'étude des fonctions géniques.

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Nous tenons à remercier Hugo Bellen et l&#39;Bloomington Stock Center for réactifs. Nous remercions encore Koen Venken, Hugo Bellen et tous les membres du laboratoire Buszczak et Hiesinger pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national de la santé de l&#39;ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) et Mo (RO1GM086647), une subvention de l&#39;Institut de recherche sur la prévention du cancer du Texas à Mo et PRH (RP100516), et le Welch Foundation (I-1657) à PRH. MB est un EE et Greer Garson Fogelson Scholar dans la recherche biomédicale et PRH est un McDermott Scholar Eugene dans la recherche biomédicale à l&#39;UT Southwestern Medical Center.

<ol><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li>
<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas des intérêts divergents en ce qui concerne les techniques décrites ici.

La puissance des organismes modèles génétiques dans la recherche biomédicale repose en grande partie sur les outils disponibles pour la manipulation génétique. Les petits modèles C. elegans et Drosophila en particulier permettre des analyses génétiques moléculaires peu coûteux et rapide des parcours complets et des familles de gènes impliqués dans le développement ou la fonction multicellulaire. Ces dernières années ont vu des avancées significatives dans le développement d&#39;outils pour la manipulat...

Nettoyez manipulations moléculaires définis de gènes uniques à leurs loci endogènes offrent un outil précieux pour étudier une multitude de questions pertinentes à la biologie eucaryote. Drosophila inverser techniques génétiques pour générer des allèles de perte de fonction s&#39;était avéré être difficile jusqu&#39;à ce que Golic et ses collègues ont introduit dans génique in vivo en utilisant le ciblage recombinaison homologue chez la drosophile 1-3. Ils ont démontré que loci génomiques spécifiques pourraient être ciblés en utilisant un fragment linéaire d&#39;ADN à partir d&#39;une construction transgénique intégré. Cet ADN «donneur» linéaire est généré in vivo par recombinaison FRT à médiation (pour exciser l&#39;ADN du chromosome en une molécule circulaire) puis linéarisation avec la méganucléase I-Scel. Bien que cette méthode a été utilisée avec succès pour produire une variété de lésions définies, la technique n&#39;a pas été facilement évolutive pour la manipulation de nombreux gènes en parallèle car chaque indiviconstruction double KO nécessite une conception distincte et personnalisée. Par exemple, des difficultés à manipuler de façon transparente grands fragments d&#39;ADN (&gt; 5 ko) in vitro en utilisant l&#39;enzyme classique de restriction / ligature clonage ou PCR, ainsi que les limitations de taille de traditionnel dans des vecteurs de transformation in vivo interfèrent souvent avec la création rapide d&#39;une recombinaison homologue ciblage vecteurs. Pour surmonter ces limitations, nous avons combiné le système P [ACMAN] de recombineering / de transgénèse, qui permet au sous-clonage et la transgenèse jusqu&#39;à 100 kb d&#39;ADN, avec le gène extrémités-out méthodologie de ciblage d&#39;établir une plate-forme efficace et relativement rapide que facilite le ciblage génique Drosophila. Recombinaison induite par génie génétique (recombineering) est un puissant recombinaison homologue basé sur la technologie du clonage 4,5. Contrairement aux enzyme / ligase clonage de restriction conventionnelle, recombineering n&#39;est pas limitée par la séquence ou Size de l&#39;ADN manipulée. Recombineering utilise un E. spéciale coli souche qui abrite les machines de recombinaison fourni par un λ défectueux prophage 4. Cette technique a récemment été adopté pour une utilisation chez la drosophile 6,7. Recombineering chez la drosophile repose sur un chromosome modifié conditionnellement amplifiable artificiel bactérien (BAC) de vecteur appelé P [ACMAN] 6,7. Ce vecteur porte deux origines de réplication: oriV, qui produit nombre élevé de copies lors de l&#39;induction chimique pour la purification de grandes quantités d&#39;ADN nécessaires pour le séquençage et l&#39;injection de l&#39;embryon et Oris, qui maintient faible nombre de copies dans des conditions basales. En outre, le P [ACMAN] vecteur est équipé d&#39;un site de fixation des bactéries (attB). Le site attB sert de substrat pour la transgenèse OC31 intégrase à médiation qui permet l&#39;incorporation de grands fragments d&#39;ADN dans un site d&#39;atterrissage prédéterminée à l&#39;intérieur du génome de la drosophile 8,9. Nous avons généré un P [ACMAN] vecteur (dénommé P [ACMAN] KO 1.0) qui peut être utilisé comme un vecteur de ciblage à des fins départ recombinaison homologue 10,11. Pour intégrer extrémités-out ciblage génique technologie dans le système, nous avons ajouté deux deux sites I-Scel FRT et. Nous avons également inclus une cassette Gateway dans ce vecteur modifié pour simplifier le processus d&#39;incorporation des bras d&#39;homologie en P [ACMAN] KO 1.0. Cela fournit un moyen rapide et simple d&#39;introduire pratiquement n&#39;importe quelle région génomique d&#39;intérêt dans le vecteur de ciblage. Dans ce protocole, nous allons décrire comment concevoir un vecteur de ciblage en utilisant P [ACMAN] KO 1.0, et comment mobiliser ce vecteur in vivo pour cibler le locus endogène. Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser la cassette DDP / Kan pour remplacer un gène d&#39;intérêt, mais une variété de cassettes qui contiennent un marqueur de sélection antibiotique peut être utilisé avec ce protocole. Nous avons conçu et utilisé avec succès une série de cassettes pourremplacement d&#39;un gène et l&#39;étiquetage 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Bactéries compétentes en recombinaison</td><td>NCI-Frederick</td><td>Bactéries de recombinaison (SW102, SW105 et SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx » target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Comprend CopyControl solution d’induction</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS ADN polymérase</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit de récupération d’ADN</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Kit enzymatique</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak et Hiesinger Labs</td><td>Sur demande</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak et Hiesinger Labs</td><td>Upon demande</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomington stock center</td><td>Numéros de stock : 25680, 25679</td><td>y1 w* / Dp(2 ; Y)G, P{hs-hid}Y ; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2 ; Y)G, P{hs-hid}Y ; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Machine d’électroporation</td><td>Biorad GenePulser Xcell avec module PC</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Brand</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

La poursuite du développement des techniques de manipulation rapide et à grande échelle des loci des gènes endogènes permettra d&#39;élargir l&#39;utilisation de Drosophila melanogaster comme un organisme modèle génétique pour la recherche liée à la maladie humaine. Ces dernières années ont vu des progrès techniques comme la recombinaison homologue et recombineering. Cependant, générant des mutations nulles équivoques ou des protéines endogènes de marquage reste un effort substantiel pour la plupart des gènes. Ici, nous décrivons et démontrer les techniques pour l&#39;utilisation de méthodes de clonage recombineering basés à générer des vecteurs qui peuvent être utilisés pour cibler et manipuler des loci endogènes in vivo Plus précisément, nous avons mis en place une combinaison de trois technologies:. (1) BAC transgénèse / recombineering, ( 2) extrémités-out recombinaison homologue et (3) la technologie de passerelle de fournir une méthode robuste, efficace et flexible pour manipuler des loci génomiques endogènes. Dans ce protocole, nous fournissons des détails étape par étape sur la façon de (1) la conception individuaL vecteurs, (2) comment cloner de grands fragments d&#39;ADN génomique dans le vecteur de recombinaison homologue en utilisant gap repair, et (3) comment remplacer ou étiqueter les gènes d&#39;intérêt au sein de ces vecteurs à l&#39;aide d&#39;un second tour de recombineering. Enfin, nous allons également fournir un protocole pour savoir comment mobiliser ces cassettes in vivo pour produire un knock-out ou un gène marqué par knock-in. Ces méthodes peuvent facilement être adoptées pour plusieurs cibles en parallèle et fournissent un moyen pour manipuler le génome de la drosophile dans une manière opportune et efficace.

Amplification de la LA et bras d&#39;homologie RA devrait produire 500 produits BP et la réaction de PCR-SOE devrait donner une kb produit 1.0 (Sections 2.1-2.4; figure 2). La réaction BP effectué dans la section 2.5 est généralement très efficace et transformation bactérienne des rendements des produits 5-100 des colonies en moyenne. Presque toutes les colonies testées par PCR cochez la case Afficher le produit de PCR attendu. Lors du premier tour de recombineering (Section...

Techniques de recombinaison homologue progresser considérablement<em&gt; Drosophila</em&gt; Génétique en permettant la création de mutations moléculaires précises. L&#39;adoption récente de recombineering permet de manipuler de gros morceaux de l&#39;ADN et les transformer en<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. Les méthodes présentées ici combiner ces techniques afin de générer rapidement de grands vecteurs de recombinaison homologue.

Recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

L'objectif général de cette procédure est de générer rapidement de grands vecteurs de recombinaison homologue pouvant être utilisés pour cibler et manipuler des loci oph endogènes. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord un clone vecteur couvrant la région génomique d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à cloner des bras d'homologie dans un vecteur de recombinaison homologue.La troisième étape consiste à cloner l'ADN génomique dans le vecteur de recombinaison homologue par réparation de lacune. La dernière étape consiste à remplacer la région génomique par la cassette de ciblage. En définitive, ces procédures permettront de concevoir un vecteur de ciblage pour la recombinaison homologue Enzo afin de générer des mutations nulles incontestables ou de marquer des protéines endogènes chez Drosophila en utilisant des techniques basées sur la recombinaison.En outre, le manuscrit écrit inclut également un protocole détaillant comment mobiliser ces cassettes in vivo afin de générer un gène nul ou un gène marqué par insertion ciblée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle peut facilement être adaptée à plusieurs cibles en p

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La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de transfert de Southern pour identifier les événements de recombinaison homologue dans le génome de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de sondes radiomarquées. Les régions de l’ADN contenant des événements de recombinaison homologue apparaissent sous forme de bandes distinctes lorsque la membrane contenant l’ADN lié à la sonde est exposée aux rayons X.

Transfert de Southern pour détecter la recombinaison homologue dans le génome de cellules souches embryonnaires de souris

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Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

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le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

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Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

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Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

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