Introduction à la microscopie de fluorescence
La fluorescence est un phénomène qui prend place lorsqu’une substance absorbe la lumière à une longueur d’onde donnée et émet de la lumière à une autre longueur d’onde. La fluorescence apparait lorsqu’un électron, qui a été excité vers un état d’énergie plus haut et plus instable, redescend dans son état initial et émet un photon de lumière. La lumière qui est responsable de l’excitation, ou du déplacement de l’électron vers un niveau d’énergie supérieur, est de longueur d’onde plus courte et d’énergie plus haute que l’émission de fluorescence, qui a une longueur d’onde plus longue, une énergie plus faible et une couleur différente.
La microscopie de fluorescence mélange les propriétés grossissantes du microscope optique avec la technologie de fluorescence qui permet l’excitation et la détection des émissions de fluorochromes (des composés chimiques fluorescents). Avec la microscopie de fluorescence, les scientifiques peuvent observer la localisation de types spécifiques de cellules à l’intérieur de tissus, ou de molécules à l’intérieur de cellules.
Les composants principaux du microscope à fluorescence chevauchent considérablement ceux du microscope optique traditionnel. Cependant les deux différences principales sont le type de source lumineuse et l’utilisation d’éléments filtrants spécialisés.
La microscopie de fluorescence requiert une source de lumière très puissante, comme une lampe au xénon ou au mercure à arc comme celle montrée ici. La lumière émise par une lampe au mercure est 10 à 100 fois plus brillante que la plupart des lampes incandescentes, et fournit une lumière dans une large gamme de longueur d’ondes, de l’ultraviolet à l’infrarouge. Cette source de lumière a haute puissance est la partie la plus dangereuse du paramétrage du microscope de fluorescence, car regarder directement la lumière non filtrée peut causer de sérieux dommages à la rétine, et le mauvais traitement des ampoules peut provoquer leur explosion.
Le principe derrière la microscopie de fluorescence est simple. Lorsque la lumière quitte la lampe, elle est dirigée à travers un filtre excitateur, qui sélectionne la longueur d’onde d’excitation.
Cette lumière est réfléchie vers l’échantillon grâce à un miroir spécial appelé miroir dichroïque ou miroir semi-réfléchissant, qui est conçu pour réfléchir uniquement la lumière à la longueur d’onde d’excitation. La lumière réfléchie passe à travers l’objectif où elle est focalisée sur l’échantillon fluorescent. Les émissions de l’échantillon passent à leur tour à travers l’objectif – où l’agrandissement de l’image a lieu – et ensuite à travers le miroir dichroïque.
Cette lumière est filtrée par le filtre d’émission (ou filtre barrière), qui sélectionne la longueur d’onde d’émission, et filtre les faisceaux lumineux contaminants de la lampe ou d’autres sources qui sont réfléchies en dehors des composants du microscope. Finalement, l’émission fluorescente filtrée est envoyée vers un détecteur où l’image peut être numérisée, ou etre transmise à l’oculaire pour le visionnage optique.
Le filtre d’excitation, le miroir dichroïque, et le filtre d’émission peuvent être assemblés en un composant connu comme le cube filtrant. Différents cubes filtrants peuvent être inter-changés lors de l’observation d’un échantillon en vue de changer la longueur d’onde d’excitation, et une série de diaphragmes peut être utilisée pour modifier l’intensité de l’excitation.
Lorsqu’il s’agit d’effectuer une microscopie de fluorescence, le fluorochrome peut être aussi important que le microscope en lui-même, et le type de fluorochrome imagé dicte la longueur d’onde d’excitation utilisée et la longueur d’onde d’émission qui est détectée. La longueur d’onde d’excitation contient une petite gamme d’énergies qui peuvent être absorbées par le fluorochrome et provoquer sa transition vers un état excité. Une fois excité, une large gamme d’émissions, ou de transitions de retour au niveau d’énergie inférieur, peuvent résulter en un spectre d’émission.
La différence entre le pic d’absorption, ou courbe d’excitation, et le pic de la courbe d’émission est connu comme le déplacement de Stokes. Plus grande est la distance de ce déplacement, plus il est facile de séparer les deux longueurs d’ondes différentes. De plus, n’importe quel chevauchement de spectre nécessite d’être retiré par les composants du cube filtrant pour réduire le fond et améliorer la qualité de l’image.
L’exposition du fluorochrome à une excitation prolongée provoquera son photoblanchiment, qui est un affaiblissement ou une perte de fluorescence. Pour réduire le photoblanchiment, vous pouvez ajouter un milieu de montage anti-effacement à la lame et sceller les côtés avec du vernis à ongles. La lame devrait aussi être conservée dans le noir lorsqu’elle n’est pas visionnée.
Pour commencer une imagerie par fluorescence, allumez la source de lumière au xénon ou mercure et laissez la chauffer pendant 15 minutes en vue d’atteindre une illumination constante.
Ensuite, placez l’échantillon sur la platine et sécurisez-le en place. Maintenant, allumez la lumière blanche de votre microscope. Faites la mise au point sur l’échantillon en utilisant l’objectif de plus basse puissance, en pivotant les boutons de focus grossier et fin. Ensuite, utilisez les boutons d’ajustement de la platine pour trouver la zone d’intérêt.
Ensuite, éteignez la lumière blanche, ainsi que toute lumière de la pièce non nécessaire pour réduire le fond.
Sélectionnez le cube filtrant approprié pour le colorant que vous regardez et ouvrez l’obturateur pour illuminer l’échantillon.
Enfin, faites les ajustements de mise au point et dirigez la lumière sortante vers l’appareil photo d’imagerie. Vous aurez besoin d’ajuster le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et coloration différents utilisés. Cependant, il est important de garder le temps d’exposition constant lors de la comparaison de caractéristiques sur différents échantillons avec la même coloration.
Pour imager les colorations multiples sur le même échantillon, changez le cube filtrant pour associer chaque fluorochrome à une nouvelle image et enregistrez la.
Après que chaque coloration de l’échantillon ait été imagée, les images individuelles peuvent être superposées et fondues.
Nombreux sont les types d’experiences qui peuvent faire usage de la microscopie de fluorescence, et impliquent différents types de fluorochromes. Une des utilisations les plus courantes est l’imagerie de protéines qui ont été marquées avec des anticorps qui sont attachés, ou « conjugués » à des composés fluorescents. Ici, un anticorps sur des protéine de surface leptospiral a été détecté en utilisant un anticorps secondaire, conjugué au Alexa Fluor, qui fluoresce vert lorsqu’il est excité.
Un autre moyen de mettre en évidence une caractéristique spécifique grace a la fluorescence est d’intégrer le code d’une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte, ou GFP pour « Green Fluorescent Protein » en anglais, dans l’ADN de l’organisme. Le gène pour GFP était à l’origine isolé à partir de méduse et peut maintenant être exprimé, ou produit, par des cellules cultivées en réponse à une amorce spécifique, ou comme partie d’un type spécifique de cellules comme les cellules tumorales que vous voyez ici lumineuses.
Une autre utilisation de l’imagerie de fluorescence est la microscopie de fluorescence Speckle, qui est une technique qui utilise un assemblage de macromolécules marquées par fluorescence comme le réseau de F-actin montré ici, pour étudier le mouvement et le taux de renouvellement cinétique de cette importante protéine cytosquelettique.
Une technique avancée connue comme la fluorescence récupérée après photoblanchiment, ou FRAP pour « Fluorescence Recovery After Photobleaching », est effectuée par le photoblanchiment intentionnel d’une petite région d’un échantillon, en vue de surveiller le taux de diffusion des molécules marquées par fluorescence, de retour dans la région photoblanchie.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Microscopie de Fluorescence. Dans cette vidéo nous avons vu le concept de fluorescence, comment la microscopie de fluorescence diffère de la microscopie optique, et comment prendre une image fluorescente à travers l’objectif. Nous avons aussi vu quelques applications de base et avancées qui utilisent la fluorescence. Merci de nous avoir regardé et n’oubliez pas que si le photoblanchiment est joli sur vos dents, ce n’est pas bon pour vos échantillons.
La microscopie de fluorescence est un outil d’analyse très puissant qui combine les propriétés grossissantes de la microscopie optique avec la visuali…
La fluorescence est un phénomène qui prend place lorsqu’une substance absorbe la lumière à une longueur d’onde donnée et émet de la lumière à une autre longueur d’onde. La fluorescence apparait lorsqu’un électron, qui a été excité vers un état d’énergie plus haut et plus instable, redescend dans son état initial et émet un photon de lumière. La lumière qui est responsable de l’excitation, ou du déplacement de l’électron vers un niveau d’énergie supérieur, est de longueur d’onde plus courte et d’énergie plus haute que l’émission de fluorescence, qui a une longueur d’onde plus longue, une énergie plus faible et une couleur différente.
La microscopie de fluorescence mélange les propriétés grossissantes du microscope optique avec la technologie de fluorescence qui permet l’excitation et la détection des émissions de fluorochromes (des composés chimiques fluorescents). Avec la microscopie de fluorescence, les scientifiques peuvent observer la localisation de types spécifiques de cellules à l’intérieur de tissus, ou de molécules à l’intérieur de cellules.
Les composants principaux du microscope à fluorescence chevauchent considérablement ceux du microscope optique traditionnel. Cependant les deux différences principales sont le type de source lumineuse et l’utilisation d’éléments filtrants spécialisés.
La microscopie de fluorescence requiert une source de lumière très puissante, comme une lampe au xénon ou au mercure à arc comme celle montrée ici. La lumière émise par une lampe au mercure est 10 à 100 fois plus brillante que la plupart des lampes incandescentes, et fournit une lumière dans une large gamme de longueur d’ondes, de l’ultraviolet à l’infrarouge. Cette source de lumière a haute puissance est la partie la plus dangereuse du paramétrage du microscope de fluorescence, car regarder directement la lumière non filtrée peut causer de sérieux dommages à la rétine, et le mauvais traitement des ampoules peut provoquer leur explosion.
Le principe derrière la microscopie de fluorescence est simple. Lorsque la lumière quitte la lampe, elle est dirigée à travers un filtre excitateur, qui sélectionne la longueur d’onde d’excitation.
Cette lumière est réfléchie vers l’échantillon grâce à un miroir spécial appelé miroir dichroïque ou miroir semi-réfléchissant, qui est conçu pour réfléchir uniquement la lumière à la longueur d’onde d’excitation. La lumière réfléchie passe à travers l’objectif où elle est focalisée sur l’échantillon fluorescent. Les émissions de l’échantillon passent à leur tour à travers l’objectif – où l’agrandissement de l’image a lieu – et ensuite à travers le miroir dichroïque.
Cette lumière est filtrée par le filtre d’émission (ou filtre barrière), qui sélectionne la longueur d’onde d’émission, et filtre les faisceaux lumineux contaminants de la lampe ou d’autres sources qui sont réfléchies en dehors des composants du microscope. Finalement, l’émission fluorescente filtrée est envoyée vers un détecteur où l’image peut être numérisée, ou etre transmise à l’oculaire pour le visionnage optique.
Le filtre d’excitation, le miroir dichroïque, et le filtre d’émission peuvent être assemblés en un composant connu comme le cube filtrant. Différents cubes filtrants peuvent être inter-changés lors de l’observation d’un échantillon en vue de changer la longueur d’onde d’excitation, et une série de diaphragmes peut être utilisée pour modifier l’intensité de l’excitation.
Lorsqu’il s’agit d’effectuer une microscopie de fluorescence, le fluorochrome peut être aussi important que le microscope en lui-même, et le type de fluorochrome imagé dicte la longueur d’onde d’excitation utilisée et la longueur d’onde d’émission qui est détectée. La longueur d’onde d’excitation contient une petite gamme d’énergies qui peuvent être absorbées par le fluorochrome et provoquer sa transition vers un état excité. Une fois excité, une large gamme d’émissions, ou de transitions de retour au niveau d’énergie inférieur, peuvent résulter en un spectre d’émission.
La différence entre le pic d’absorption, ou courbe d’excitation, et le pic de la courbe d’émission est connu comme le déplacement de Stokes. Plus grande est la distance de ce déplacement, plus il est facile de séparer les deux longueurs d’ondes différentes. De plus, n’importe quel chevauchement de spectre nécessite d’être retiré par les composants du cube filtrant pour réduire le fond et améliorer la qualité de l’image.
L’exposition du fluorochrome à une excitation prolongée provoquera son photoblanchiment, qui est un affaiblissement ou une perte de fluorescence. Pour réduire le photoblanchiment, vous pouvez ajouter un milieu de montage anti-effacement à la lame et sceller les côtés avec du vernis à ongles. La lame devrait aussi être conservée dans le noir lorsqu’elle n’est pas visionnée.
Pour commencer une imagerie par fluorescence, allumez la source de lumière au xénon ou mercure et laissez la chauffer pendant 15 minutes en vue d’atteindre une illumination constante.
Ensuite, placez l’échantillon sur la platine et sécurisez-le en place. Maintenant, allumez la lumière blanche de votre microscope. Faites la mise au point sur l’échantillon en utilisant l’objectif de plus basse puissance, en pivotant les boutons de focus grossier et fin. Ensuite, utilisez les boutons d’ajustement de la platine pour trouver la zone d’intérêt.
Ensuite, éteignez la lumière blanche, ainsi que toute lumière de la pièce non nécessaire pour réduire le fond.
Sélectionnez le cube filtrant approprié pour le colorant que vous regardez et ouvrez l’obturateur pour illuminer l’échantillon.
Enfin, faites les ajustements de mise au point et dirigez la lumière sortante vers l’appareil photo d’imagerie. Vous aurez besoin d’ajuster le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et coloration différents utilisés. Cependant, il est important de garder le temps d’exposition constant lors de la comparaison de caractéristiques sur différents échantillons avec la même coloration.
Pour imager les colorations multiples sur le même échantillon, changez le cube filtrant pour associer chaque fluorochrome à une nouvelle image et enregistrez la.
Après que chaque coloration de l’échantillon ait été imagée, les images individuelles peuvent être superposées et fondues.
Nombreux sont les types d’experiences qui peuvent faire usage de la microscopie de fluorescence, et impliquent différents types de fluorochromes. Une des utilisations les plus courantes est l’imagerie de protéines qui ont été marquées avec des anticorps qui sont attachés, ou « conjugués » à des composés fluorescents. Ici, un anticorps sur des protéine de surface leptospiral a été détecté en utilisant un anticorps secondaire, conjugué au Alexa Fluor, qui fluoresce vert lorsqu’il est excité.
Un autre moyen de mettre en évidence une caractéristique spécifique grace a la fluorescence est d’intégrer le code d’une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte, ou GFP pour « Green Fluorescent Protein » en anglais, dans l’ADN de l’organisme. Le gène pour GFP était à l’origine isolé à partir de méduse et peut maintenant être exprimé, ou produit, par des cellules cultivées en réponse à une amorce spécifique, ou comme partie d’un type spécifique de cellules comme les cellules tumorales que vous voyez ici lumineuses.
Une autre utilisation de l’imagerie de fluorescence est la microscopie de fluorescence Speckle, qui est une technique qui utilise un assemblage de macromolécules marquées par fluorescence comme le réseau de F-actin montré ici, pour étudier le mouvement et le taux de renouvellement cinétique de cette importante protéine cytosquelettique.
Une technique avancée connue comme la fluorescence récupérée après photoblanchiment, ou FRAP pour « Fluorescence Recovery After Photobleaching », est effectuée par le photoblanchiment intentionnel d’une petite région d’un échantillon, en vue de surveiller le taux de diffusion des molécules marquées par fluorescence, de retour dans la région photoblanchie.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Microscopie de Fluorescence. Dans cette vidéo nous avons vu le concept de fluorescence, comment la microscopie de fluorescence diffère de la microscopie optique, et comment prendre une image fluorescente à travers l’objectif. Nous avons aussi vu quelques applications de base et avancées qui utilisent la fluorescence. Merci de nous avoir regardé et n’oubliez pas que si le photoblanchiment est joli sur vos dents, ce n’est pas bon pour vos échantillons.
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La fluorescence est un phénomène qui prend place lorsqu’une substance absorbe la lumière à une longueur d’onde donnée et émet de la lumière à une autre longueur d’onde. La fluorescence apparait lorsqu’un électron, qui a été excité vers un état d’énergie plus haut et plus instable, redescend dans son état initial et émet un photon de lumière. La lumière qui est responsable de l’excitation, ou du déplacement de l’électron vers un niveau d’énergie supérieur, est de longueur d’onde plus courte et d’énergie plus haute que l’émission de fluorescence, qui a une longueur d’onde plus longue, une énergie plus faible et une couleur différente.
La microscopie de fluorescence mélange les propriétés grossissantes du microscope optique avec la technologie de fluorescence qui permet l’excitation et la détection des émissions de fluorochromes (des composés chimiques fluorescents). Avec la microscopie de fluorescence, les scientifiques peuvent observer la localisation de types spécifiques de cellules à l’intérieur de tissus, ou de molécules à l’intérieur de cellules.
Les composants principaux du microscope à fluorescence chevauchent considérablement ceux du microscope optique traditionnel. Cependant les deux différences principales sont le type de source lumineuse et l’utilisation d’éléments filtrants spécialisés.
La microscopie de fluorescence requiert une source de lumière très puissante, comme une lampe au xénon ou au mercure à arc comme celle montrée ici. La lumière émise par une lampe au mercure est 10 à 100 fois plus brillante que la plupart des lampes incandescentes, et fournit une lumière dans une large gamme de longueur d’ondes, de l’ultraviolet à l’infrarouge. Cette source de lumière a haute puissance est la partie la plus dangereuse du paramétrage du microscope de fluorescence, car regarder directement la lumière non filtrée peut causer de sérieux dommages à la rétine, et le mauvais traitement des ampoules peut provoquer leur explosion.
Le principe derrière la microscopie de fluorescence est simple. Lorsque la lumière quitte la lampe, elle est dirigée à travers un filtre excitateur, qui sélectionne la longueur d’onde d’excitation.
Cette lumière est réfléchie vers l’échantillon grâce à un miroir spécial appelé miroir dichroïque ou miroir semi-réfléchissant, qui est conçu pour réfléchir uniquement la lumière à la longueur d’onde d’excitation. La lumière réfléchie passe à travers l’objectif où elle est focalisée sur l’échantillon fluorescent. Les émissions de l’échantillon passent à leur tour à travers l’objectif – où l’agrandissement de l’image a lieu – et ensuite à travers le miroir dichroïque.
Cette lumière est filtrée par le filtre d’émission (ou filtre barrière), qui sélectionne la longueur d’onde d’émission, et filtre les faisceaux lumineux contaminants de la lampe ou d’autres sources qui sont réfléchies en dehors des composants du microscope. Finalement, l’émission fluorescente filtrée est envoyée vers un détecteur où l’image peut être numérisée, ou etre transmise à l’oculaire pour le visionnage optique.
Le filtre d’excitation, le miroir dichroïque, et le filtre d’émission peuvent être assemblés en un composant connu comme le cube filtrant. Différents cubes filtrants peuvent être inter-changés lors de l’observation d’un échantillon en vue de changer la longueur d’onde d’excitation, et une série de diaphragmes peut être utilisée pour modifier l’intensité de l’excitation.
Lorsqu’il s’agit d’effectuer une microscopie de fluorescence, le fluorochrome peut être aussi important que le microscope en lui-même, et le type de fluorochrome imagé dicte la longueur d’onde d’excitation utilisée et la longueur d’onde d’émission qui est détectée. La longueur d’onde d’excitation contient une petite gamme d’énergies qui peuvent être absorbées par le fluorochrome et provoquer sa transition vers un état excité. Une fois excité, une large gamme d’émissions, ou de transitions de retour au niveau d’énergie inférieur, peuvent résulter en un spectre d’émission.
La différence entre le pic d’absorption, ou courbe d’excitation, et le pic de la courbe d’émission est connu comme le déplacement de Stokes. Plus grande est la distance de ce déplacement, plus il est facile de séparer les deux longueurs d’ondes différentes. De plus, n’importe quel chevauchement de spectre nécessite d’être retiré par les composants du cube filtrant pour réduire le fond et améliorer la qualité de l’image.
L’exposition du fluorochrome à une excitation prolongée provoquera son photoblanchiment, qui est un affaiblissement ou une perte de fluorescence. Pour réduire le photoblanchiment, vous pouvez ajouter un milieu de montage anti-effacement à la lame et sceller les côtés avec du vernis à ongles. La lame devrait aussi être conservée dans le noir lorsqu’elle n’est pas visionnée.
Pour commencer une imagerie par fluorescence, allumez la source de lumière au xénon ou mercure et laissez la chauffer pendant 15 minutes en vue d’atteindre une illumination constante.
Ensuite, placez l’échantillon sur la platine et sécurisez-le en place. Maintenant, allumez la lumière blanche de votre microscope. Faites la mise au point sur l’échantillon en utilisant l’objectif de plus basse puissance, en pivotant les boutons de focus grossier et fin. Ensuite, utilisez les boutons d’ajustement de la platine pour trouver la zone d’intérêt.
Ensuite, éteignez la lumière blanche, ainsi que toute lumière de la pièce non nécessaire pour réduire le fond.
Sélectionnez le cube filtrant approprié pour le colorant que vous regardez et ouvrez l’obturateur pour illuminer l’échantillon.
Enfin, faites les ajustements de mise au point et dirigez la lumière sortante vers l’appareil photo d’imagerie. Vous aurez besoin d’ajuster le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et coloration différents utilisés. Cependant, il est important de garder le temps d’exposition constant lors de la comparaison de caractéristiques sur différents échantillons avec la même coloration.
Pour imager les colorations multiples sur le même échantillon, changez le cube filtrant pour associer chaque fluorochrome à une nouvelle image et enregistrez la.
Après que chaque coloration de l’échantillon ait été imagée, les images individuelles peuvent être superposées et fondues.
Nombreux sont les types d’experiences qui peuvent faire usage de la microscopie de fluorescence, et impliquent différents types de fluorochromes. Une des utilisations les plus courantes est l’imagerie de protéines qui ont été marquées avec des anticorps qui sont attachés, ou « conjugués » à des composés fluorescents. Ici, un anticorps sur des protéine de surface leptospiral a été détecté en utilisant un anticorps secondaire, conjugué au Alexa Fluor, qui fluoresce vert lorsqu’il est excité.
Un autre moyen de mettre en évidence une caractéristique spécifique grace a la fluorescence est d’intégrer le code d’une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte, ou GFP pour « Green Fluorescent Protein » en anglais, dans l’ADN de l’organisme. Le gène pour GFP était à l’origine isolé à partir de méduse et peut maintenant être exprimé, ou produit, par des cellules cultivées en réponse à une amorce spécifique, ou comme partie d’un type spécifique de cellules comme les cellules tumorales que vous voyez ici lumineuses.
Une autre utilisation de l’imagerie de fluorescence est la microscopie de fluorescence Speckle, qui est une technique qui utilise un assemblage de macromolécules marquées par fluorescence comme le réseau de F-actin montré ici, pour étudier le mouvement et le taux de renouvellement cinétique de cette importante protéine cytosquelettique.
Une technique avancée connue comme la fluorescence récupérée après photoblanchiment, ou FRAP pour « Fluorescence Recovery After Photobleaching », est effectuée par le photoblanchiment intentionnel d’une petite région d’un échantillon, en vue de surveiller le taux de diffusion des molécules marquées par fluorescence, de retour dans la région photoblanchie.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Microscopie de Fluorescence. Dans cette vidéo nous avons vu le concept de fluorescence, comment la microscopie de fluorescence diffère de la microscopie optique, et comment prendre une image fluorescente à travers l’objectif. Nous avons aussi vu quelques applications de base et avancées qui utilisent la fluorescence. Merci de nous avoir regardé et n’oubliez pas que si le photoblanchiment est joli sur vos dents, ce n’est pas bon pour vos échantillons.
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Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Chapitres dans cette vidéo
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary