Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d'insuline par les cellules bêta du pancréas
15 juin 2013
Les interactions entre protéines transcellulaires sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta du pancréas. Détaillé ici est une méthode adaptée à partir d'un modèle de co-culture de synaptogénèse-pour étudier comment les protéines transmembranaires spécifiques influencent la sécrétion d'insuline. Cellules HEK293 transfectées expriment des protéines d'intérêt, les cellules bêta n'ont pas besoin d'être transfectées ou non directement perturbé.
L’objectif général de cette procédure est d’étudier comment les interactions transcellulaires impliquant les domaines extracellulaires de protéines transmembranaires spécifiques affectent la fonction des cellules bêta et plus particulièrement la sécrétion d’insuline. Ceci est accompli en transectant d’abord une lignée cellulaire de mammifère avec un plasmide contenant la protéine d’intérêt dans la deuxième étape. Une lignée cellulaire bêta est une co-culture avec les cellules de mammifères.
Dans la dernière étape, la co-culture est incubée dans des milieux avec différentes concentrations de glucose afin de permettre l’évaluation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. En fin de compte, les tests radio-immunologiques d’insuline ou tests d’Eliza sont utilisés pour évaluer les niveaux d’insuline sécrétés dans le milieu par les cellules bêta cultivées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la surexpression et l’inactivation des gènes, est qu’elle évite la perturbation de l’expression de l’ARNm et de la protéine susceptible d’affecter la santé et/ou la fonction des cellules bêta d’une manière qui peut fausser les analyses de l’interaction spécifique de la protéine.
Commencez par transférer les cellules HEC 2 93 sur une plaque à 24 puits dans 0,5 millilitre de média HEC 2 93 par puits pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément sur le fond de la plaque. Secouez la plaque le long d’un axe à la fois à une vitesse synchrone à l’onde formée dans le puits. Lorsque les cellules HEC 2 93 atteignent une fluidité de 100 %, transfectent les cultures avec 0,8 microgramme du plasmide codant pour la protéine d’intérêt dans deux microlitres de lipo 2000.
Selon le protocole lipo, le schéma global de la co-culture qui va être démontrée est décrit ici à l’aide d’un dissolvant de cellules non enzymatique. Commencez cette étape en prélevant des cellules INS à une confluence d’environ 70 à 80 % au fond d’une fiole de culture T 75. Après avoir fait tourner les cellules pendant trois minutes à 150 G à température ambiante, utilisez une pipette P 1000 pour remettre la pastille en suspension dans un millilitre de demi INS un et demi.
Le média utilise ensuite une pipette de 10 millilitres pour ajouter 24 millilitres supplémentaires de milieux mixtes et ressuscite la suspension des cellules en aspirant le milieu des puits de la plaque de 24 puits contenant les cellules HEC 2 9 3. Ensuite, à l’aide d’une pipette P 1000, ajoutez délicatement 500 microlitres de la suspension INS one cell sur la couche de cellules hexagonales le long des côtés du puits. Tous les six puits, utilisez une pipette de 10 millilitres pour remettre en suspension les cellules INS.
Encore une fois pour assurer une suspension cellulaire homogène. Incuber maintenant les cellules pendant 24 à 48 heures, selon le protocole expérimental. Une fois que les cellules ont incubé pendant la période d’expérience souhaitée, un puits à la fois, aspirez le milieu de co-culture d’une main et remplacez immédiatement le milieu par 250 microlitres de glucose de 2,5 millimolaires dans un tampon de bicarbonate de Krebs Ringer de l’autre côté.
Après avoir pré-incubé les co-cultures pendant une heure, remplacez le tampon KRB à faible teneur en glucose par 250 microlitres de glucose de 2,5 millimolaires ou de 20 millimolaires. Après une autre heure d’incubation, transférez le tampon KRB dans des tubes de micro-fuge et faites tourner le tampon pendant cinq minutes à 1500 G et quatre degrés Celsius pendant que les tubes sont dans la centrifugeuse. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire rippa avec inhibiteurs de protéase dans la plaque et incubez la plaque pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
Lorsque les tubes ont fini de tourner, prélever 200 microlitres de surnageant pour une analyse ultérieure par dosage radio-immunologique à l’insuline ou Eliza. Enfin, faites tourner ce qui est maintenant du lysat cellulaire pendant 15 minutes à 10 000 g, puis retirez 50 microlitres de SNAT pour analyse par radio-dosage d’insuline ou Eliza. Ici, les résultats obtenus en co-cultivant des cellules bêta INS one avec des cellules HC 2 93 transfectées pour exprimer une isoforme neuro liggen appelée ici NLX sont présentés.
L’expression de NLX a augmenté la sécrétion basale et stimulée d’insuline par des cellules I NS one co-cultivées. Le domaine extracellulaire NX doit interagir avec une autre protéine ou molécule à la surface de la cellule I NS one pour que les cellules INS sécrètent plus d’insuline. Les résultats d’autres types d’analyses utilisant le système de co-culture sont illustrés dans les deux graphiques suivants.
Dans ce premier graphique, l’augmentation de la teneur en insuline des cellules INS one co-cultivées par NLY est montrée. Alors que dans cette expérience, l’ARN a été récolté dans la couche cellulaire et analysé par R-T-Q-P-C-R. La co-culture avec NLY a augmenté les niveaux d’insuline et d’ARNm PDX 1.
À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que la QPCR ou l’immunohistochimie quantitative peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la question de savoir si les interactions extracellulaires de la protéine transfectée peuvent provoquer des changements dans la structure cellulaire ou l’expression des gènes.
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Aperçu
Cette étude examine le rôle des interactions protéiques transcellulaires dans la fonction des cellules bêta pancréatiques, en se concentrant particulièrement sur la sécrétion d'insuline. La méthode consiste à réaliser une co-culture de cellules HEK293 transfectées avec des cellules bêta afin d'évaluer l'influence de protéines transmembranaires spécifiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Endocrinologie
Contexte
- Les interactions transcellulaires sont cruciales pour la fonctionnalité des cellules bêta.
- La sécrétion d'insuline est un processus clé influencé par ces interactions.
- Les méthodes existantes peuvent perturber la santé des cellules bêta, compliquant ainsi les analyses.
- Cette étude vise à proposer une approche plus affinée.
Objectif de l'étude
- Étudier la manière dont des protéines transmembranaires spécifiques influencent la sécrétion d'insuline.
- Utiliser un modèle de co-culture afin de minimiser la perturbation directe des cellules bêta.
- Évaluer l'impact des concentrations de glucose sur la libération d'insuline.
Méthodes utilisées
- Transfecter des cellules HEK293 avec des plasmides contenant les protéines d'intérêt.
- Cultiver conjointement les cellules HEK293 transfectées avec des cellules bêta.
- Incuber les co-cultures dans des milieux contenant des concentrations variables de glucose.
- Utiliser des radioimmunodosages ou des ELISA d'insuline pour mesurer la sécrétion d'insuline.
Résultats principaux
- Démontré l'influence de protéines transmembranaires spécifiques sur la sécrétion d'insuline.
- Montré que la concentration en glucose affecte la libération d'insuline dans des cellules en co-culture.
- Validé l'efficacité de la méthode par rapport aux techniques de perturbation traditionnelles.
- Fourni des éclaircissements sur les mécanismes de fonctionnement des cellules bêta.
Conclusions
- La méthode de co-culture permet l'étude des interactions protéiques sans perturber la santé des cellules bêta.
- Les connaissances acquises peuvent guider les recherches futures sur le diabète et le fonctionnement des cellules bêta.
- Cette approche pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de sécrétion d'insuline.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La compréhension des interactions protéiques transcellulaires est essentielle pour réduire les risques liés à la validation des cibles bêta-cellulaires dans la découverte de médicaments contre le diabète. Cette méthode de co-culture permet d'analyser mécanistiquement les effets des protéines extracellulaires sur la sécrétion d'insuline sans perturber la santé des cellules bêta, renforçant ainsi la fiabilité prédictive du choix des cibles. Elle répond à un défi majeur en phase de découverte : distinguer les véritables signaux transcellulaires des facteurs de confusion intracellulaires lors de l'analyse des voies de signalisation.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation fonctionnelle des interactions des protéines transmembranaires sur la sécrétion d'insuline tout en préservant l'intégrité des cellules bêta.
- Valeur opérationnelle : Évite les artefacts liés à la diminution ou à la surexpression d'ARNm/protéine, qui compliquent les études de validation ciblée.
- Valeur stratégique : Permet un criblage fondé sur des hypothèses d'interacteurs extracellulaires afin de réduire les risques associés aux voies de signalisation des cellules bêta.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Génère des mesures quantitatives de la sécrétion d'insuline sous stimulation contrôlée au glucose pour la standardisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Utilise des cellules HEK293 comme plateforme modulable de présentation de protéines extracellulaires pour des tests de co-culture reproductibles.
- Valeur stratégique : Permet une évaluation évolutive de protéines candidates influençant la fonction des cellules bêta dans un format physiologiquement pertinent.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Relie les interactions protéiques extracellulaires à la maturation fonctionnelle des cellules bêta et à la libération d'insuline sensible au glucose.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les cellules bêta primaires dissociées et les lignées de cellules bêta pour une validation croisée entre modèles.
- Valeur stratégique : Fournit un système pertinent pour les maladies permettant de hiérarchiser les cibles présentant un potentiel d'alignement avec des biomarqueurs translationnels.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'interaction avec la cible à la validation fonctionnelle, en soutenant spécifiquement l'identification de composés actifs par la réduction des risques mécanistiques liés aux voies des cellules bêta.
- Biologie de la découverte : Évalue comment des domaines extracellulaires spécifiques de protéines transmembranaires modulent la sécrétion d'insuline des cellules bêta dans un système de co-culture contrôlé.
- Essais de criblage : Permet une évaluation standardisée et reproductible de la sécrétion d'insuline dans différentes conditions de glucose à l’aide de radioimmunodosage ou d’ELISA.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (niveaux d'insuline) permettant de comparer les effets des interactions protéiques dans des conditions expérimentales définies.
- Recherche translationnelle : Relie les phénotypes d'interactions extracellulaires aux variations de teneur en insuline et d'expression génique (par exemple, ARNm d'insuline, PDX1) afin d’assurer une continuité préclinique.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme de co-culture réutilisable pour étudier plusieurs protéines transmembranaires sans avoir à modifier les procédures fondamentales de manipulation des cellules bêta.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la signalisation des cellules bêta en isolant les effets transcellulaires des perturbations intracellulaires.
- Valeur opérationnelle : Standardise le protocole de co-culture grâce à des étapes définies de transfection, d'incubation et de dosage de sécrétion, assurant une cohérence entre équipes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt dans la validation des cibles en fournissant des données fonctionnelles de sécrétion d'insuline non faussées par des artefacts liés à la santé des cellules bêta.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des effets validés sur la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en transfection de cellules de mammifères, en techniques de co-culture et en dosages de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.
- Dépend du contrôle de l'efficacité de la transfection et de la formation adéquate de la couche de cellules HEK293 pour une présentation cohérente des protéines.
- Exige une standardisation des protocoles de stimulation par le glucose et des méthodes de quantification de l'insuline (radio-immunodosage ou ELISA) entre les expériences.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'extension aux cellules bêta primaires ou à d'autres lignées cellulaires bêta en dehors de INS-1.
- Limité à l'analyse des interactions protéiques extracellulaires ; ne permet pas d'explorer directement les domaines de signalisation intracellulaire sans méthodes complémentaires.
