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Introduction à la microscopie de fluorescence

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Introduction to Fluorescence Microscopy

1.11: Histological Sample Preparation for Light Microscopy

1.13: Introduction to Light Microscopy

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09:22 min

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April 30, 2023

Overview

La microscopie de fluorescence est un outil d’analyse très puissant qui combine les propriétés grossissantes de la microscopie optique avec la visualisation de la fluorescence. La fluorescence est un phénomène qui implique l’absorbance et l’émission d’une petite gamme de longueurs d’ondes de la lumière par une molécule fluorescente appelée un fluorochrome. La microscopie de fluorescence est réalisée en conjonction avec le microscope optique de base par l’ajout d’une source lumineuse puissante, de filtres spécialisés, et d’un moyen de marquage par fluorescence des échantillons.

Cette vidéo décrit les principes de base derrière la microscopie de fluorescence incluant le mécanisme de fluorescence, le déplacement de Stokes, et le photoblanchiment. Elle donne aussi des exemples des nombreux moyens de marquage par fluorescence d’un échantillon incluant l’utilisation d’anticorps et de protéines marqués par fluorescence, de colorants d’acides nucléiques, et l’ajout de protéines naturellement fluorescentes à l’échantillon. Les composants principaux du microscope de fluorescence incluent une source de lumière au xénon ou au mercure, des filtres de lumière, un miroir semi-réfléchissant (miroir dichroïque), et l’utilisation de l’obturateur pour illuminer l’échantillon sont tous décrits. Finalement, des exemples de quelques utilisations de la microscopie de fluorescence sont montrés.

Procedure

La fluorescence est un phénomène qui prend place lorsqu’une substance absorbe la lumière à une longueur d’onde donnée et émet de la lumière à une autre longueur d’onde. La fluorescence apparait lorsqu’un électron, qui a été excité vers un état d’énergie plus haut et plus instable, redescend dans son état initial et émet un photon de lumière. La lumière qui est responsable de l’excitation, ou du déplacement de l’électron vers un niveau d’énergie supérieur, est de longueur d’onde plus courte et d’énergie plus haute que l’émission de fluorescence, qui a une longueur d’onde plus longue, une énergie plus faible et une couleur différente.

La microscopie de fluorescence mélange les propriétés grossissantes du microscope optique avec la technologie de fluorescence qui permet l’excitation et la détection des émissions de fluorochromes (des composés chimiques fluorescents). Avec la microscopie de fluorescence, les scientifiques peuvent observer la localisation de types spécifiques de cellules à l’intérieur de tissus, ou de molécules à l’intérieur de cellules.

Les composants principaux du microscope à fluorescence chevauchent considérablement ceux du microscope optique traditionnel. Cependant les deux différences principales sont le type de source lumineuse et l’utilisation d’éléments filtrants spécialisés.

La microscopie de fluorescence requiert une source de lumière très puissante, comme une lampe au xénon ou au mercure à arc comme celle montrée ici. La lumière émise par une lampe au mercure est 10 à 100 fois plus brillante que la plupart des lampes incandescentes, et fournit une lumière dans une large gamme de longueur d’ondes, de l’ultraviolet à l’infrarouge. Cette source de lumière a haute puissance est la partie la plus dangereuse du paramétrage du microscope de fluorescence, car regarder directement la lumière non filtrée peut causer de sérieux dommages à la rétine, et le mauvais traitement des ampoules peut provoquer leur explosion.

Le principe derrière la microscopie de fluorescence est simple. Lorsque la lumière quitte la lampe, elle est dirigée à travers un filtre excitateur, qui sélectionne la longueur d’onde d’excitation.

Cette lumière est réfléchie vers l’échantillon grâce à un miroir spécial appelé miroir dichroïque ou miroir semi-réfléchissant, qui est conçu pour réfléchir uniquement la lumière à la longueur d’onde d’excitation. La lumière réfléchie passe à travers l’objectif où elle est focalisée sur l’échantillon fluorescent. Les émissions de l’échantillon passent à leur tour à travers l’objectif – où l’agrandissement de l’image a lieu – et ensuite à travers le miroir dichroïque.

Cette lumière est filtrée par le filtre d’émission (ou filtre barrière), qui sélectionne la longueur d’onde d’émission, et filtre les faisceaux lumineux contaminants de la lampe ou d’autres sources qui sont réfléchies en dehors des composants du microscope. Finalement, l’émission fluorescente filtrée est envoyée vers un détecteur où l’image peut être numérisée, ou etre transmise à l’oculaire pour le visionnage optique.

Le filtre d’excitation, le miroir dichroïque, et le filtre d’émission peuvent être assemblés en un composant connu comme le cube filtrant. Différents cubes filtrants peuvent être inter-changés lors de l’observation d’un échantillon en vue de changer la longueur d’onde d’excitation, et une série de diaphragmes peut être utilisée pour modifier l’intensité de l’excitation.

Lorsqu’il s’agit d’effectuer une microscopie de fluorescence, le fluorochrome peut être aussi important que le microscope en lui-même, et le type de fluorochrome imagé dicte la longueur d’onde d’excitation utilisée et la longueur d’onde d’émission qui est détectée. La longueur d’onde d’excitation contient une petite gamme d’énergies qui peuvent être absorbées par le fluorochrome et provoquer sa transition vers un état excité. Une fois excité, une large gamme d’émissions, ou de transitions de retour au niveau d’énergie inférieur, peuvent résulter en un spectre d’émission.

La différence entre le pic d’absorption, ou courbe d’excitation, et le pic de la courbe d’émission est connu comme le déplacement de Stokes. Plus grande est la distance de ce déplacement, plus il est facile de séparer les deux longueurs d’ondes différentes. De plus, n’importe quel chevauchement de spectre nécessite d’être retiré par les composants du cube filtrant pour réduire le fond et améliorer la qualité de l’image.

L’exposition du fluorochrome à une excitation prolongée provoquera son photoblanchiment, qui est un affaiblissement ou une perte de fluorescence. Pour réduire le photoblanchiment, vous pouvez ajouter un milieu de montage anti-effacement à la lame et sceller les côtés avec du vernis à ongles. La lame devrait aussi être conservée dans le noir lorsqu’elle n’est pas visionnée.

Pour commencer une imagerie par fluorescence, allumez la source de lumière au xénon ou mercure et laissez la chauffer pendant 15 minutes en vue d’atteindre une illumination constante.

Ensuite, placez l’échantillon sur la platine et sécurisez-le en place. Maintenant, allumez la lumière blanche de votre microscope. Faites la mise au point sur l’échantillon en utilisant l’objectif de plus basse puissance, en pivotant les boutons de focus grossier et fin. Ensuite, utilisez les boutons d’ajustement de la platine pour trouver la zone d’intérêt.

Ensuite, éteignez la lumière blanche, ainsi que toute lumière de la pièce non nécessaire pour réduire le fond.

Sélectionnez le cube filtrant approprié pour le colorant que vous regardez et ouvrez l’obturateur pour illuminer l’échantillon.

Enfin, faites les ajustements de mise au point et dirigez la lumière sortante vers l’appareil photo d’imagerie. Vous aurez besoin d’ajuster le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et coloration différents utilisés. Cependant, il est important de garder le temps d’exposition constant lors de la comparaison de caractéristiques sur différents échantillons avec la même coloration.

Pour imager les colorations multiples sur le même échantillon, changez le cube filtrant pour associer chaque fluorochrome à une nouvelle image et enregistrez la.

Après que chaque coloration de l’échantillon ait été imagée, les images individuelles peuvent être superposées et fondues.

Nombreux sont les types d’experiences qui peuvent faire usage de la microscopie de fluorescence, et impliquent différents types de fluorochromes. Une des utilisations les plus courantes est l’imagerie de protéines qui ont été marquées avec des anticorps qui sont attachés, ou « conjugués » à des composés fluorescents. Ici, un anticorps sur des protéine de surface leptospiral a été détecté en utilisant un anticorps secondaire, conjugué au Alexa Fluor, qui fluoresce vert lorsqu’il est excité.

Un autre moyen de mettre en évidence une caractéristique spécifique grace a la fluorescence est d’intégrer le code d’une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte, ou GFP pour « Green Fluorescent Protein » en anglais, dans l’ADN de l’organisme. Le gène pour GFP était à l’origine isolé à partir de méduse et peut maintenant être exprimé, ou produit, par des cellules cultivées en réponse à une amorce spécifique, ou comme partie d’un type spécifique de cellules comme les cellules tumorales que vous voyez ici lumineuses.

Une autre utilisation de l’imagerie de fluorescence est la microscopie de fluorescence Speckle, qui est une technique qui utilise un assemblage de macromolécules marquées par fluorescence comme le réseau de F-actin montré ici, pour étudier le mouvement et le taux de renouvellement cinétique de cette importante protéine cytosquelettique.

Une technique avancée connue comme la fluorescence récupérée après photoblanchiment, ou FRAP pour « Fluorescence Recovery After Photobleaching », est effectuée par le photoblanchiment intentionnel d’une petite région d’un échantillon, en vue de surveiller le taux de diffusion des molécules marquées par fluorescence, de retour dans la région photoblanchie.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Microscopie de Fluorescence. Dans cette vidéo nous avons vu le concept de fluorescence, comment la microscopie de fluorescence diffère de la microscopie optique, et comment prendre une image fluorescente à travers l’objectif. Nous avons aussi vu quelques applications de base et avancées qui utilisent la fluorescence. Merci de nous avoir regardé et n’oubliez pas que si le photoblanchiment est joli sur vos dents, ce n’est pas bon pour vos échantillons.

Transcript

Fluorescence is a phenomenon that takes place when a substance absorbs light at a given wavelength and emits light at another wavelength. Fluorescence occurs as an electron, which has been excited to a higher, and more unstable energy state, relaxes to its ground state and gives off a photon of light. The light that is responsible for excitation, or moving the electron to a higher energy state, is of shorter wavelength and higher energy than the fluorescence emission, which has a longer wavelength, lower energy, and different color.

Fluorescence microscopy combines the magnifying properties of the light microscope with fluorescence technology that allows the excitation of- and detection of emissions from- fluorophores – fluorescent chemical compounds. With fluorescence microscopy, scientists can observe the location of specific cell types within tissues or molecules within cells.

The main components of the fluorescent microscope overlap greatly with the traditional light microscope. However the 2 main differences are the type of light source and the use of the specialized filter elements.

Fluorescence microscopy requires a very powerful light source such as a xenon or mercury arch lamp like the one shown here. The light emitted from the mercury arc lamp is 10-100 times brighter than most incandescent lamps and provides light in a wide range of wavelengths, from ultra-violet to the infrared. This high-powered light source is the most dangerous part of the fluorescence microscope setup as looking directly into unfiltered light can seriously damage your retinas and mishandling the bulbs can cause them to explode.

The principle behind fluorescence microscopy is simple. As light leaves the arc lamp it is directed through an exciter filter, which selects the excitation wavelength.

This light is reflected toward the sample by a special mirror called a dichroic mirror, which is designed to reflect light only at the excitation wavelength. The reflected light passes through the objective where it is focused onto the fluorescent specimen. The emissions from the specimen are in turn, passed back up through the objective – where magnification of the image occurs –and now through the dichroic mirror.

This light is filtered by the barrier filter, which selects for the emission wavelength and filters out contaminating light from the arc lamp or other sources that are reflected off of the microscope components. Finally, the filtered fluorescent emission is sent to a detector where the image can be digitized, or it’s transmitted to the eyepiece for optical viewing.

The exciter filter, dichroic mirror, and barrier filter can be assembled together into a component known as the filter cube. Different filter cubes can be changed during specimen viewing to change the excitation wavelength, and a series of diaphrams can be used to modify the intensity of excitation.

When it comes to performing fluorescence microscopy, the fluorophore can be just as important as the microscope itself, and the type of fluorophore being imaged dictates the excitation wavelength used and emission wavelength that’s detected. The excitation wavelengths contain a small range of energies that can be absorbed by the fluorophore and cause it to transition into an excited state. Once excited, a wide range of emissions, or transitions back to the lower energy state, are possible resulting in an emission spectrum.

The difference between the peak of the absorption, or excitation curve and the peak of the emission curve is known as Stoke’s Shift. The greater the distance in this shift, the easier it is to separate the two different wavelengths. Additionally, any overlapping spectrum needs to be removed by the components of the filter cube for reduced background and improved image quality.

Exposure of the fluorophore to prolonged excitation will cause it to photobleach, which is a weakening or loss of fluorescence. To reduce photobleaching, you can add an anti-fade mounting medium to the slide and seal the edges with nail polish. The slide should also be kept in the dark when not being imaged.

To begin fluorescence imaging, turn on the xenon or mercury light source and allow it to warm up for as long as 15 minutes in order for it to reach constant illumination.

Next, place your sample on the stage and secure it in place. Then, turn on the white light source of your microscope. Focus on your sample using the lowest powered objective by adjusting the coarse and fine focus knobs. Then, use the stage adjustment knobs to find your area of interest.

Next, turn off the white light source, as well as any unnecessary room lights to reduce background.

Select the correct filter cube for the dye you are imaging and open the shutter to illuminate your sample.

Finally, make fine focus adjustments and direct the output light to the imaging camera. You will likely need to make adjustments to the exposure time for each different fluorophore or fluorescent dye used. However, it is important to keep the exposure time constant when comparing features with the same dye on different samples.

To image multiple dyes on the same sample, change the filter cube to match each fluorophore and record the new image.

After each dye in the sample has been imaged, individual images can be overlaid and merged.

Many different types of experiments can make use of fluorescent microscopy and involve different types of fluorophores One of the most common applications of fluorescent microscopy is the imaging of proteins that have been labeled with antibodies that are attached to, or “conjugated” to fluorescent compounds.. Here, an antibody towards leptospiral surface proteins was detected using a secondary antibody conjugated to alexafluor-488, which fluoresces green when excited.

Another way to highlight a specific feature with fluorescence is to integrate the code for a fluorescent protein such as green fluorescent protein, or GFP, into the DNA of an organism. The gene for GFP was originally isolated from jellyfish and can be expressed, or produced, by cultured cells in response to specific triggers or as part of a specific cell type like the tumor cells shown glowing in this image

Another application of fluorescence imaging is Fluorescence Speckle Microscopy which is a technology that uses fluorescently labeled macromolecular assemblies such as the F-actin network seen here, to study movement and turnover kinetics of this important cytoskeletal protein.

An advanced technique known as Fluorescence recovery after photobleaching, or FRAP, is performed by intentionally photobleaching a small region of a sample in order to monitor the diffusion rate of fluorescently labeled molecules back into the photobleached region.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Fluorescence Microscopy.

In this video we learned about the concept of fluorescence, how fluorescence microscopy differs from light microscopy, and how to take a fluorescence image through the scope. We also learned about some basic and advanced applications that use fluorescence. Thanks for watching and don’t forget while photobleaching looks great on your teeth it’s not so good for your samples.