Name: Culture primaire Rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Apprenez à cultiver des cellules primaires de canal collecteur médullaire interne chez le rat pour étudier la réabsorption de l'eau médiée par l'arginine-vasopressine. Ce protocole permet d'explorer les mécanismes moléculaires de la physiologie rénale.

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL 1415/3-2 1415/4-2 et KL).

1. Préparation <ol><li> Préparation des boîtes de culture <ol><li> Dégel collagène de type IV O / N à 4 ° C et le dissoudre dans l&#39;acide acétique stérile de 0,1%. Le volume à utiliser dépend du type et du nombre de plats dans lesquels les cellules doivent être ensemencées. Utilisation 2 ug / cm 2. </li><li> Incuber plats au moins pendant 1 heure à température ambiante et laver deux fois avec de l&#39;eau distillée (A. tridest). </li><li> Les laisser sécher correctement. </li></ol></li><li> La supplémentation en moyenne <ol><li> Augmentez le niveau de glucose à 4,5 g / L en ajoutant 1,75 g de glucose à moyen de 500 ml. Pour ajuster le milieu à 600 mosmol, ajouter du NaCl 100 mM et 100 mM d&#39;urée, pour augmenter l&#39;osmolarité de 200 mosmoles et 100 mOsmol, respectivement. </li><li> Ajouter 1% d&#39;acides aminés non essentiels, 1% Ultroser, 500 um DBcAMP, 20 U / ml nystatine et 0,25 pg / ml de gentamicine (1:200 dilution de la solution mère avec une concentration de 50 ng / ml) à 600 DMEM mosmol fraîchement le jour de la préparation. </li></ol></li&gt; <li> solution enzymatique <ol><li> Ajouter 1 mg / ml d&#39;hyaluronidase et 2,2 mg / ml de collagénase à DPBS contenant 0,25 mg / ml de gentamicine et la nystatine. Préparer 1 ml de cette solution enzymatique pour la digestion des 2 reins moelles intérieure. La solution doit être stérilisée par filtration et est stocké dans des tubes Falcon 50 ml. </li></ol></li></ol> 2. La culture du primaire Rat canal collecteur médullaire interne (IMCD) Cellules Toutes les procédures de manipulation des animaux doivent être réalisées dans le respect de la législation locale et fédérale. <ol><li> Anesthésier les rats de CO 2 (dans une boîte saturée de CO 2) ou à l&#39;isoflurane (U-400 appareil d&#39;anesthésie, Univentor Ltd, Malte, le débit d&#39;air de 350-400 ml / min avec 2-2,5% d&#39;isoflurane). Décapiter les animaux de saignement qui permet la détection précise de la frontière entre l&#39;intérieur blanchâtre et la médullaire externe plus sombre. En outre, le saignement réduit le nombre de globules rouges isolés. Retirer les reins etlavez-les dans du DPBS stérile additionné de gentamicine et la nystatine (voir ci-dessus) sur la glace. Toutes les autres étapes doivent être réalisées dans des conditions de banc propre stériles. </li><li> Transfert reins de la solution DPBS sur une compresse stérile pour enlever le liquide excessif. Retirez la capsule rénale gras avec pinces et de ciseaux stériles. </li><li> Ayant le rein encore fixé dans la compresse, coupé légèrement à côté de l&#39;axe longitudinal de la face externe (cortex). Veillez à ne pas couper à travers complètement, mais de le laisser dans une seule pièce, connecté dans le bassinet du rein. </li><li> Avec des ciseaux courbes disséquer soigneusement le moelles interne blanchâtre, qui sont entourés par la médullaire externe chatoyant rosé. Collectionnez-les dans du DPBS, contenant de la gentamicine et la nystatine dans une boîte de culture de 60 mm sur la glace. </li><li> Une fois tous les moelles sont isolés et recueillis sur la glace, réduire le volume de DPBS à un niveau où ils sont simplement recouverts de tampon. Utilisez une lame de rasoir stérile pour couper le moelles en cubes de 53 mm. </li><li> Fondre et arrondir l&#39;extrémité pointue d&#39;une pipette Pasteur stérile en maintenant brièvement dans une flamme. Assurez-vous que la pipette est refroidi avant de poursuivre. </li><li> Transférer la suspension de tissu à des tubes Falcon de 50 ml contenant une solution enzymatique stérile fraîchement préparée avec de la hyaluronidase et de la collagénase (voir 1.3.1) à l&#39;aide de la pipette Pasteur arrondie. Fermer le couvercle hermétiquement et incuber à 37 ° C sous agitation continue (220 rpm) dans un bain-marie de table ordinaire de 1,5 - 2 heures. </li><li> Par trituration de la suspension, une pipette le mélange de haut en bas plusieurs fois avec le tour pipette Pasteur (voir ci-dessus) jusqu&#39;à ce que la suspension devient homogène trouble. </li><li> Centrifuger la suspension pendant 5 min à 300 g et 16 ° C. Éliminer le surnageant, remettre le culot en détail dans DPBS, contenant de la gentamicine et la nystatine et centrifuger à nouveau. Répétez cette étape de lavage une fois. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu entièrement complété et épépiner en cplats de ulture et / ou des plaques et micro-titrage. La préparation des deux médullaires (1 animale) donnera suffisamment de cellules pour une boîte de culture de 60 mm. </li><li> Après 24 h, se laver les cellules deux fois avec 600 mosmol DMEM et ajouter du milieu frais. Au cours de la semaine prochaine, les cellules doivent être lavés 2-3 fois (Figure 1). 6-8 jours après l&#39;ensemencement, les cellules IMCD peuvent être utilisés pour des expériences. N&#39;oubliez pas de les incuber dans un milieu sans DBcAMP et nystatine pendant 24 heures avant de commencer l&#39;expérience. Sinon AQP2 sera situé exclusivement dans la membrane plasmique. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous présentons un protocole détaillé pour la préparation et la mise en culture de cellules IMCD primaires de rat. L&#39;approche donne jusqu&#39;à 21 cm 2 de cellules provenant d&#39;un rat 20. L&#39;expérience nécessite un équipement de culture cellulaire standard et peut être réalisé par une seule personne au sein d&#39;environ 6 heures. Par conséquent, cette approche est appropriée comme une méthode de laboratoire standard. Cellules IMCD primaires de rat peuvent êtr...

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Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Lors de la collecte des cellules rénales de conduits principaux, de l&#39;arginine-vasopressine (AVP) commande la réabsorption de l&#39;eau par la stimulation de l&#39;insertion de l&#39;eau canal aquaporine-2 (AQP2) dans la membrane plasmique. AVP se lie à la protéine de type à couplage de la vasopressine-2 récepteur du G (V2R) la stimulation de l&#39;adénylate cyclase et donc la formation de cAMP. L&#39;initiation de cette cascade de signalisation conduit à l&#39;activation de la protéine kinase A (PKA). PKA phosphoryle AQP2 à la sérine 256 (S256), qui est le déclencheur clé pour sa redistribution de vésicules intracellulaires dans la membrane plasmique. L&#39;insertion de la membrane facilite la réabsorption de l&#39;eau le long d&#39;un gradient osmotique et peaufine l&#39;homéostasie de l&#39;eau. Dysrégulation de la réabsorption de l&#39;eau AVP-dépendante, due à des aberrations de la sécrétion AVP ou les causes de signalisation AVP activés ou est associée à des maladies graves. Diminution de la réabsorption de l&#39;eau causée par des mutations du V2R ou AQP2 conduit à un diabète insipide néphrogénique, alors qu&#39;un AscATED plasma AVP niveau sanguin est associé à la réabsorption d&#39;eau excessive dans les maladies cardiovasculaires telles que l&#39;insuffisance cardiaque chronique et le syndrome de sécrétion inappropriée d&#39;hormone antidiurétique (SIADH). L&#39;importance de la réabsorption de l&#39;eau AVP-médiation découle non seulement de son implication dans la maladie. La translocation AVP-induite de vésicules AQP2 portant à la fusion et à la membrane plasmique représente un processus d&#39;exocytose strictement dépendante de l&#39;AMPc, qui n&#39;est actuellement pas bien compris. D&#39;autres exemples d&#39;une exocytose dépendante de l&#39;AMPc sont sécrétion de rénine dans le rein et H + sécrétion dans l&#39;estomac. Par conséquent, l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires qui régissent le AQP2-translocation dans les cellules principales rénales permet non seulement de comprendre les processus moléculaires similaires dans d&#39;autres types de cellules, mais peut aussi ouvrir la voie à de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies associées à des troubles de la réabsorption de l&#39;eau AVP-médiation . Elucidating mécanismes AQP2 contrôle nécessite la collecte des modèles cellulaires conduits principaux. Pour cela, un certain nombre de différentes lignées cellulaires de reins de mammifères sont disponibles. Cependant, ces modèles présentent plusieurs inconvénients. Dans de nombreux systèmes cellulaires niveau de la protéine de AQP2 est faible (tableau 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, d&#39;autres ectopique surexpriment l&#39;homme (MCD4, WT10) 11,12 ou rat (CD8) 13 AQP2. En MCD4 et les cellules COS-7 du récepteur V2 n&#39;est pas exprimé. À notre connaissance, il n&#39;existe pas de ligne de la cellule permanente comme un modèle disponible, qui est dérivé du conduit rénal collecteur médullaire interne, cette partie du rein où AQP2 expression est la plus abondante, mais à partir du canal collecteur cortical 1,11,13-16 . Ces modèles cellulaires sont par exemple le immortalisé mpkCCD largement utilisé (par exemple 17) ou les 14 lignées cellulaires mTERT-CCD récemment établis. Les deux lignées cellulaires de façon endogène express AQP2 et V2R mais depuis ils sont issus de latube collecteur cortical contient probablement un protéome différent par rapport à collecteur médullaire interne les cellules des canaux (PCIME). Ils doivent par exemple exprimer différent Na + systèmes de transport. Ici, nous présentons un protocole pour la culture des cellules IMCD primaires exprimant V2R et AQP2 endogène. Ce modèle représente donc plus près la situation physiologique dans le tube collecteur rénal. En instituant la culture ne nécessite que étalons de laboratoire équipement d&#39;autres laboratoires peuvent facilement adopter cette approche.

<table><tbody><tr><td>Collagène de type IV souris</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

culture primaire rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressine (AVP) facilite la réabsorption de l&#39;eau par une insuffisance rénale prélèvement de cellules principaux conduits et ainsi peaufine l&#39;homéostasie de l&#39;eau. AVP se lie à des récepteurs V2 de la vasopressine (V2R) sur la surface des cellules et induit ainsi la synthèse de l&#39;AMPc. Ceci stimule les processus de signalisation cellulaires conduisant à des changements dans la phosphorylation de la chaîne aquaporine-2 de l&#39;eau (AQP2). Protéine kinase A phoshorylates AQP2 et déclenche ainsi la translocation de AQP2 de vésicules intracellulaires dans la membrane plasmique de faciliter la réabsorption d&#39;eau à partir de l&#39;urine primaire. Aberrations de l&#39;AVP libération de la signalisation hypophyse ou AVP activé dans les cellules principales peuvent causer le diabète insipide central ou néphrogénique, respectivement, un taux sanguin AVP plasmatique élevé est associé aux maladies cardiovasculaires comme l&#39;insuffisance cardiaque chronique et le syndrome de sécrétion inappropriée d&#39;hormone antidiurétique. Ici, nous présentons un protocole pour cultivatisur des médullaire interne de rat primaire recueillir les cellules des canaux (PCIME), qui expriment V2R et AQP2 endogène. Les cellules sont appropriés pour l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le contrôle des AQP2 et ainsi de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de maladies associées à une dérégulation de la réabsorption de l&#39;eau AVP-médiation. IMCD cellules sont obtenues à partir rat rénale moelles intérieure et sont utilisés pour des expériences de six à huit jours après le semis. IMCD cellules peuvent être cultivées dans des plats réguliers de culture cellulaire, des flacons et des plaques de micro-titrage de différents formats, la procédure ne nécessite que quelques heures, et est approprié pour les laboratoires de culture cellulaire standard.

La culture réussie des cellules IMCD primaires de rat se traduira par une monocouche confluente 6-8 jours après le semis (figure 2). Par boîte de 60 mm de la culture, il ya environ 6 x 10 6 cellules. Les cellules étroitement adhèrent aux boîtes de culture, car elles ont été recouvertes de collagène de type IV, un composant de la membrane basale 18. Par conséquent, les cellules IMCD ne se détache pas, même pendant plusieurs procédures approfondies de lavage. Jusqu&#39;à 80% des cell...

Arginine-vasopressine (AVP) contrôle fine-tuning de l&#39;homéostasie de l&#39;eau du corps en facilitant la réabsorption de l&#39;eau par les cellules rénales principales. Ici, nous présentons un protocole pour la culture de la médullaire interne de rat primaire recueillir les cellules des canaux appropriés pour l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la réabsorption de l&#39;eau AVP-médiation.

Culture primaire Rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des cellules primaires du canal collecteur interne de la moelle rénale, ou cellules IMCD, adaptées à l'étude de la réabsorption d'eau médiée par la VP. Cela est réalisé en premier lieu par l'ablation des reins de rat. La deuxième étape consiste à isoler la moelle interne de la moelle externe et du cortex environnants.Ensuite, les méli internes sont digérés enzymatiquement pour libérer des cellules individuelles. La dernière étape consiste à suspendre les cellules principales et à les sélectionner, puis à les ensemencer dans des boîtes de culture. Finalement, six à huit jours après l'ensemencement, les cellules sont prêtes à être utilisées dans des expériences.Le système de culture cellulaire est adapté à l'élucidation des mécanismes moléculaires sous-jacents à la réabsorption de l'eau médiée par la VP, et éventuellement à d'autres processus TIC dépendants de la CAP. En outre, ce système peut être utilisé pour la découverte de nouveaux candidats médicaments et de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des maladies associées à une dysrégulation de la réabsorption de l'eau médiée par la VP. La procédure sera démontrée par un étudiant en doctorat de notre laboratoire ainsi que par Beata Eman et Andrea Giller, deux techniciennes de notre laboratoire.Suivant la chronologie indiquée ici, recouvrir les boîtes de culture de collagène. Type quatre, la veille de l'intervention du lendemain, préparer d'abord les solutions de milieu et d'enzymes. Ajouter les suppléments à un milieu DMEM fraîchement préparé.Pour préparer la solution d'enzyme, ajoutez un milligramme par millilitre d'hyaluronidase et 2,2 milligrammes par millilitre de collagénase au DPBS filtré. Stérilisez la solution et conservez-la dans un tube Falcon de 50 millilitres.Préparez un millilitre de solution d'enzyme pour chaque deux reins internes méli digérés. L'étape la plus difficile de ce protocole est la dissection du méla interne. Pour assurer le succès, le sang est drainé des animaux avant la dissection, rendant la frontière brillante entre l'intérieur et le modèle auto plus facile à détecter après l'euthanasie.Retirez les reins et conservez-les dans le DPBS stérile préparé précédemment. Travaillez en conditions stériles. Transférez les reins depuis la solution de DPBS, supplémentée avec de la gentamicine et de la nystatine, vers un compress stérile afin d'éliminer tout excès de liquide.Ensuite, à l’aide du scalpel stérile, retirez la capsule adipeuse du rein tout en restant fixé sur le compressif. Effectuez une incision près de l’axe longitudinal de la face externe ou corticale. Veillez à ne pas couper complètement, mais à laisser le tissu en un seul morceau encore relié au niveau du bassinet rénal.Ensuite, identifier la médulla externe irisée de couleur rose et la médulla interne blanchâtre. À l’aide de ciseaux courbes, disséquer soigneusement la médulla interne de la médulla externe environnante. Placer le tissu dans la solution DPBS préparée précédemment.Une fois que toutes les Meli ont été isolées et recueillies sur de la glace, réduire le volume de la solution DPBS, complétée avec de la gentamicine et de la nystatine, jusqu'à un niveau où elles sont juste recouvertes de tampon. Utiliser une lame de rasoir stérile pour découper les Meli en cubes d'environ cinq millimètres cubes. Ensuite, faire fondre et arrondir l'extrémité pointue d'une pipette pasteur stérile en la maintenant brièvement dans une flamme.Une fois refroidi, utiliser cette pipette pour transférer la suspension tissulaire dans un tube Falcon de 50 millilitres contenant la solution enzymatique stérile fraîche préparée précédemment. Placer le tube dans un bain-marie et incuber à 37 degrés Celsius sous agitation continue pendant une heure et demie à deux heures.Après ce délai, aspirez et expulsez une dizaine de fois le mélange à l’aide de la pipette jusqu’à ce que la suspension devienne uniformément trouble. Une fois homogénéisée en profondeur, centrifugez la suspension pendant cinq minutes. Ensuite, éliminez le surnageant.Suspendez le culot et centrifugez à nouveau. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Resuspendez les cellules dans un milieu complètement supplémenté et ensemencez-les dans des boîtes de culture ou des plaques de microtitration ; après ensemencement, les cellules IMCD isolées, ainsi que les érythrocytes et les débris cellulaires, peuvent être évalués au microscope.Cela donnera une première indication du nombre de cellules isolées après 24 heures. Lavez les cellules avec 600 milliosmoles de DMEM et ajoutez du milieu frais. Au cours de la semaine suivante, les cellules doivent être lavées deux à trois fois.Les cellules IMCD devraient être prêtes pour les expériences six à huit jours après leur semis, une fois qu'elles ont atteint la confluence, comme on peut le voir ici. Pensez à incuber les cellules dans un milieu dépourvu de DBC MP et d'INE pendant 24 heures avant de commencer l'expérience. Sinon, l'aquaporine deux se localisera principalement dans la membrane plasmique.La culture réussie de cellules primaires de CMID de rat aboutira à une monocouche confluente six à huit jours après l'ensemencement, lorsque ces cellules sont stimulées par l'arginine, la vasopressine ou le forskoline ; dans ce cas, l'AQP2 transloque des vésicules intracellulaires vers la membrane plasmique, comme illustré ici. En outre, l'expression de l'AQP2 dans les cellules de CMID augmente après un traitement de 30 minutes avec une VP ou du forskoline, comme le montre ce western blot. Après cette procédure, isolement ADN-ARN, expériences de RT-PCR, immunoprécipitation.L'analyse sanguine occidentale et la microscopie en immunofluorescence peuvent être réalisées afin d'analyser les gènes et les produits géniques des cellules du canal collecteur inod. Ce système de culture cellulaire, qui exprime des protéines endogènes, est particulièrement intéressant pour être utilisé dans des approches de criblage non biaisées.

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