La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier les effets des changements dans le rapport et le moment relatif des entrées synaptiques excitatrices et inhibitrices sur l’activité de pointe des neurones en utilisant des cellules ganglionnaires rétiniennes comme neurones modèles. Ceci est réalisé en patchant le corps cellulaire d’une cellule ganglionnaire dans une rétine entière, à l’aide d’une pipette en verre remplie d’une solution intracellulaire qui ressemble à la composition ionique physiologique et au jaune de Lucifer pour identifier morphologiquement le type de cellule comme une deuxième étape à l’aide d’une pince dynamique, un ensemble de formes d’onde de conductance excitatrices et inhibitrices sont injectées dans le corps cellulaire, qui produisent une modification du potentiel membranaire en réponse. Ensuite, diverses formes d’onde de conductance obtenues à partir d’expériences physiologiques dans des conditions de contrôle, ou en présence de médicaments, sont injectées dans le corps cellulaire afin d’obtenir les réponses neuronales correspondantes.

Les résultats montrent les effets des modifications du rapport d’excitation et d’inhibition sur l’activité de pointe des cellules ganglionnaires rétiniennes basées sur l’injection de courants composés de conductances excitatrices et inhibitrices via des enregistrements de pince dynamique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la pince de courant ou la pince de tension, est qu’elle fournit un outil interactif par lequel le rapport et le timing relatif des conductances synaptiques excitatrices et inhibitrices peuvent être injectés dans les neurones pour étudier l’influence sur les réponses cellulaires. Cette méthodologie peut fournir des informations sur le fonctionnement des circuits rétiniens ainsi que de tout autre réseau neuronal du système nerveux central.

Commencez cette procédure en mettant en place le système de reperfusion avec 250 millilitres du milieu de visée oxygéné carboxy dans la configuration électrophysiologique. Ensuite, étalez uniformément une fine couche de graisse sous vide sur le fond de la chambre de perfusion. Scellez-le avec un couvercle et assurez-vous qu’il est hermétique.

Placez ensuite une petite quantité de graisse sur les extrémités supérieure et inférieure de la chambre. La graisse maintiendra la grille en place et l’empêchera d’appuyer trop fort sur la rétine. Fixez maintenant la chambre sur la plate-forme et alignez ensuite les deux ouvertures.

Sacrifier un animal par luxation cervicale après avoir été anesthésié avec du fluor. Retirez rapidement ses yeux à l’aide d’une paire de petits ciseaux incurvés. Lavez-les soigneusement avec du liquide extracellulaire oxygéné dans un petit bécher et placez-les dans une boîte de Pétri remplie de liquide extracellulaire oxygéné.

Sous le microscope à dissection, faites un trou d’insertion à l’aide d’une aiguille de calibre 19 dans la cornée à environ deux millimètres du bord des deux yeux. Cette étape importante doit être rapide pour permettre l’oxygénation des deux rênes. Après cela, retirez une cornée avec une petite paire de ciseaux à iris en coupant parallèlement à son bord.

Ensuite, retirez l’iris et le cristallin à l’aide d’une paire de pinces fines et répétez les procédures pour l’autre œil. Transférez un œilleton dans un bécher contenant la solution extracellulaire oxygénée de carbox. Avec la lame du scalpel, coupez un œilleton en deux, séparez doucement la rétine de l’épithélium pigmentaire à l’aide d’une sonde de dissection émoussée ou en le retirant doucement.

Tenez ensuite le bord du tissu rétinien détaché près de l’aura Serta avec une paire de pinces fines et saisissez l’aura serta avec une autre paire de pinces fines. Tirez-le vers le centre de la rétine. Il s’agit d’un processus délicat qui peut prendre quelques tentatives.

Si l’aura réussit, le corps ciliaire Serta et l’humeur vitrée seront éliminés et la courbure de la rétine sera réduite. Ensuite, coupez les bords, puis transférez la rétine dans la chambre de perfusion avec les cellules ganglionnaires vers le haut. Maintenez le mouchoir en place en plaçant la grille sur les boules de graisse.

Conservez le tissu restant avec l’autre œilleton dans la solution extracellulaire oxygénée de la boîte de transport pour une utilisation ultérieure ; montez la chambre d’enregistrement sous un microscope vertical. Ajustez immédiatement la perfusion continue de la rétine avec une solution extracellulaire oxygénée Carbox À un rythme de trois à cinq millilitres par minute à 35,5 degrés Celsius, assurez-vous que l’électrode de mise à la terre est en place. Allumez maintenant la source lumineuse du microscope et concentrez-vous sur les corps cellulaires des cellules ganglionnaires à travers les 40 x de l’objectif.

Localisez le centre du support de trou pour l’enregistrement. Dans cette étape, fixez une pipette en verre de cinq à huit méga ohms dans son support et déplacez-la sous le microscope à l’aide d’un manipulateur micrométrique sous un objectif 40x. Abaissez lentement la pipette jusqu’à ce qu’elle forme une petite fossette à la surface de la membrane limitante interne.

Avancez délicatement la pipette vers l’avant jusqu’à ce qu’elle attrape une petite quantité de tissu, puis déplacez-la vers le haut et/ou sur le côté pour déchirer un petit trou afin d’exposer les corps cellulaires des cellules ganglionnaires. Remplissez maintenant une pipette propre de huit à 10 microlitres, une solution intracellulaire à base de potassium avec du jaune Lucifer. Insérez-le dans le support, fixé à la tête de l’amplificateur, et assurez-vous que l’électrode de chlorure d’argent chloré est immergée.

Sélectionnez une cellule avec un corps à grandes cellules. Abaissez lentement la pointe de la pipette avec une pression positive pour faire une petite fossette à la surface de la membrane. Arrêtez ensuite et relâchez la pression pour obtenir une giga étanchéité.

Une fois qu’une giga étanchéité est obtenue, appliquez doucement une pression négative pour briser la membrane afin d’obtenir une configuration de pince de patch de cellule entière. Cette procédure est une étape délicate. Si une pression négative trop importante est appliquée, la connexion fuit.

S’il est trop peu, la membrane reste intacte. Au fil du temps, le jaune Lucifer remplira la cellule, permettant de visualiser la morphologie de la cellule si elle est stable. Cette configuration doit durer 30 minutes ou plus.

Effectuez maintenant un test de tension de courant de moins 75 millivolts à 35 millivolts tous les 10 millivolts à l’aide de patch master et passez aux tests ultérieurs. Seulement si un courant de sodium supérieur à un nanoampère est présent. Ensuite, ouvrez la vue laboratoire et exécutez le programme neuro acuma écrit personnalisé.

Réglez le nombre de répétitions sur huit. Réglez ensuite les potentiels d’inversion des conductances excitatrices et inhibitrices à zéro et moins 75 millivolts respectivement. Sélectionnez une paire correspondante de conductances excitatrices et inhibitrices pour le test et la trace verte de conductance excitatrice et la trace rouge de conductance inhibitrice apparaîtront dans le panneau inférieur.

Après cela, revenez à patch master et sélectionnez le mode de pince actuel. Basculez immédiatement l’amplificateur en mode pince de courant en neuro acuma. Appuyez sur le bouton d’enregistrement.

La réponse cellulaire avec une rafale aphasique de potentiels d’action apparaîtra sur le panneau supérieur. Injectez ensuite du courant dans la cellule à faible conductance. Tout d’abord, si peu ou pas de réponse est observée, augmentez le courant par petits incréments jusqu’à ce qu’il produise une forte réponse.

Une injection excessive de courant peut tuer la cellule. Une fois les tests terminés. Sélectionnez une nouvelle paire de formes d’onde de conductance et répétez les procédures pour toutes les paires de conductances physiologiques et artificielles.

Après l’enregistrement, rétractez soigneusement la pipette pour que le corps cellulaire reste intact. Ensuite, fixez immédiatement le tissu et 4 % de para formaldéhyde pendant 30 minutes, suivi de trois lavages de 10 minutes avec un tampon de phosphate 0,1 molaire, réfrigérez et effectuez la coloration des anticorps le lendemain ou dans la semaine lorsque vous êtes prêt. Colorer contre les cellules ganglionnaires remplies de jaune Lucifer à température ambiante avec une IgG primaire anti Lucifer jaune de lapin à une dilution de un à 10 000 pendant cinq jours.

Ensuite, le sixième jour, en passant la nuit avec la chèvre secondaire anti lapin IgG, ajoutez une dilution de un à 500 À la fin, montez humide la rétine dans un milieu de conservation fluorescent. Placez la lamelle et scellez-la avec du vernis à ongles. Prenez des images confocales de la morphologie cellulaire à l’aide d’un microscope confocal Leica SPECT deux.

Voici les réponses d’une cellule ganglionnaire à l’injection de formes d’onde de conductance excitatrice et inhibitrice obtenues à partir des expériences de contrôle indiquées respectivement en vert et en rouge. Et voici les réponses à l’injection de formes d’onde de conductance enregistrées après l’application en bain de tétrodatoxine. Voici les réponses d’une autre cellule ganglionnaire à diverses paires de formes d’onde de conductance bras.

Les rapports entre la conductance excitatrice et la conductance inhibitrice ont été modifiés de un à zéro à un à deux. Au fur et à mesure que le degré d’inhibition augmentait, la réponse de la cellule diminuait, et voici les réponses d’une cellule ganglionnaire au même niveau d’excitation dans lequel le début de l’inhibition variait. Delta T représente la différence de temps entre le début des conductances inhibitrices et excitatrices.

Au fur et à mesure que le délai d’inhibition diminuait, la réponse de la cellule devenait plus faible. Cette procédure est une technique puissante qui permet de révéler les interactions entre l’exci trois et l’entrée synap inhibitrice qui génère une sortie neuronale.