Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées

L’objectif global du protocole suivant est de permettre l’interrogation à l’échelle du génome de la fonction des gènes en surveillant simultanément plusieurs lectures cellulaires. Dans cette démonstration, les rapporteurs basés sur Firefly RAN et Cipro Dina Luciferase sont utilisés pour surveiller l’activité des voies P 53 WINT et KRAS respectivement. Ces trois rapporteurs sont transectés par l’ARNi ciblant un gène d’intérêt dans HCT 16 cellules, une lignée cellulaire de cancer colorectal.

Par la suite, les activités de la luciférase Firefly et de la vanilla sont mesurées dans les lysats cellulaires tandis que l’activité de la luciférase Cipro DEA. Une enzyme sécrétée est mesurée dans la culture. Des résultats moyens sont obtenus qui montrent la reproductibilité du système de test ainsi que la capacité de révéler des actions partagées et uniques des gènes dans ces trois voies pertinentes pour le cancer.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les microrayons ou les pries multicolores, c’est qu’il s’agit d’une méthode abordable, universelle et rentable d’examiner les sorties cellulaires de transcription. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans la recherche sur le cancer, telles que le développement de stratégies thérapeutiques moléculairement ciblées. Bien que notre effort de protocole de transfection transitoire IL et un engagement initial minimal en temps pour la configuration de l’écran, il augmentera probablement la variabilité du signal de puits à puits, ce qui peut être contré en examinant les ratios de rapport au lieu de regarder les défaillances absolues des puits Pour commencer cette procédure, lavez cinq plaques de 10 centimètres carrés de 80 à 90 % de HCT confluent, une cellule de 16 cellules avec du PBS, puis récoltez les cellules par trypsinisation pour chaque plaque.

Utilisez un millilitre de solution de trypsine suivi d’une neutralisation avec 10 millilitres de DMEM contenant 2 % de FBS et 1 % de pénicilline. La streptomycine transfère les cellules suspendues dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuge à environ 130 G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 10 millilitres de milieu.

Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules, puis préparez une solution cellulaire avec 10 à cinq cellules par millilitre. Conservez 150 millilitres de suspension cellulaire pour l’étape suivante à l’aide d’une plaque distributrice de liquide automatisée multi-gouttes. 100 microlitres ou 10 à la quatrième cellule dans chaque puits d’une plaque de culture de 96 puits.

Dans ce cas, la suspension de la cellule devrait être suffisante pour le placage de 1296. Les plaques à puits incubent les plaques avec des cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone tout en préparant le mélange de transfection. L’ADN de haute qualité utilisé ici a été isolé à l’aide de kits de préparation MIDI standard et dilué à une concentration finale d’un milligramme par millilitre.

Pour chaque rapporteur, préparez 100 microlitres de solution mère de construction rapporteur en combinant les 30 microlitres suivants de P 53, FL, 30 microlitres de huit X-T-C-F-R-L, 30 microlitres d’élan un G, quatre, six microlitres d’U-A-S-C-L et quatre microlitres de H, deux oh. Cela se traduira par un mélange d’ADN avec un rapport final de un à un à un pour 0,2 des rapporteurs et une concentration finale d’ADN de 0,3 milligramme par millilitre. Ensuite, préparez des mélanges de transfection I-R-N-A-D-D-A suffisants pour la transectation 1296.

Les plaques de puits diluent 80 microlitres de la solution mère de construction rapporteure dans huit millilitres de tampon EC du kit d’effet QIAGEN pour obtenir une solution d’ADN avec une concentration finale de trois microgrammes par plaque de millilitre. 20 microlitres de la solution d’ADN dans chaque puits d’une plaque de PCR de 96 puits. Le nombre de plaques de 96 puits dépendra du nombre de piscines d’ARNi à tester.

Par exemple, dans ce cas, nous aurons besoin de 4 plaques de 96 puits pour évaluer. 384 pools différents à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé de biome transfèrent deux microlitres de chaque cinq siRNA micromolaires vers le puits correspondant de la plaque PCR contenant le stock d’ADN dilué. Ensuite, ajoutez un microlitre de solution d’amplificateur dans chaque puits de la plaque d’ARNi d’ADN.

Laissez la réaction d’amplification se produire à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite trois microlitres de réactif de transfection dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires. Pour arrêter la formation du complexe de transfection, ajoutez 10 microlitres de DMEM contenant 2 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine dans chaque puits de la plaque de PCR.

Récupérez les 1296 plaques de puits contenant HCT et 16 cellules de l’incubateur. Transférez 10 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant les cellules, car chaque transfection sera effectuée en trois exemplaires. Le même mélange sera appliqué sur deux autres plaques de 96 puits contenant des cellules.

Incuber les cellules avec des mélanges de transfection à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 36 heures. 36 heures après la transfection des cellules. Les activités de la luciférase sont prêtes à être mesurées.

Comme cette étude intègre plusieurs rapporteurs, l’un sécrété dans le milieu de culture et les deux autres exprimés dans le cytoplasme cellulaire. Des mesures seront obtenues à partir des deux milieux de culture ainsi que d’un lysat cellulaire pour détecter l’activité de la Cipro Dina luciférase ou de la CL dans la culture. Réplique de plaque moyenne.

20 microlitres d’un milieu de culture à une plaque blanche opaque de 96 puits. À l’aide du multi-goutte, ajoutez 20 microlitres de tampon de dosage CL dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de Cipro Dina Lucifer et du substrat dans chaque puits et détectez l’activité CL à l’aide d’un luminomètre pour détecter les activités de luciférase de luciole et de luciférase vanille, des lysats cellulaires doivent d’abord être fabriqués.

Retirez le milieu de culture des cellules en retournant chaque assiette et en jetant le milieu dans un évier. Retirez le milieu restant en tapotant doucement l’assiette renversée sur du papier absorbant. Ajoutez 30 microlitres d’un tampon de lyse passif dans chaque puits de cellules.

Placez les plaques sur une plate-forme à bascule réglée à vitesse moyenne pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, ajoutez 20 microlitres de réactif de dosage de la luciférase dans chaque puits de cellules et mesurez immédiatement l’activité de la luciférase à l’aide du luminomètre. Ensuite, ajoutez un réactif stop and glow pour éteindre l’activité de la luciférase, puis mesurez l’activité de la luciférase.

Avant le multiplexage, la robustesse des trois plateformes de dépistage a été évaluée individuellement. Les lignées cellulaires indiquées du cancer colorectal ont été transfectées avec les huit constructions rapporteures codant pour la luciférase XTCF PP 53 ta Luke ou ALK one Firefly Luciferase, ainsi que des pools de siRNA ciblant respectivement WINT, bêta-caténine P 53 ou KAS. Les génotypes pertinents pour chaque lignée cellulaire sont indiqués.

La résistance de chaque plateforme de criblage a été évaluée par la reproductibilité de ces effets induits sur la voie de transduction du signal pertinente. Comme le montrent ces résultats représentatifs, la bétaïne et les siRNA n’ont aucun effet sur l’activité des huit rapporteurs XTCF dans les cellules RKO. Contrairement aux cellules DLD 1 et HCT 16, qui sont respectivement déficientes dans la voie A PC, la protéine suppressive et expriment une forme activée de beca tenin.

Par la suite, il a été démontré que ces rapporteurs pouvaient être utilisés ensemble pour des mesures simultanées de l’activité génique des voies de transduction du signal P 53 et de la bêta-caténine du vent et de KRAS en utilisant les pools d’ARNA indiqués dans ces graphiques. Les activités relatives de la luciférase sont montrées sur l’axe Y et les siARN ciblant le gène d’intérêt indiqué sont représentés sur l’axe X. Par exemple, un pool de siRNA ciblant la bêta-caténine réduit l’activité de la voie de la bêta-caténine éolienne, tout en n’affectant pas de manière significative les voies P 53 et KRA S.

Lors de la mise au point d’un système de rapporteur multiplexe, il est important d’optimiser la lignée cellulaire d’intérêt pour la région de transfection et l’intention du signal rapporteur.