Visualisation et d'analyse de molécules d'ARNm par fluorescence In Situ Hybridation dans Saccharomyces cerevisiae

L’objectif général de l’expérience suivante est de détecter la présence de molécules d’ARNm avec une spécificité de molécule unique dans des cellules de levure uniques. Tout d’abord, fixez les cellules de levure et le formaldéhyde à l’aide d’un tampon contenant de la lyase. Perméable les cellules jusqu’à ce que la plupart des cellules ne soient pas brillantes en phase.

Ensuite, incubez les cellules perme avec des molécules d’ADN simple brin marquées par fluorescence, puis montez les cellules sur une lamelle nettoyée au plasma. En fin de compte, les résultats obtenus par microscopie à fluorescence peuvent détailler la présence et la localisation des molécules d’ARNm dans les cellules individuelles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’expression génique, les microréseaux et les transferts de Northern, est que les ARNm individuels peuvent être visualisés dans des cellules uniques.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transcription. Cela comprend la quantification du nombre d’ARN de bras par cellule dans une population, ce qui peut éclairer les modèles de régulation au niveau du promoteur. Il peut également être utilisé pour déterminer la localisation et les demi-vies des transcrits au cours du cycle cellulaire.

Dans une chambre à vide de preening plasma, la position du couvercle se glisse sur les lames. Placez ensuite la chambre à vide dans un micro-ondes et assurez-vous qu’elle est scellée. Allumez la pompe une fois la pompe démarrée.

Allumez l’aspirateur maintenant, allumez le micro-ondes et arrêtez-vous cinq secondes après que le plasma soit visible. Éteignez ensuite l’aspirateur, puis la pompe. Retirez la chambre à vide.

Transférez ensuite les capots de recouvrement côté nettoyé vers le haut en 12. Les plaques de puits font pousser la levure à un A 600 d’environ 0,1 à 0,2. Dans un milieu minimal, 10 mils de cellules donnent assez pour environ 10 hybridations.

Ajoutez un 10e volume de formaldéhyde à 37 % directement dans le milieu de culture et incubez à température ambiante pendant 45 minutes. Centrifugez les cellules à 3000 G pendant cinq minutes. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon B et la transférer dans un microtube à centrifuger.

Laver deux fois avec un millilitre de tampon B glacé dans un micro-tube à centrifuger. Centrifugeuse à 13 000 tr/min pendant une minute. Ensuite, ajoutez un millilitre de sphero, tamponnez et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Surveillez les cellules au microscope toutes les quelques minutes jusqu’à ce que la plupart des cellules soient noires. Ensuite, lavez deux fois avec un tampon glacé. B.Rotation à basse vitesse de 3 500 tr/min.

Ajouter un millilitre de résine à 70 % d’éthanol. Suspendez doucement le granulé et placez-le toute la nuit à quatre degrés Celsius ou rangez-le indéfiniment à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer la solution d’hybridation, ajoutez un à trois microlitres de sonde à 100 microlitres de tampon d’hybridation.

Puis vortex et centrifugeuse. Nous avons imagé trois gènes différents simultanément à l’aide de trois ensembles de sondes différents. Maintenant, centrifugez l’échantillon de levure fixé et aspirez le tampon de lavage.

Ajoutez la solution d’hybridation et incubez dans l’obscurité avec une légère secousse pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Traitez les lèvres couvertes propres avec 150 microlitres de polylysine à 0,01 % pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez et séchez à l’air.

Les lames se lavent trois fois avec de l’eau distillée et sèchent à l’air libre après un lavage avec un XSSC Resus, suspendent les cellules dans 150 microlitres de 0,1 microgramme par millilitre. Fraîchement préparé, colorez une aliquote de la suspension cellulaire sur les lamelles de couverture traitées à la polylysine et incubez pendant 30 minutes. Ensuite, décongelez le fluide de montage en or prolongé à température ambiante.

Placez trois microlitres sur une lame. Ajoutez ensuite environ 0,5 millilitre d’éthanol dans une lamelle. Dans la plaque à 12 puits, retirez la lamelle et séchez à l’air libre tout en la tenant avec une pince à épiler.

Placez la lamelle côté cellule vers le bas sur le support de montage et laissez-la durcir plusieurs heures ou toute la nuit dans l’obscurité. Scellez les bords avec du vernis à ongles et procédez à l’imagerie. Prenez une série d’images autour du point de référence où la distance totale est de cinq micromètres avec une taille de 0,2 micromètre.

Répétez l’imagerie pour chaque canal de colorant correspondant à chaque jeu de sondes. Procédez ensuite comme détaillé dans le texte d’accompagnement. Pour identifier les cellules par segmentation du bassin versant, identifiez les taches à l’aide d’un gradient radial et mesurez les taches à l’aide d’un ajustement gaussien.

En règle générale, les histogrammes sont calculés à partir d’images de poissons et utilisés pour déterminer le nombre d’ARNm présents dans des cellules uniques. Un avantage important de la quantification de l’ARN basée sur la microscopie est qu’elle permet d’obtenir des informations sur la localisation des transcrits. Par exemple, ce poisson utilise des sondes uniques pour identifier les ARNm dans des cellules uniques avec un allèle CCB CBF inductible.

Étant donné que de nombreuses molécules d’ARNm sont présentes au site de transcription, il est facile d’identifier la présence et l’emplacement des sites de transcription dans le noyau. L’utilisation de différents colorants pour marquer les ARNm de différents gènes facilite la quantification de plusieurs espèces d’ARNm dans les mêmes cellules. Dans cette expérience, des cellules de levure ont été incubées en présence de facteur alpha et de sorbitol En utilisant des poissons avec les sondes Stelara, les données montrent qu’une cellule ne répond qu’à la phéromone indiquée par un FUS rouge un site de départ.

Simultanément, une autre cellule répond principalement au sorbitol, où le site de départ S TL one est étiqueté vert. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer et de visualiser des molécules d’ARNm uniques dans la levure Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée correctement en deux jours.

N’oubliez pas d’avoir une concentration de cellules suffisamment dense. Les échantillons dilués nécessitent l’image et le stockage d’un plus grand nombre de champs.