Microscopie corrélative pour l'analyse structurale 3D des interactions dynamiques

L’objectif global de cette procédure est de démontrer l’utilisation de la méthode de microscopie cryo-électronique à lumière fluorescente corrélative en imageant de petites particules dynamiques de VIH interagissant avec les cellules hela de l’hôte. Ceci est accompli en plaquant d’abord et en cultivant des cellules heela sur la grille EM du chercheur d’or dans une boîte de culture à fond de verre et en infectant les cellules heela avec des particules de VIH marquées à la GFP. La deuxième étape consiste à collecter des images confocales 3D de cellules vivantes infectées par le VIH et à analyser les images par suivi automatisé des particules 3D pour la dynamique des particules uniques après vitrification.

L’échantillon, les mêmes particules virales que celles des données d’imagerie des cellules vivantes, sont localisés dans des images cryofluorescentes pour une analyse ultérieure par cryotomographie électronique 3D à haute résolution. La dernière étape consiste à collecter des séries de projections cryo EM inclinées pour toutes les positions identifiées contenant des particules de VIH 1 et à reconstruire des toms 3D avec un algorithme de rétroprojection pondérée à l’aide du logiciel imad. La microscopie à fluorescence corrélative 3D à fluorescence vivante et la cryotomographie électronique à haute résolution sont utilisées pour visualiser directement les particules virales limitées en diffraction dynamique et leurs interactions avec les cellules hôtes.

Notre travail vise à développer une méthode de corrélation qui permet de visualiser directement uniquement les événements de l’infection par le VIH Une En combinant la microscopie fluorescente à cellules vivantes, la microscopie cryofluorescente et la cryotomographie électronique de cette manière, les signaux de cellules vivantes et de cryofluorescence peuvent être utilisés pour guider grandement l’échantillonnage en cryotomographie électronique. De plus, les informations structurelles obtenues par cryotomographie électronique peuvent être complétées par les données fonctionnelles dynamiques disponibles grâce à l’imagerie du mode de vie de cibles marquées au fluorescent. Le principal avantage de cette technique ou de la méthode existante est que l’imagerie 3D corrélative avancée à haute vitesse avec une approche de tomographie électronique 3D corallienne à haute résolution est appliquée pour étudier des événements dynamiques qui sont par nature difficiles à détecter, tels que le VIH de type un et les interactions entre les cellules hôtes au stade précoce de l’infection.

Pour préparer la grille pour la lueur de la culture cellulaire, déchargez le côté carbone d’un R de 200 mailles deux sur deux quanti foil, grille de recherche EM d’or sous 25 milliampères pendant 25 secondes Enduisez la grille EM de fiber nin en la faisant flotter côté carbone vers le bas sur une gouttelette de 40 microlitres de 50 microgrammes par millilitre de solution de fiber nin. Laissez-le dans une hotte de culture tissulaire sous une lumière UV pendant deux heures pour la désinfection plaquez les cellules hela sur la grille à une densité de deux fois 10 à quatre cellules par millilitre dans une boîte de culture à fond de verre.

Dans le DMEM avec des suppléments appropriés, incuber des cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant environ 18 heures avant l’infection par le VIH une fois avant l’infection par le VIH, ajouter un traqueur de cellules fluorescentes aux cellules hela dans la boîte de culture à fond de verre et incuber la boîte à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour permettre l’absorption du colorant fluorescent. laver les cellules avec du PBS et ajouter 50 microlitres de milieu frais préchauffé. Placez la boîte dans la chambre de la cellule vivante à 37 degrés Celsius d’un microscope confocal à balayage de champ. Étant donné que la cryo EM nécessite des régions relativement minces de l’échantillon.

Sélectionnez plusieurs champs contenant une à trois cellules par carré avec les cellules entre deux phases de mitose lorsqu’elles sont le plus étalées et stockez ces positions à plat avec le logiciel d’élément NIS pour une imagerie future. Ensuite, infectez les cellules avec des VSVG, des particules pseudo-typées du VIH qui contiennent G-F-P-V-P-R et les particules virales dans le puits inférieur de la boîte, en prenant soin de ne pas perturber la grille EM. Étant donné que les positions pour l’imagerie ont déjà été sélectionnées et stockées immédiatement après l’ajout des varians, collectez des images confocales 3D à grande vitesse en accéléré aux positions précédemment sélectionnées pendant 20 à 40 minutes.

Immédiatement après l’imagerie confocale de cellules vivantes, placez la boîte de culture sur un bloc de cuivre refroidi à la glace et transférez-la dans la salle de préparation des échantillons cryo EM. Chargez la grille EM sur la pince à épiler spécialisée, épongez rapidement le milieu de culture résiduel avec du papier filtre, placez-le immédiatement sur la grille pour les microlitres d’une solution de billes d’or de 15 nanomètres mélangée à des microsphères fluorescentes de 0,2 micron. Les microsphères fluorescentes sont utilisées pour faciliter la corrélation entre la fluorescence et la cryo-EM.

Chargez la pince à épiler sur le dispositif de vitrification pour la congélation en plongée avec les paramètres de transfert optimisés pour obtenir les meilleurs résultats. Pour commencer la procédure de cryofluorescence, la microscopie optique, connectez une conduite d’azote gazeux sec à un manchon placé sur la lentille de l’objectif pour garder la lentille chaude et à l’abri du givre, montez une platine d’échantillon de cryofluorescence faite maison sur un microscope à fluorescence inversée. Connectez l’entrée d’azote liquide de l’étage d’échantillonnage cryos à l’émetteur auto-pressurisé et placez la sortie de protection contre le débordement d’azote liquide dans un récipient approprié.

Placez la grille d’échantillon hydraté congelé dans la cartouche d’échantillon EM sur le bloc de cuivre, et placez un anneau de clip en C de pré-refroidissement sur le dessus pour maintenir la grille en place. Placez la cartouche dans la chambre intérieure de l’étage cryogénique et trouvez les mêmes particules virales à partir des données d’imagerie des cellules vivantes. Étant donné que la grille EM a un indice, il est simple de localiser la même particule sur la grille à la fois dans les images de cellules vivantes et les images de cryofluorescence.

Acquérez des images cryo DIC et de fluorescence aux positions identifiées dans des conditions cryogéniques à l’aide d’un microscope optique doté d’une lentille d’objectif longue. Pendant l’imagerie par cryofluorescence, vérifiez périodiquement le niveau d’azote liquide dans l’étage cryogénique et remplissez-le avec un faiseur auto-pressurisé au besoin pour maintenir l’étage de l’échantillon en dessous de moins 170 degrés Celsius pour la cryotomographie électronique. Chargez la grille d’échantillonnage dans la station de transfert cryogénique d’un microscope électronique équipé d’un canon à émission de champ en mode de recherche à faible dose à un grossissement de 140 x.

Identifiez les régions ou les carrés de la grille où les images de cryofluorescence ont été acquises. Enregistrez une image cryo EM à faible grossissement de la zone corrélée et enregistrez la position dans un fichier d’étape sous un mode de recherche à faible dose à un grossissement de 3 500 x. Insérez une recherche d’ouverture d’objectif de 100 microns et enregistrez toutes les positions corrélées avec les signaux GFP dans un fichier de deuxième étape.

Configurez les paramètres de tomographie pour l’acquisition d’une série d’inclinaisons, y compris la plage d’angle d’inclinaison, la dose d’électrons, la valeur de défocalisation et les schémas d’inclinaison. Procurez-vous une série d’inclinaison pour toutes les positions enregistrées pour commencer cette procédure. Configurez la fenêtre principale de manière à ce que plusieurs étapes du calcul Tomo Graham puissent être ajustées ou suivies simultanément, modifiez les paramètres nécessaires et exécutez les programmes spécifiques requis par chaque étape de traitement.

À l’étape finale, créez une pile entièrement alignée avec une erreur résiduelle principale inférieure à 0,6 et reconstruisez les Toms à l’aide d’un algorithme de rétroprojection pondérée. Dans Im mod pour caractériser le comportement dynamique des particules de virus. Les cellules Hela infectées par le VIH ont été imagées par microscopie confocale à cellules vivantes à grande vitesse et les mouvements des particules ont été analysés par un suivi automatisé des particules en 3D.

Dans cette figure représentative, une seule particule virale fluorescente verte indiquée par la pointe de flèche jaune a été suivie dans des piles confocales 3D avec un intervalle de temps de trois minutes entre les images pour éviter le laps de temps de plusieurs minutes. Cela peut se produire entre la collecte de la dernière image confocale de cellules vivantes et la congélation en plongée. Une platine de microscopie optique à cryofluorescence a été conçue et construite pour imager des échantillons hydratés congelés à l’intérieur de cartouches cryo-EM.

Sur les microscopes optiques, le panneau A montre un faiseur auto-pressurisé rempli d’azote liquide qui est utilisé pour refroidir l’étage d’échantillonnage cryos en cuivre. Le panneau B montre la vue intérieure supérieure de l’étage d’échantillonnage cryos avec la chambre intérieure indiquée par la pointe de flèche blanche. La grille d’échantillon est placée sur la cartouche d’échantillon E EM, qui se trouve au centre d’une plate-forme de bloc de cuivre indiquée par la flèche noire.

Cette plate-forme a été ajoutée pour être utilisée avec des microscopes électroniques non polaires. Une fois chargées avec la grille d’échantillonnage, les cartouches sont transférées dans la chambre intérieure pour la lumière de fluorescence. Les panneaux de microscopie C et D montrent respectivement la cartouche de l’échantillon avant et après la mise en place d’un anneau de cuivre pour maintenir la grille en place pour une utilisation avec un cryomicroscope électronique non polaire.

L’utilité de la procédure pour la microscopie cellulaire corrélative avancée et la cryotomographie électronique est démontrée par la visualisation directe de particules de VIH V 1 marquées par fluorescence interagissant avec une cellule heela hôte. Une image DIC enregistrée avec une platine de cryo-microscopie optique illustrée dans le panneau A est superposée à une image de cryofluorescence de particules marquées GFP montrée dans le panneau B. Les particules marquées sont colorées. Les panneaux rouges C, D et E sont des images cryo-EM à faible dose de la région contenant une particule fluorescente encerclée dans les panneaux B et C à 140 x 3, 500 x et 27 500 x respectivement.

L’encart dans le panneau E est une vue agrandie enregistrée après l’acquisition des panneaux de la série d’inclinaison tomographique, FG et H montrent trois tranches tomographiques de quatre nanomètres d’épaisseur séparées par une distance de 21 nanomètres dans la direction Z. Les connexions entre la particule et la membrane de l’hélicellulaire sont indiquées par des flèches à la fois dans l’image de projection dans l’encart et le panneau E et dans les coupes tomographiques. Dans les panneaux F et g.

Nous avons présenté un ensemble simple de protocoles pour fournir une approche corrélative avancée afin d’analyser les interactions dynamiques entre les virus et les stériles à l’aide de l’imagerie confocale par fluorescence lipocellulaire suivie d’une cryotomographie électronique. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’une corrélation précise et fiable entre l’image fluorescente et l’image de microscopie électronique est essentielle à la réussite de l’acquisition de la tomographie électronique du corbeau. Les données décrites dans cette procédure seront utiles pour de nombreuses applications impliquant des processus cellulaires dynamiques en biologie cellulaire, tels que la signalisation cellulaire, l’internalisation des récepteurs de surface.