Name: Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion dinsuline par les cellules bêta du pancréas (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Découvrez une méthode de coculture pour étudier les interactions protéiques transcellulaires affectant la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques. Cette approche évite la perturbation directe des cellules bêta.

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Ce travail a été financé par les Instituts de la Santé subvention R01DK080971 et Juvenile Diabetes Research Foundation subvention 37-2009-44 nationale. Nous apprécions également le soutien reçu de la Pediatric Research Center Diabetes UCSD (CEDE).

1. La transfection de cellules HEK293 couche <ol><li> Préparer milieu cellulaire HEK293 en ajoutant à bouteilles de 500 mL de DMEM (avec 4,5 g / ml de glucose et rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / solution de streptomycine, 5 ml de solution de L-glutamine 100x et 500 amphotéricine ul B. </li><li> Plate sur les cellules HEK293 dans une plaque de 24 puits en utilisant 0,5 ml de HEK293 médias par puits. S&#39;assurer que les cellules sont réparties uniformément sur le fond de la plaque. </li><li> Lorsque les cellules HEK293 atteindre 100% de confluence, transfect avec 0,8 ug de plasmide codant la protéine d&#39;intérêt (inséré dans un vecteur d&#39;expression mammalien) et 2 ul de Lipofectamine 2000, selon le protocole Lipofectamine. Nous avons choisi d&#39;utiliser le pcDNA 3.3 épine dorsale conçu pour l&#39;expression dans les cellules de mammifères. </li><li> Eventuellement, après 6 heures d&#39;incubation, échange les médias de transfection décrit dans le protocole Lipofectamine avec HEK293 médias normales. </li><li> Pour évaluer l&#39;expression de la prote transfectéesdans un sous-ensemble des puits de culture tissulaire transfectées peut être utilisé pour la détection par immunofluorescence de la protéine exprimée ou pour l&#39;analyse par Western blot de l&#39;expression de protéines en utilisant des techniques standard. </li></ol> 2. Fixation facultative de cellules HEK293 exprimant la protéine transfectées Cellules HEK293 transfectées peuvent être fixés doucement afin de faciliter co-culture dans les médias susceptibles de nuire à la vie des cellules HEK293 (par exemple étape 3.9 ci-dessous) ou pour permettre la préparation efficace à l&#39;avance des plaques de plusieurs expériences à la fois (voir également la discussion). <ol><li> Mener des études pilotes afin de déterminer l&#39;évolution temporelle de l&#39;expression de la protéine dans les cellules HEK293. </li><li> Après transfection de la couche de cellules HEK293, aspirer le support à partir des cellules au point de temps après la transfection associé à plus haut niveau d&#39;expression. Si cela se produit dans les 24 premières heures, ne pas aspirer jusqu&#39;à 24 heures après transfection. </li><li> Lavez HEK293 cellules doucement avec D-PBS puis ajouter 500 ul paraformaldéhyde 4% (PFA) et incuber à température ambiante pendant 30 min. (Pour faire une solution à 4% PFA, commencer avec une solution de 16% dans du PBS 1X et diluer à 1:4 avec du PBS 1X.) </li><li> Utiliser PBS stérile, laver délicatement les cellules 3 fois et les incuber dans du PBS O / N à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules 3 fois avec du PBS stérile, puis ajouter PBS et laisser à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire (durée de stockage maximale peut varier en fonction de la protéine exprimée. Nous stockons des cellules HEK293 transfectées pour exprimer isoformes neuroligin pendant 2 semaines sans changements importants dans les effets observés sur la sécrétion d&#39;insuline). </li></ol> 3. Co-culture de cellules INS-1 bêta avec cellules HEK293 <ol><li> Préparer INS-1 média en ajoutant à 500 ml de milieu RPMI 1640 (avec le glucose et le rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / streptomycine, 5 ml de solution 100X L-glutamine, 5 ml de pyruvate de sodium, 500 amphotéricine pl B, 500 pl bêta-mercaptoéthanol (ce qui est presque identique à la médecineum généralement utilisé pour la culture des îlots primaire à l&#39;exception de l&#39;ajout de bêta-mercaptoéthanol). </li><li> Utilisation de Cell-strip-teaseuse (ou un autre solvant de cellule non enzymatique), INS-1 récolte des cellules à environ 70-80% de confluence du fond d&#39;un flacon de culture T75. Chaque flacon fournira suffisamment de cellules pour environ 48 puits. </li><li> Après filer vers le bas des cellules dans la centrifugeuse pendant 3 min à 1200 rpm, remettre en suspension dans un mélange 50/50 de l&#39;INS-1 et médias HEK. Pour un flacon confluent de 70-80% des cellules INS-1, remettre en suspension dans environ 25 ml de médias mixtes. </li><li> Si vous utilisez des cellules HEK293 qui ont été fixés dans du paraformaldéhyde plutôt que des cellules vivantes HEK293, remettre en suspension les cellules INS-1 à 100% INS-1 médias plutôt que de techniques mixtes. </li><li> En utilisant une pipette de 10 ml, de déloger des cellules de la pastille pour faire une suspension de cellules homogène. </li><li> Aspirer à retirer le support sur les cellules HEK293. </li><li> Avec une pipette P1000, ajouter délicatement 500 pl de suspension cellulaire INS-1 sur la couche de cellules HEK le long des côtés of le puits. Après tous les 6 puits, utiliser une pipette de 10 ml pour remettre à nouveau les cellules INS-1 pour assurer une suspension de cellules homogène. L&#39;économie générale de la co-culture set-up est représenté dans la figure 1. </li><li> Incuber les cellules pendant 24-48 heures selon le protocole expérimental. </li><li> Si plus de 48 période de coculture h est nécessaire, utiliser des étapes facultatives de la section 2 ci-dessus pour fixer les cellules HEK293. </li><li> Si vous utilisez rongeur dissocié primaire ou îlots humains [voir par exemple les protocoles antérieurs dans JoVE 11-15], veiller à ce que des médias appropriés, tels que RPMI avec stylo 5 ml / streptomycine, 5 ml L-Glut, 0,5 ml d&#39;amphotéricine-B est utilisé à la place de INS-1 médias. Même si on peut utiliser des cellules d&#39;îlots dissociées dans une plaque à 24 puits, dans la pratique, en raison du grand nombre d&#39;îlots potentiellement nécessaires, il est recommandé que l&#39;on envisage de mise à l&#39;échelle vers le bas sur une plaque à 48 puits (nécessitant moins de cellules des îlots pancréatiques par puits). Sur une plaque à 48 puits, ajouter environ 100 îlots de dollars de dissociationted cellules par plaque pour commencer. Selon l&#39;efficacité de la dissociation et la méthode utilisée, moins d&#39;îlots peuvent être nécessaires. </li></ol> 4. Glucose sécrétion d&#39;insuline stimulée <ol><li> Préincuber cellules dans 250 ul de 2,5 mM de glucose dans KRB (tampon bicarbonate de Krebs-Ringer) pour un minimum de 1 heure. Pour préincuber, éliminer le milieu de co-culture et remplacer immédiatement avec KRB. Cet échange devrait se faire un bien à la fois pour minimiser l&#39;exposition des cellules INS-1 à l&#39;oxygène de l&#39;environnement. Aspirer avec une main pendant le pipetage le bas (2,5 mm) KRB de glucose avec l&#39;autre. </li><li> Bourse pré-incubation KRB à 250 pi de 2,5 mM ou 20 mM de glucose dans KRB tampon d&#39;un bien à un moment. </li><li> Le cas échéant, pour l&#39;expérience spécifique, sécrétagogues supplémentaires telles que 100 um IBMX peuvent être ajoutés pour produire une réponse de sécrétion d&#39;insuline stimulée plus robuste. Les cellules dissociées bêta des îlots pancréatiques primaires en particulier, sont mal répondre à l&#39;augmentation des concentrations de glucose alone, alors voici surtout plus de IBMX ou autres sécrétagogues doit être considérée 16,17. </li><li> Après 1 heure d&#39;incubation, le milieu de transfert à Microfuge tubes et filent 1500 g pendant 5 min. </li><li> Retirer 200 pi du surnageant et l&#39;utiliser pour l&#39;analyse par l&#39;insuline RIA ou ELISA. </li><li> Pour préparer lysat cellulaire, ajouter 100 ul de tampon de lyse cellulaire RIPA (NaCl 150 mM, 1,0% IGEPALCA-630 ou Nonidet P-40, 0,5% de désoxycholate de sodium, SDS 0,1%, Tris 50 mM, pH 8,0) avec les inhibiteurs de protéase pour le plaque immédiatement après avoir retiré les médias et incuber à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Isoler lysat pendant 15 min à 10000 xg et éliminer 50 pi de surnageant pour analyse par l&#39;insuline RIA ou ELISA. </li></ol>

<ol><li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li>
<li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).</li>
<li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-secreting+cell+lines%3A+classification%2C+characteristics+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li>
<li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+central+synapse%3A+clues+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li>
<li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neurexin%2C+neuroligin%2C+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li>
<li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli%3A+enhanced+Ca2%2B+and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li>
<li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9(2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La méthode décrite ici co-culture est un moyen efficace pour déterminer l&#39;importance physiologique de protéines beta-cell-surface, transmembranaires spécifiques, et en particulier de leurs domaines extracellulaires. Par les cellules bêta de culture ou de cellules d&#39;insulinome (comme les cellules INS-1 utilisés ici) en contact avec les cellules HEK293 affichant une protéine d&#39;intérêt sur la surface de la cellule, les expériences peuvent être conçues pour déterminer les effets des interactions protéine-protéin...

Nous décrivons ici une méthode pour faciliter les enquêtes sur la façon dont les domaines extracellulaires de protéines transmembranaires spécifiques affectent la sécrétion d&#39;insuline. La méthode des sondes les effets des interactions de la protéine d&#39;intérêt avec des protéines (ou éventuellement d&#39;autres molécules) sur la surface des cellules bêta pancréatiques. Le procédé permet des enquêtes de comment les protéines de surface cellulaire exprimée par des cellules bêta ou par d&#39;autres cellules voisines (par exemple des cellules endothéliales, des neurones, des cellules alpha du pancréas) affectent la fonction des cellules bêta par des interactions transcellulaires (soit par des interactions avec des partenaires d&#39;interaction sur la surface de côté cellules bêta). La membrane de plasma cellulaire contient un ensemble complexe de protéines structurales et fonctionnelles servant de ponts pour le milieu extracellulaire. Par la formation de connexions transcellulaires ou par l&#39;initiation des événements de signalisation en plastique, les interactions entre les protéines de surface cellulaire peuvent aider à coordonner l&#39;la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés dans les îlots pancréatiques et d&#39;agir de manière coordonnée pour maintenir l&#39;homéostasie du glucose 1. Comme l&#39;a révélé, par exemple, par l&#39;importance des extracellulaire EPHA-ephrinA et neuroligin-2 interactions dans la régulation du glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline, il devient de plus en plus clair que l&#39;augmentation de la connaissance des interactions extracellulaires qui se produisent entre les protéines sur les surfaces de côté cellules bêta seront d&#39;une grande importance pour acquérir une compréhension complète de la sécrétion d&#39;insuline, les bêta maturation fonctionnelle des cellules et le maintien de l&#39;homéostasie du glucose 1-3. Le but de la méthode décrite ici est de permettre à des enquêtes sur les effets sur la fonction des cellules bêta des interactions transcellulaires impliquant transmembranaire spécifique ou des protéines non-surface cellulaire associés. Par les cellules bêta co-culture avec des cellules HEK293 transfectées avec différentes constructions d&#39;expression, les effets sur la bla fonction des cellules ETA de différentes protéines de surface cellulaire ou des variantes mutantes de celui-ci peut être sondé efficacement. Ceci est accompli sans avoir à transfecter les cellules bêta eux-mêmes. L&#39;élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l&#39;ARNm des cellules bêta et l&#39;expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d&#39;une manière qui pourrait fausser l&#39;analyse des les effets des interactions spécifiques extracellulaires. Ces approches également modifier les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et, de plus, ne laissez pas les effets dus aux interactions entre protéines sur ou dans la même cellule à se distinguer des effets des interactions transcellulaires. Ici, un procédé pour déterminer l&#39;effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l&#39;insuline et de la réactivité des cellules bêta est Described. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta qui sécrètent l&#39;insuline, tels que les cellules INS-1, 4 et rongeurs primaire dissocié ou des cellules bêta humaines. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l&#39;exposition des neurones en culture à des protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules pourrait identifier les protéines qui conduisent à la formation des synapses 5,6. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la fonction des cellules bêta et la maturation fonctionnelle pourraient être conduits par des interactions similaires transcellulaires 7-9. Afin de sonder ces interactions, nous avons développé le système décrit ici, dans lequel les cellules bêta sont co-cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d&#39;intérêt 10. Ce système permet le cytoplasme des cellules bêta de rester intact pendant des interactions protéine-protéine extracellulaire sont manipulés.

<table><tbody><tr><td>pcDNA 3.3 vecteur/squelette</td><td>Invitrogen</td><td>K830001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>18324012</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>45001-312</td><td></td></tr><tr><td>Solution stylo/streptocoque</td><td>Mediatech</td><td>45001-652-1</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Mediatech</td><td>45001-808-1/30</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Mediatech</td><td>45001-404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-434</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Mediatech</td><td>45001-710-1</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211 ; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Décapant cellulaire</td><td>Mediatech</td><td>45000-668</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flacon</td><td>BD</td><td>1368065</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma</td><td>I5879-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d&#39;insuline par les cellules bêta du pancréas

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Les interactions entre les protéines de surface cellulaire aider à coordonner la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés au sein des îlots pancréatiques et d&#39;agir de manière coordonnée pour maintenir l&#39;homéostasie du glucose. Il devient de plus en plus clair que les interactions entre protéines transmembranaires à la surface des cellules bêta adjacents sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta. L&#39;élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l&#39;ARNm et l&#39;expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d&#39;une manière qui pourrait fausser les analyses des effets des interactions spécifiques. Ces approches modifient également les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et peuvent prévenir les effets dus aux interactions entre protéines dans la même membrane cellulaire pour être affichéedistingué des effets des interactions transcellulaires. Ici, un procédé pour déterminer l&#39;effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l&#39;insuline et de la réactivité des cellules bêta est présenté. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta, comme les cellules INS-1, et pour les cellules bêta primaires dissociées. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l&#39;exposition des neurones en culture de protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules protéines identifiées sont déterminantes pour stimuler la formation des synapses. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la maturation fonctionnelle des cellules bêta peut être entraînée par des interactions transcellulaires similaires. Nous avons développé un système où les cellules bêta sont cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d&#39;intérêt. Dans ce modèle, le cytoplasme des cellules bêta est intact tandis extracellulaire INTERACTIONS de protéine-protéinens sont manipulés. Bien que nous nous concentrons ici principalement sur les études de glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline, d&#39;autres procédés peuvent être analysés, par exemple, des changements dans l&#39;expression des gènes tels que déterminés par immuno ou qPCR.

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons testé l&#39;effet de différentes variantes de la neuroligin de protéines sur la sécrétion d&#39;insuline. Cela complète notre travail publié étudier l&#39;effet de neuroligin-2 sur la fonction des cellules bêta 10. Figure 2, par exemple, décrit les résultats obtenus à partir INS-1 co-culture de cellules bêta avec des cellules HEK293 transfectées pour exprimer un neuroligin isoforme appelée ici NL- X. Cette expérience a été conçue pour tester l&#...

Les interactions entre protéines transcellulaires sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta du pancréas. Détaillé ici est une méthode adaptée à partir d&#39;un modèle de co-culture de synaptogénèse-pour étudier comment les protéines transmembranaires spécifiques influencent la sécrétion d&#39;insuline. Cellules HEK293 transfectées expriment des protéines d&#39;intérêt, les cellules bêta n&#39;ont pas besoin d&#39;être transfectées ou non directement perturbé.

Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d&#39;insuline par les cellules bêta du pancréas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier comment les interactions transcellulaires impliquant les domaines extracellulaires de protéines transmembranaires spécifiques affectent la fonction des cellules bêta, et plus particulièrement la sécrétion d'insuline. Cela est réalisé en transfectant tout d'abord une lignée cellulaire de mammifère avec un plasmide contenant la protéine d'intérêt, puis en co-cultivant une lignée de cellules bêta avec les cellules de mammifère.Dans la dernière étape, la co-culture est incubée dans des milieux contenant différentes concentrations de glucose afin de permettre l'évaluation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose. En fin de compte, des radio-immunodosages d'insuline ou des ELISA sont utilisés pour évaluer les niveaux d'insuline sécrétés dans le milieu par les cellules bêta cultivées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la surexpression génique ou l'extinction génique, est qu'elle évite toute perturbation de l'expression des ARNm et des protéines, perturbation qui pourrait affecter la santé et/ou la fonction des cellules bêta de manière à fausser l'analyse de l'interaction sp

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La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l'induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D'une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Fonctionnalités de bêta-cellules sont importante pour l’homéostasie du glucose dans le sang, qui est évalué à cellule unique résolution utilisant un journaliste génétiquement codé pour l’influx de calcium.

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Des études ex vivo îlots pancréatiques sont importants pour la recherche sur le diabète. Les techniques existantes pour étudier des îlots cultivés dans leur architecture 3D natif sont chronophages, inefficace et rarement utilisés. Cet ouvrage décrit une méthode nouvelle, simple et efficace pour générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots cultivés ensemble.

Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.

Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

Ce protocole décrit comment effectuer des essais rapides de luciferase à faible coût à débit moyen à l'aide d'une luciferase Gaussia liée à l'insuline comme un proxy pour la sécrétion d'insuline à partir de cellules bêta. L'analyse peut être effectuée avec la plupart des lecteurs de plaques de luminescence et des pipettes multicanaux.

Mesurer la sécrétion relative d'insuline à l'aide d'une mère porteuse co-sécrétée par Luciferase

Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.

Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

Cette étude utilise des marqueurs de mort cellulaire et d’apoptose basés sur la fluorescence multicoloration, combinés à la microscopie confocale pour évaluer l’apoptose induite par les cytokines et la mort spécifique des cellules β dans les îlots pancréatiques. Il révèle des changements spatiaux et temporels dans la mort cellulaire et l’apoptose en réponse à des stimuli extracellulaires.

Traitement isolé des îlots pancréatiques et mesure de l’apoptose

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Découvrez une méthode de coculture pour étudier les interactions protéiques transcellulaires affectant la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques. Cette approche évite la perturbation directe des cellules bêta.

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Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d'insuline par les cellules bêta du pancréas

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