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Préparation des échantillons histologiques pour la microscopie optique

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Histological Sample Preparation for Light Microscopy

1.10: Introduction to the Spectrophotometer

1.12: Introduction to Fluorescence Microscopy

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

L’histologie est l’étude des cellules et des tissus, ce qui est typiquement assisté par l’utilisation d’un microscope optique. La préparation d’échantillons histologiques peut varier grandement sur base des propriétés intrinsèques des échantillons comme la taille et la dureté ainsi que la procédure espérée en aval qui inclut des techniques de coloration planifiées ou d’autres utilisations en aval.

Comme décrit dans cette vidéo, la préparation de l’échantillon commence typiquement avec une procédure de fixation pour empêcher la dégradation de l’échantillon par les enzymes naturellement relâchés par les cellules à leur mort. Une fois fixés, les échantillons sont placés dans un milieu d’implantation qui est capable de soutenir suffisamment l’échantillon. Le plus souvent c’est une cire de paraffine, mais d’autres matériaux comme un milieu gelé à base de glycérine ou un milieu à base de gélose sont aussi utilisés pour entourer l’échantillon pendant la découpe. L’amincissement (coupe) prend alors place dans un microtome ou une autre machine de coupe qui permet à l’utilisateur de raser l’échantillon en fines tranches d’épaisseur allant de quelques microns à quelques millimètres. Une fois coupées, les tranches sont montées sur une lame de verre et colorées pour mettre en évidence les caractéristiques de l’échantillon avant d’être visualisées par un microscope.

Procedure

L’histologie est un terme qui fait référence à l’étude de l’anatomie microscopique des tissus et des cellules. Une bonne préparation d’échantillon histologique pour la microscopie optique, est essentielle pour l’obtention de résultats de haute qualité, à partir d’échantillons de tissus.

Il y a 3 étapes principales communes à la majorité des procédures histologiques. Tout d’abord, l’échantillon est fixé, en vue de préserver le tissu et de ralentir sa dégradation. Ensuite, l’échantillon est immergé dans une substance, ou milieu d’implantation, aux propriétés mécaniques similaires. Une fois implanté, l’échantillon est sectionné en fines tranches, en utilisant un outil de coupe précis appelé microtome. Cette vidéo décrit ces étapes générales et quelques uns des concepts qui y sont relatifs.

La fixation de tissus est une étape critique, qui préserve les composants des cellules et tissus, et maintient leur structure naturelle. A la suite de la mort des cellules, des enzymes naturels sont relâchés par les organites, et ces enzymes commencent à dégrader les protéines intracellulaires et extracellulaires qui maintiennent l’intégrité de la structure de la cellule et des tissus environnant. La fixation empêche une telle dégradation en inhibant directement l’habilité de ces enzymes à digérer les protéines, et en rendant les sites de clivage des enzymes non-reconnaissables.

Les deux mécanismes principaux de fixation sont la réticulation et la coagulation. La réticulation implique la formation de liaisons covalentes, à la fois à l’intérieur de protéines et entre elles, ce qui provoque le durcissement des tissus et donc leur résistance à la dégradation. La coagulation est provoquée par la déshydratation des protéines à travers l’utilisation d’un solvant organique comme l’alcool, pour déformer les protéines 3D ou à structure tertiaire, de manière à ce que les régions hydrophobiques, ou effrayées par l’eau, se déplacent vers la surface. La fixation par coagulation peut aider le milieu d’implantation, comme la cire de paraffine, à pénétrer dans les tissus.

L’un des fixateurs le plus couramment utilisés est le Formol : du formaldéhyde dissout dans de l’eau. Lors de la fixation, le formaldéhyde s’attache aux amines primaires, tels que ceux trouvés sur les chaines de côté des acides aminés lysine et glutamine, pour former une réticulation stable appelée pont de méthylène. Ce procédé est intrinsèquement lent et peut prendre jusqu’à 1 ou 2 jours.

Avant la fixation, quelques considérations sont à prendre en compte. Tout d’abord, considérez la diffusivité de l’échantillon. Les fixateurs vont diffuser sur une certaine distance à travers les tissus, à une vitesse relative au coefficient de diffusion du fixateur multiplié par la racine carrée du temps. Un fixateur qui met 1 heure pour pénétrer de 1 mm dans l’échantillon, prendra 25 heures pour pénétrer 5 mm. Une fois que le formol a atteint le centre du tissu, la réaction de réticulation doit encore avoir lieu. Ainsi, la taille de l’échantillon devrait être limitée à 4 mm d’épaisseur pour une fixation minutieuse dans un temps raisonnable.

Deuxièmement, considérez le volume et le pH du fixateur. Le ratio du volume du fixateur sur le volume de l’échantillon devrait être au moins de 40:1, de manière à ce que le réactif ne soit pas facilement réduit au cours du temps. Alors que certains fixateurs sont conçus pour travailler à un pH acide, le formol travaille mieux lorsqu’il est tamponné avec du phosphate pour maintenir un pH neutre, de manière à ce qu’un excès d’acide ne soit pas produit, ce qui provoquerait des artefacts dans le tissu.

L’étape suivante dans la préparation histologique est l’implantation, qui implique de placer les prélèvements dans un milieu qui a une rigidité mécanique similaire à celle du prélèvement. Le choix du milieu d’implantation adéquat est critique, car s’il est trop raide ou trop frêle, des défauts pourraient apparaitre lors de l’amincissement. La cire de paraffine est de loin le milieu le plus courant utilisé pour l’implantation.

Avant l’implantation dans la paraffine, les échantillons doivent être déshydratés en remplaçant l’eau dans le tissu, d’abord avec de l’éthanol suivi par du xylène, et finalement de la cire de paraffine chaude. Une fois que la cire a infiltré l’échantillon, il faut le positionner précautionneusement et l’entourer avec plus de cire en utilisant un moule pour former un bloc. Ensuite, les échantillons sont attachés à une cassette de tissu pour la coupe.

L’amincissement est le procédé de découpage du bloc d’implantation en fines tranches d’échantillon. Les sections sont généralement de l’ordre de 4 à 10 μm d’épaisseur pour une utilisation en microscopie optique.

Pour couper des sections, une lame en métal, en verre ou en diamant est d’abord sécurisée sur un microtome. L’échantillon est alors placé dans un porte-échantillon. Ensuite, l’échantillon est placé contre la surface de découpe et passé de haut en bas sur la lame pour créer une tranche d’épaisseur désirée. Les échantillons créeront de fins rubans qui peuvent être placés sur des lames de verre.

Pour des échantillons implantés dans de la paraffine, les tranches sont d’abord placées dans un bain d’eau chaude et sont ensuite retirées de l’eau sur une lame et mises à sécher.

Le tissu biologique a un contraste intrinsèque très faible, donc après l’histologie, les tranches sont généralement teintées avec des colorants ou des anticorps qui mettent en évidence la morphologie cellulaire ou les protéines spécifiques. Le colorant le plus couramment utilisé est l’hématoxyline et l’éosine, ou H&E. Du fait qu’il soit si courant, beaucoup de machines automatisées ont été construites pour colorer de nombreuses sections de manière similaire. L’hématoxyline colore le noyau des cellules en bleu, et l’éosine colore le cytoplasme en rose, révélant la morphologie cellulaire des tissus.

Un inconvénient à la fixation est que la réticulation de protéines peut la rendre plus difficile, en empêchant les anticorps étiqueteurs de trouver leurs sites de liaison. Plutôt que d’utiliser la fixation pour préserver les échantillons, la congélation rapide de tissu peut être utilisée, qui sera suivie par une technique de coupe appelée cryo-coupe.

Les échantillons de tissu sont implantés et orientés dans un milieu spécial de congélation appelé OCT, pour milieu à « optimal cutting temperature » et ensuite rapidement gelés. Comme d’autre milieu d’implantation, la rigidité de l’OCT correspond à celle de l’échantillon.

Un cryo-microtome est utilisé pour couper les sections gelées, et cet instrument maintient une température interne de -20°C pour garder la lame de coupe et les échantillons froids. En opposition aux sections d’implantations par paraffine, les sections gelées peuvent être directement poussées sur une lame de verre chargée positivement immédiatement après la coupe.

Un autre moyen d’éviter la fixation est l’implantation sur gélose, dans laquelle les échantillons sont couverts avec de la gélose liquide fraichement préparée. Une fois que la gélose est refroidie, et que le tissu est enfermé, la gélose en excès peut être taillée.

Un vibratome, une autre alternative au microtome, a une lame qui vibre et se déplace à travers l’échantillon implanté dans la gélose. Les vibratomes sont utilisés pour créer de fines sections de l’ordre de 50 à 1000 μm d’échantillons implantés dans la gélose.

Les échantillons sont typiquement retirés de la gélose avant la coloration, et alors placés sur une lame, entourés par une substance comme de la graisse à vide qui empêche la lamelle d’écraser l’échantillon. Un microscope confocal est ideal pour bien voir ces échantillons, en vue d’obtenir des images de haute résolution de chaque fine section.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la préparation d’échantillons histologiques pour la microscopie optique. Vous devriez maintenant comprendre les étapes impliquées dans la préparation d’échantillon pour vous amener d’un morceau de tissu à une tranche stable. Comme toujours, merci de nous avoir regardé !

Transcript

Histology is a term that refers to the study of the microscopic anatomy of tissues and cells. Proper histological sample preparation for light microscopy is essential for obtaining quality results from tissue samples.

There are 3 main steps common to nearly all histological procedures. First, the sample is fixed, in order to preserve the tissue and slow down tissue degradation. Next, the sample is immersed in a material, or embedding media, that has similar mechanical properties to itself. Once embedded, the sample is sectioned, or cut, into thin slices using a precise cutting tool known as a microtome. This video describes these general steps and some of the concepts that relate to them.

Tissue fixation is a critical step that preserves cell and tissue components and maintains their structure. Following cell death, naturally occurring enzymes are released from cellular organelles and begin to degrade the proteins throughout the cell and extracellular matrix, thereby destroying the structure of the cell. Fixation prevents such degradation by directly inhibiting the ability of these enzymes digest protein and by making the enzyme cleavage sites unrecognizable.

The two main mechanisms of fixation are cross-linking and coagulation. Cross-linking involves covalent bond formation both within proteins and between them, which causes tissue to stiffen and therefore resist degradation. Coagulation is caused by the dehydration of proteins through the use of alcohols or acetone, which deform protein tertiary structure, so that hydrophobic, or water fearing, regions move the protein surface. Coagulative fixation can help embedding media, like paraffin wax, penetrate tissue.

One of the most commonly-used fixatives is Formalin, which is formaldehyde dissolved in a water. During fixation, formaldehyde attaches to primary amines, such as those found on the side chains of the amino acids lysine and glutamine to form a stable crosslink called a methelene bridge. This process is inherently slow and can take up to 1-2 days.

Prior to fixation a few considerations should be made. First, consider the diffusivity of the sample. Fixatives will diffuse a distance through tissues at a rate related to the coefficient of diffusion for the fixative multiplied by the square root of time. A fixative that takes 1 hour to penetrate 1 mm into the sample will take 25 hours to penetrate 5 mm. Once formalin has reached the center of the tissue, the crosslinking reaction sill needs to occur. Thus, sample size should be limited to 4 mm in thickness for thorough fixation in a reasonable amount of time.

Second, consider the volume and pH of the fixative. The fixative to sample volume ratio should be at least 40:1 so that the reagent is not depleted easily over time. While some fixatives are designed to work at an acidic pH, formalin works best when buffered with phosphate to maintain a neutral pH, so that excess acid is not produced, which causes artifacts in tissue.

The next step in histological preparation is embedding, which involves supporting specimens in media that has similar mechanical rigidity to the specimen itself. Choosing the right embedding medium is critical, because if it is too stiff or too weak, defects may occur while sectioning. By far, the most common media used for embedding is paraffin wax.

Prior to paraffin-embedding, samples must be dehydrated by replacing the water in the tissue with ethanol, first, followed by xylenes, and then finally warmed paraffin wax. Once wax has infiltrated the sample, it is carefully positioned and surrounded with additional wax using a mould to form a block. Next, samples are attached to a tissue cassette for sectioning.

Sectioning is the process of cutting thin slices of a sample from an embedding block. The sections are usually on the order of 4-10 µm thick for use with light microscopy.

To cut sections, a metal, glass, or diamond blade is first secured on a microtome. The sample is then placed in a sample holder. Next, the sample is advanced to the cutting surface and drawn across the blade to create a slice of desired thickness. Sections will amass as thin ribbons which can be placed on glass slides.

Following sectioning, samples are placed on slides. For paraffin embedded samples, slices are first placed into a warmed water bath and are then lifted out of the water onto the slide and allowed to dry.

Biological tissue has very little inherent contrast, so after histology, slides are usually stained with dyes or antibodies that highlight morphology or specific proteins. The most common stain performed is hematoxylin and eosin, or H&E. Because it is so common, many automated machines have been made to reproducibly stain numerous sections with H&E. Hematoxylin stains the nuclei of cells blue and eosin stains the cytoplasm pink revealing cellular morphology of tissues.

One drawback to fixation is that the cross-linking of proteins can make it more for labeling antibodies to find their binding sites. Rather than using fixation to preserve samples, rapid freezing of tissue, or snap freezing can be used, which is followed by a sectioning technique called cryosectioning

Tissue samples are embedded and oriented in a special freezing media called OCT, or optimal cutting temperature medium and then rapidly frozen. Like other embedding media, OCT matches the rigidity of the sample.

A cryomicrotome or cryostat, is used to cut frozen sections and this instrument maintains an internal temperature of -20°C to keep the cutting blade and samples cool. In contrast to paraffin-embedded sections, frozen sections can be directly lifted onto a positively charged glass slide immediately after sectioning.

Another way to avoid fixation is via agar embedding, in which samples are covered with freshly prepared liquid agarose. As the agarose cools, it locks the tissue into place and excess agarose can be trimmed away.

Vibrotomes, another alternative to the microtome, have a blade that vibrates and moves across the agarose-embedded sample.Vibrotomes are used to create thick sections on the order of 50-1000 µm from agarose embedded samples.

Samples are typically removed from the agarose before staining , and then placed onto a slide surrounded by a substance such as vacuum grease that keeps the coverslip from squishing the sample. They are best viewed using confocal microscopy in order to obtain high resolution images of each thick section.

You’ve just watched JoVE’s video on histological sample preparation for light microscopy.

You should now understand the steps involved for sample preparation to get you from a piece of tissue to a stainable section. As always, thanks for watching!

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Histological Sample Preparation Light Microscopy Histology Fixing Embedding Media Microtome Sectioning Cell Degradation Enzymes Protein Degradation Cross-linking Coagulation Protein Dehydration