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Le microscope optique est un instrument utilisé par les chercheurs dans de nombreux domaines différents pour agrandir les échantillons jusqu’à autant que mille fois leur taille d’origine. Dans sa forme la plus simple, il est composé d’une lentille transparente qui agrandit l’objet et d’une source de lumière pour l’illuminer. Cependant, la plupart des microscopes optiques sont bien plus complexes et possèdent de nombreuses lentilles peaufinées avec des dimensions strictement contrôlées, tout cela à l’intérieur du corps du microscope dans les composants de l’objectif et de l’oculaire.
Dans cette vidéo, les composants majeurs du microscope optique sont décrits et leurs utilisations et fonctions sont expliquées en détails. Les principes de base de grossissement, mise au point, et résolution sont aussi introduits. Le fonctionnement du microscope optique de base commence par l’éclairage de l’échantillon et la vérification que la source de lumière est de la bonne intensité, direction, et forme en vue de produire la meilleure qualité d’image possible. Ensuite, l’échantillon doit être agrandit correctement et amené dans le champ de vision pour voir la région d’intérêt. Il y a beaucoup d’utilisations pratiques du microscope optique incluant le visionnage de cellules et de tissus tachés ou non, de petits détails d’échantillons, et même le grossissement d’une région d’intérêt lors d’une chirurgie pour aider aux procédures complexes à l’échelle du micron.
Le microscope optique est un instrument utilisé pour agrandir des prélèvements de recherche. Les microscopes optiques sont des outils d’analyse inestimables qui ont le potentiel de permettre aux chercheurs scientifiques de voir des objets à 1000 fois leur taille d’origine. Comme vous allez le voir, le microscope optique fonctionne via quelques principes très basiques mais a des utilisations presque sans limite pour visualiser des prélèvements au labo.
Le microscope optique – « Light Microscope » en anglais – requiert une source de lumière, qui produit la lumière qui peut être focalisée, par un condensateur, sur l’échantillon.
La lumière qui illumine l’échantillon atteint une lentille appelée lentille objet, qui crée une image agrandie qui est renversée, ou tournée la tête en bas. Un peu plus loin la lentille de l’oculaire agrandit l’image, image que l’oeil alors reçoit. Des éléments optiques additionnels peuvent être introduits dans le chemin des faisceaux lumineux en vue de redresser l’image, de manière à ce que l’oeil la voit dans la bonne orientation. Les microscopes qui utilisent de multiples lentilles comme celui que vous voyez ici sont appelés « microscopes composés ».
Dans un microscope composé, l’agrandissement total est calculé par la multiplication de l’agrandissement de la lentille de l’objectif par l’agrandissement de la lentille de l’oculaire. Avec une lentille objet de 40X et une lentille oculaire de 10X, l’agrandissement total est de 400X.
Pour aider à estimer la taille des objets sous le microscope, un réticule oculaire - une échelle qui est projetée au-dessus de l’image - peut être utilisé. A grossissement supérieur, les fines marques dans le réticule oculaire représenteront de plus petites distances que lorsqu’elles sont vues à un grossissement inférieur.
En plus du grossissement, un autre aspect du microscope optique est sa résolution. La résolution est la plus petite distance observable entre deux objets distincts par le microscope. Lorsque les têtes de ces personnages deviennent de plus en plus claires, et que la résolution augmente, la plus petite distance observable entre eux décroit.
Les composants principaux du microscope optique incluent les objectifs, les oculaires, l’étage de l’échantillon et le porte échantillon, la source de lumière, le champ du diaphragme, le condensateur et l’ouverture, et les roulettes de focalisation grossières ou fines.
Les objectifs sont responsables pour la majeure partie du grossissement et de la résolution du microscope. Ils sont montés sur un nez rotatif de sorte que lorsqu’ils sont échangés, le plan focal reste le même – on dit qu’ils sont parafocaux. Un objectif peut être marqué avec le grossissement, l’ouverture numérique ou N.A., le type de milieu d’immersion requis, l’épaisseur de la lamelle qui devrait être utilisée pour le montage d’échantillons, et la distance de travail – la distance à partir du bout de la lentille jusqu’au plan focal dans l’échantillon.
L’ouverture numérique, écrite N.A., est une mesure de la capacité de l’objectif du microscope à recueillir la lumière. Des objectifs à N.A. eleve permettent à la lumière oblique de passer à travers alors que des objectifs à bas N.A. peuvent seulement recueillir la lumière directe. La résolution d’un objectif peut être calculée à partir de l’ouverture numérique, sur base de la longueur d’onde de la lumière.
La source de lumière, le champ du diaphragme, l’ouverture, et le condensateur sont tous responsables pour la production et la mise en forme de la lumière qui est envoyée sur l’échantillon.
La source de lumière est typiquement une ampoule halogène à faible voltage qui peut être ajustée pour contrôler l’intensité de la lumière. La lumière passe alors à travers une grande variété de filtres et dans le champ du diaphragme, qui contrôle la surface de l’échantillon à illuminer.
Vient ensuite le condensateur, qui focalise la lumière sur l’échantillon, càd que le cône d’illumination autour de l’échantillon est contrôlé par lui et doit être ajusté en fonction de l’objectif qui est utilisé.
Pour commencer à utiliser un microscope optique, placez un échantillon contenant la région d’intérêt sur le plateau du microscope, centrez le directement sous l’objectif et sécurisez le en place en utilisant les pattes.
Ensuite, allumez la source lumineuse et changez l’objectif pour celui de la plus petite puissance.
Puis, focalisez l’objectif de petite puissance, en le déplaçant dans la direction des Z, en utilisant un ajustement initial avec le bouton de réglage grossier, puis faites tourner le bouton de réglage fin pour amener l’objet à une mise au point nette. Faites attention à ne pas cogner la lame avec l’objectif car cela pourrait endommager la lentille.
Ensuite, localisez la zone d’intérêt en regardant à travers l’oculaire tout en tournant les boutons pour déplacer la lame dans les directions de X et de Y. La taille du champ de vision diminuera drastiquement lorsque vous changerez d’un grossissement faible à un grossissement élevé. Centrer l’objectif de la plus petite puissance sur la zone d’intérêt avant de changer pour une puissance supérieure, augmente grandement les chances de trouver l’échantillon désiré.
Une fois que l’échantillon a été localisé à une puissance inférieure et que la mise au point est faite, passez à l’objectif de puissance supérieure qui sera utilisé pour l’acquisition des images.
Optimisez la qualité de l’éclairage en ajustant d’abord le champ du diaphragme de manière à ce que le diaphragme soit juste à l’extérieur du champ de vision.
Ensuite, ajustez le diaphragme du condensateur de façon à ce que le paramétrage corresponde à l’ouverture numérique de l’objectif utilisé.
Enfin, ajustez la focalisation à nouveau. Cette fois en utilisant uniquement le bouton de réglage fin.
Vous êtes maintenant prêt à prendre des images de votre échantillon.
La microscopie optique a le potentiel pour visualiser une large gamme de prélèvements, et il existe plusieurs configurations du microscope composé pour s’adapter à de nombreuses utilisations différentes.
Ici, vous voyez un chercheur préparant le travail sous un microscope chirurgical. Ces microscopes sont généralement suspendus sur un bras mobile et sont stéréoscopiques, ce qui signifie qu’ils permettent à la lumière de passer jusqu’au visionneur, et un appareil photo est aussi monté sur le microscope. Ce microscope chirurgical est utilisé dans une procédure de transplantation de rein, sur des souris.
Dans ce clip vidéo, vous voyez un chercheur regardant à travers un microscope à dissection, tout en sélectionnant la parfaite larve de drosophile pour une dissection en amont, en vue d’exposer les muscles de la paroi du corps afin d’étudier la jonction neuromusculaire.
Ici vous pouvez voir un microscope composé inversé, qui a un objectif en-dessous du plateau, étant préparé pour une technique de micro-injection. Cette procédure, appelée transfert nucléaire de cellules somatiques, est une méthode importante pour générer des animaux transgéniques et créer des clones.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la microscopie optique. Dans cette vidéo nous avons vu : ce qu’est un microscope et comment il fonctionne, ses composants, comment les régler, et comment acquérir des images de qualité. Merci de nous avoir regardé!
Le microscope optique est un instrument utilisé pour grossir des échantillons de recherche. Les microscopes optiques sont un outil d’analyse inestimable qui a le potentiel de permettre aux chercheurs scientifiques d’observer des objets 1000 fois plus grands que leur taille d’origine. Comme vous le verrez, le microscope optique fonctionne selon des principes très basiques, mais ses applications sont presque illimitées pour visualiser des échantillons en laboratoire.
Comme son nom l’indique, le microscope optique nécessite une source lumineuse, qui produit une lumière qui peut être focalisée, par une lentille de condenseur, sur l’échantillon.
La lumière qui éclaire l’échantillon atteint une lentille connue sous le nom de lentille d’objectif, qui crée une image agrandie inversée ou retournée. L’oculaire, ou lentille oculaire, agrandit encore l’image, que l’œil reçoit ensuite. Des éléments optiques supplémentaires peuvent être introduits dans le trajet de la lumière pour redresser l’image, afin que l’œil la voie dans la bonne orientation. Les microscopes qui utilisent plusieurs lentilles comme celui que vous voyez ici sont appelés microscopes composés.
Dans un microscope composé, le grossissement total est calculé en multipliant le grossissement de la lentille de l’objectif par le grossissement de la lentille oculaire, ou oculaire. Avec un objectif 40X et un objectif oculaire 10X, le grossissement total est de 400X.
Pour aider à estimer la taille des objets sous le microscope, un réticule oculaire, une échelle projetée sur l’image, peut être utilisé. À un grossissement plus élevé, les graduations dans le réticule de l’oculaire représenteront des distances plus petites que lorsqu’elles sont observées à des grossissements plus faibles.
En plus du grossissement, un autre aspect de l’optique du microscope est la résolution. La résolution fait référence à la distance résoluble la plus courte entre deux objets sous l’étendue. Au fur et à mesure que les têtes de ces personnages deviennent de plus en plus claires et que la résolution augmente, la distance observable la plus courte entre eux diminue.
Les principaux composants du microscope optique sont les objectifs, les oculaires, la platine et le porte-échantillon, la source lumineuse, le diaphragme de champ, le condenseur et l’ouverture, ainsi que les boutons de mise au point grossiers et fins.
Les objectifs sont responsables de la majeure partie du grossissement et de la résolution du microscope. Ils sont montés sur une tourelle porte-objectifs rotative de telle sorte que lorsque les objectifs sont changés, le plan focal reste le même ? une propriété appelée parafocalité. Un objectif peut être marqué avec le grossissement, l’ouverture numérique, ou N.A., le type de milieu d’immersion requis, l’épaisseur de lamelle de recouvrement qui doit être utilisée lors du montage d’échantillons et la distance de travail - la distance entre l’extrémité de l’élément de lentille et le plan focal dans l’échantillon.
L’ouverture numérique, encore une fois, définie comme N.A., est une mesure de la capacité d’un objectif de microscope à recueillir la lumière. Les objectifs à N.A. élevés laissent passer la lumière à angles obliques, tandis que les objectifs à N.A. faibles nécessitent une lumière plus directe. La résolution d’un objectif peut être calculée à partir de l’ouverture numérique, compte tenu de la longueur d’onde de la lumière.
La source lumineuse, le diaphragme de champ, l’ouverture et le condenseur sont tous responsables de la production de la lumière et de son acheminement vers l’échantillon.
La source lumineuse est généralement une ampoule halogène basse tension qui peut être ajustée pour contrôler l’intensité lumineuse.
La lumière passe ensuite à travers une variété de filtres et dans le diaphragme de champ, qui contrôle la zone de l’échantillon à éclairer.
Vient ensuite le condenseur, qui concentre une lumière vive sur l’échantillon, le cône d’éclairage autour de l’échantillon est contrôlé par le condenseur et doit être ajusté en fonction de l’objectif utilisé.
Pour commencer à utiliser le microscope optique, placez un échantillon contenant la région d’intérêt sur la platine du microscope, centrez-le directement sur l’objectif et fixez-le en place à l’aide des clips de platine.
Ensuite, allumez la source lumineuse et passez à l’objectif le moins puissant.
Ensuite, faites la mise au point sur l’objectif de faible puissance en le déplaçant dans la direction z à l’aide d’un réglage initial du bouton de réglage grossier, puis en tournant les boutons de réglage fin pour faire la mise au point sur l’objet. Veillez à ne pas heurter la diapositive ou la platine avec l’objectif, car cela pourrait endommager l’objectif.
Ensuite, localisez la zone d’intérêt en regardant à travers les oculaires tout en ajustant les boutons pour déplacer la diapositive dans les directions x et y. La taille du champ de vision diminuera considérablement à mesure que vous passerez d’un faible grossissement à un grossissement plus élevé.
Centraliser l’objectif de puissance la plus basse sur la zone d’intérêt avant de passer à une puissance plus élevée augmente considérablement les chances de trouver le spécimen souhaité.
Une fois que l’échantillon a été localisé à faible puissance et qu’il est net, passez à l’objectif de puissance supérieure qui sera utilisé pour l’acquisition d’images.
Optimisez la qualité de l’éclairage en ajustant d’abord le diaphragme de champ de sorte que le diaphragme lui-même soit juste en dehors du champ de vision.
Ensuite, ajustez le diaphragme du condenseur de manière à ce que les paramètres correspondent à l’ouverture numérique de l’objectif utilisé.
Enfin, ajustez à nouveau la mise au point. Cette fois-ci uniquement à l’aide du bouton de réglage fin.
Vous êtes maintenant prêt à prendre des images de votre échantillon.
La microscopie optique a le potentiel de visualiser un large éventail d’échantillons, et diverses configurations de microscope composé existent pour s’adapter à de nombreuses applications différentes.
Ici, vous voyez un chercheur se préparant à travailler sous un microscope chirurgical. Ces microscopes sont généralement suspendus sur un bras mobile et sont stéréoscopiques, ce qui signifie qu’ils permettent à la lumière de passer au spectateur ainsi qu’à une caméra montée sur le microscope. Ce microscope chirurgical est utilisé dans une procédure de transplantation rénale, chez la souris.
Dans ce clip, vous voyez un chercheur regarder à travers un microscope de dissection, tout en choisissant les larves de drosophile parfaites pour une dissection plus approfondie, afin d’exposer les muscles de la paroi corporelle afin que la jonction neuromusculaire puisse être étudiée.
Ici, vous pouvez voir un microscope à composé inversé, qui a un objectif sous la platine, en train d’être préparé pour une technique de micro-injection. Cette procédure, connue sous le nom de transfert nucléaire de cellules somatiques, est une méthode importante pour générer des animaux transgéniques et créer des clones.
Vous venez de regarder JoVE ? introduction à la microscopie optique.
Dans cette vidéo, nous avons passé en revue : ce qu’est un microscope et comment il fonctionne, ses nombreux composants, comment les ajuster et comment acquérir des images de qualité. Merci d’avoir regardé !
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