Name: La barre stabilisatrice: Administration de lalcool à mouches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Apprenez à mesurer les comportements induits par l'alcool chez Drosophila avec une barre stabilisatrice simple. Cette méthode évalue la sensibilité à l'alcool selon les rythmes circadiens et la génétique.

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Le financement de cette recherche a été assuré par un programme en neurosciences Prix de la Florida State University College of Medicine et le soutien du Département de sciences biologiques à l&#39;ex-URSS. Le financement supplémentaire a été fourni par une subvention en aide provenant du Fonds de recherche de la vente d&#39;alcool Fabricant.

1. Assemblée de la barre stabilisatrice Justification et vue d&#39;ensemble: Le système est conçu pour administrer des pourcentages contrôlées de vapeur d&#39;alcool aux mouches. Remarque: La figure 1 donne un aperçu schématique de la barre stabilisatrice mis en place comme décrit ci-dessous en trois étapes (assemblage de l&#39;écoulement de l&#39;air, mise en place de l&#39;alcool et des bouteilles d&#39;eau, et l&#39;assemblage des flacons d&#39;observation). En bref, un flux d&#39;air constant est divisé en deux fractions qui sont gondolées par l&#39;alcool et de l&#39;eau, respectivement, mélangés, et administrés à 4 flacons d&#39;observation. <ol><li> Assemblée de l&#39;Airflow <ol><li> Connecter un court morceau de tuyau souple en silicone, soit à l&#39;air d&#39;un bâtiment ou d&#39;un aérateur d&#39;aquarium pour générer un écoulement d&#39;air uniforme et fendu à l&#39;aide d&#39;un raccord en Y. Connecter la première branche au régulateur de débit d&#39;air qui commande la quantité totale d&#39;air à travers le système (généralement 1000 ml / min pendant 4 fioles d&#39;observation). </li><li> Insérer un raccord rapide dans le deuxième tubede sorte que le courant d&#39;air peut être interrompu au début de l&#39;expérience, sans affecter l&#39;écoulement d&#39;air calibré. Ajouter un raccord en Y et relier chaque tube de dérivation vers le régulateur de débit d&#39;air. </li><li> Relier les tubes pour les régulateurs de débit d&#39;air, puis relier deux mètres de débit d&#39;air. </li></ol></li><li> Mise en place des bouteilles d&#39;alcool et de l&#39;eau <ol><li> Ajouter tube flexible à la sortie des compteurs de débit d&#39;air et d&#39;insérer un tube en verre mince (sections de pipettes 1 ml) en verre avec un coude à 90 ° dans l&#39;extrémité de chaque longueur de tube. Ce sera le débit d&#39;air d&#39;admission dans les bouteilles d&#39;eau et d&#39;alcool. </li><li> Placer des bouchons en caoutchouc avec 2 trous à travers eux dans les bouteilles remplies avec de l&#39;alcool et de l&#39;eau. Gardez les deux bouteilles à une température constante de 2 ° C supérieure à la température de l&#39;air ambiant en utilisant un bain d&#39;eau. Dans nos expériences, la chambre de l&#39;environnement est maintenu à 25 ° C, tandis que le bain d&#39;eau est à 27 ° C. </li><li> Insérer la pipette de verre droit pour la uneir entrée à travers le bouchon de caoutchouc et s&#39;étendent dans le liquide jusqu&#39;à environ 1 cm du fond de la bouteille. </li><li> Insérer une section de coude de la pipette de verre dans l&#39;autre trou dans le bouchon de caoutchouc jusqu&#39;à ce que l&#39;extrémité du verre soit de niveau avec le fond du bouchon dans la bouteille. Insérer cette sortie d&#39;air dans une autre longueur de tube. </li><li> Réunir les courants d&#39;air au moyen d&#39;un raccord en Y et en utilisant une autre longueur de tube en silicone pour diriger le flux d&#39;air à travers un mélange flacon ou une bouteille vide avec des sections de pipette de verre courbés insérés à travers un bouchon en caoutchouc à deux trous. Utilisez une autre longueur de tube de silicone pour le flux d&#39;air mixte sortie. </li></ol></li><li> Assemblée de l&#39;Observation Vial <ol><li> Diviser le courant d&#39;air d&#39;évacuation sortant de la fiole de mélange 2 à 3 fois pour obtenir 4 ou 8 petits courants d&#39;air de sorte que de multiples flacons d&#39;observation peuvent être utilisées dans chaque expérience. Raccordez le tube de silicone souple pour les flacons d&#39;observation. </li><li> Mettre en place la observatisur des flacons en utilisant des flacons vides fermés par un bouchon en caoutchouc comportant deux trous à travers lesquels des tubes de verre fournissent une entrée et une sortie pour la vapeur d&#39;alcool. </li><li> Couvrir la fin du premier tube de verre avec un filet et garder le filet en place à l&#39;aide d&#39;un petit morceau de tube en plastique souple. Insérer ce tube à travers le premier trou jusqu&#39;à ce qu&#39;elle s&#39;étende à peu près la moitié de la longueur du flacon. Si nécessaire, utilisez du ruban téflon pour obtenir un ajustement parfait. </li><li> Insérer le second tube de verre également avec l&#39;extrémité couverte par le filet jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit de niveau avec le bord intérieur du bouchon de caoutchouc. </li><li> Placer les flacons horizontalement sur une feuille de papier blanc pour maximiser le contraste avec les mouches dans des conditions de faible lumière rouge. </li><li> Mélanger fractions appropriées du flux d&#39;air à barboter dans l&#39;alcool et le flux d&#39;air à barboter dans l&#39;eau. Surveillance de la pression de l&#39;air en continu et faire les ajustements nécessaires pour maintenir le mélange souhaité des courants d&#39;air. Remarque: Le fonctionnement continude plusieurs essais Fly Bar en parallèle ou même un seul essai dans une petite pièce peut conduire à une accumulation notable de vapeur d&#39;alcool. Pour éviter la libération continue de la vapeur d&#39;alcool qui peuvent potentiellement affecter le chercheur dans une pièce fermée, un système approprié doit être mis en place qui permet d&#39;éliminer convenablement la vapeur d&#39;alcool généré au cours de l&#39;expérience. Pour éliminer les vapeurs d&#39;alcool, connecter un morceau de tuyau 6-12 pouces sur le second tube de verre en saillie de chaque flacon, les regrouper et ordonner à un système d&#39;entonnoir vide. Les chercheurs doivent aussi veiller à ce que la salle d&#39;essai expérimental est correctement ventilée. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des animaux d&#39;expérimentation Justification et aperçu: culture et de logements de vol appropriée permettra de réduire la variabilité des données. Ce résultat est obtenu grâce à la standardisation et la réduction du stress vécu par les mouches. Pour cette raison, aucune anesthésie (CO 2 ou alternatives) est utilisé During quelconque des étapes suivantes du protocole. En outre, les mouches doivent être appariés pour l&#39;âge à travers des expériences et des points de temps pour minimiser la variabilité comme c&#39;est la norme pour d&#39;autres analyses comportementales, y compris l&#39;apprentissage et de la mémoire des expériences 17. La lumière différente: l&#39;obscurité peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l&#39;horloge circadienne dans la réponse comportementale à l&#39;éthanol. Pour déterminer si un rythme diurne existe, les expériences peuvent être effectuées en vertu d&#39;un cycle de LD définis pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). ZT 0 représente l&#39;aube et est défini comme le temps de lumières sous cycles LD, alors que ZT 12, les feux sont éteints temps avec un cycle de LD 12:12 h. Dans des conditions constantes, le temps circadien (CT) mesure le temps pour l&#39;animal en l&#39;absence de signaux de l&#39;environnement, c&#39;est à dire le temps de roue libre, et est liée au cycle LD d&#39;entraînement précédente. Dans de type sauvage drosophile, CT reflète la ZT précédente pour la première de plusieurs jourss dans des conditions constantes que la période circadienne roue libre et les rythmes sont ~ 24 h. Pour mesurer la modulation circadienne et d&#39;éliminer les effets de lumière aiguë sur le comportement, les mouches sont entraînées à la lumière: cycles sombres et ensuite transférés à l&#39;obscurité constante (DD) avant les expériences. Expériences circadiens sont effectuées sur la deuxième journée de DD pour mesurer la performance à circadien temps spécifique (CT). Chez la drosophile, la lumière continue (LL) conditions entraînent un dysfonctionnement circadien avec des oscillations moléculaires mouillées ou supprimés de base gènes circadiens et la perturbation des rythmes circadiens de comportement, comme en témoigne l&#39;activité locomotrice arythmique 18-21 et arythmique mémoire à court terme 17. Le protocole est optimisée pour les études circadiens et peut être simplifié pour d&#39;autres expériences. Toutes les expériences circadiens sont effectuées avec lumière tamisée rouge (lumière rouge de tête ambiante &lt;1 lux au-dessus de banc, les petites lumières rouges utilisé à 12 pouces de tubes~ 1 lux de lumière). <ol><li> Arrière vol à 25 ° C sous 12h12 h lumière: conditions d&#39;entraînement sombres (LD). </li><li> Recueillir les mouches fraîchement éclos à la fin de la période de lumière du jour le jour 1 et les stocker pendant 24 heures dans des conditions de LD en tenant flacons contenant une petite quantité d&#39;aliments riches en concentration agar pour minimiser la viscosité des aliments. Remarque: Pour assurer la santé, vol normalement développés sont collectées, utilisez uniquement des mouches capturées dans les premiers jours après l&#39;éclosion commence dans un flacon de culture. </li><li> Recueillir des lots d&#39;environ 30 (25-35) vole en utilisant un aspirateur le jour 2 vers la fin de la période de lumière, et le transfert des flacons de maintien frais. </li><li> Utilisez une forte source de lumière pour diriger vol à l&#39;extrémité du flacon. Dans cette gamme, le nombre exact de vol dans chaque flacon n&#39;est pas critique tant que les observations comportementales sont rapportés en pourcentages en nombre total de mouches comptées à la fin de chaque expérience. </li><li> Maintenir vol dans des conditions DD à 25 ° C for deux jours. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, toutes les mouches placer logés dans des conditions différentes ou d&#39;autres incubateurs de la salle de comportement expérimental dans la chambre pendant au moins 1 heure avant l&#39;expérience. Acclimatation réduit la variabilité due aux changements de température ou d&#39;humidité. </li><li> Faire des observations à six points de temps par jour (CT 1, 5, 9, 13, 17 et 21) afin de tester pour la modulation circadienne de comportement. </li><li> Comparez plusieurs points dans le temps au sein d&#39;un ensemble unique d&#39;expériences comportementales pour augmenter la robustesse de la conception expérimentale et de minimiser la variabilité spécifique à une seule expérience. Par exemple, les observations de CT 1 et CT 13 peuvent être obtenues simultanément si deux incubateurs avec des horaires clair-obscur opposés sont utilisés pour l&#39;entraînement. Remarque: Le procédé ci-dessus décrit la préparation d&#39;animaux de laboratoire pour des dosages effectués en état circadien d&#39;obscurité constante. Différents lumière: conditions sombres peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l&#39;horlogedans les réponses comportementales à l&#39;alcool. Pour déterminer si un rythme diurne existe les expériences peuvent être réalisées en vertu d&#39;un cycle de LD pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). En outre, le protocole peut être utilisé avec des mouches élevés dans des conditions de lumière constante pour la vérification des expériences dysfonction circadien. Pour les protocoles alternatifs qui testent vol logés dans des conditions de lumière, tests comportementaux doivent encore être effectuées dans des conditions sombres. Les mouches doivent être transférés dans l&#39;obscurité pendant 1 heure avant l&#39;expérience pour minimiser la variabilité du comportement dû aux effets aigus de la lumière sur le comportement. </li></ol> 3. Observations comportementales Justification et aperçu: Le protocole d&#39;administration d&#39;alcool suivante est optimisé pour observations sous condition de faible lumière rouge. Les deux mesures comportementales Lorr et sédation représentent deux points distincts de mouche ivresse. Lorr représente un point fin d&#39;ébriété incorporant la perte omoteur de f et le contrôle postural, tandis que les mesures de sédation un point final très tardif de l&#39;intoxication. Génotype ou modulation circadienne peuvent affecter ces deux mesures différentes; donc on peut souhaiter examiner à la fois. En bref, les mouches sont chargées dans les flacons, le numéro de vol affichant LORR sédation ou reçu sont toutes les 5 minutes pendant l&#39;exposition à la vapeur d&#39;alcool, et le nombre total de mouches comptées à la fin de l&#39;expérience. <ol><li> Avant de commencer l&#39;expérience, exécutez l&#39;air à travers le système (air barboter dans des bouteilles d&#39;eau et d&#39;alcool) pendant au moins 10 min et utiliser ce temps pour calibrer les flux d&#39;air. </li><li> Débranchez la libération rapide d&#39;arrêter le flux d&#39;air. Chargez les mouches dans les flacons, et rebranchez le flux d&#39;air et commencer les minuteries. Remarque: Si les mouches qui ne répondent pas ou mouches mortes sont laissées dans les flacons de retenue, cela pourrait être une indication de conditions de stress. En général, ces conditions peuvent être soulagés en logeant moins de mouches dans les flacons de maintien ou de diminuer la viscosité des aliments en utilisant une légèrela concentration en gélose ment plus élevé pendant la préparation des aliments. Pour les analyses comportementales optimales et une variabilité minimale entre les expériences, vol doivent être en bonne santé avant les expériences. </li><li> Pour la tenue de l&#39;heure exacte, utilisez une minuterie pour garder une trace de la durée totale de l&#39;exposition de l&#39;alcool et d&#39;utiliser un second minuteur-retour pour marquer les intervalles de 5 min. </li><li> Placez un morceau de papier blanc sous les coupes pour augmenter le contraste et voler visibilité, en particulier dans des conditions de faible lumière rouge. </li><li> Vérifiez régulièrement le flux d&#39;air lors d&#39;une expérience de maintenir des niveaux constants. Généralement, une fois que les flux d&#39;air se sont stabilisés, ils restent stables pendant la durée de l&#39;expérience. </li><li> Comptez le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement, une fois toutes les 5 minutes pendant une période de 1 heure. Comme la sensibilité à l&#39;alcool varie entre génotypes et des arrière-plans génétiques, il peut être souhaitable d&#39;effectuer des évaluations plus fréquentes ou de procéder à l&#39;expérience pendant une période de temps plus longue. </li><li> Soulevez le slightl flacony à partir de la surface, et à diriger la lumière provenant d&#39;une lampe-torche de lumière rouge vers le papier derrière le flacon. Gardez les lampes de poche rouges à main à une distance d&#39;au moins 12 pouces dans le flacon expérimental pour maintenir des niveaux ne dépassant pas 1 lux de lumière pour toutes les expériences dans des conditions de faible lumière rouge. </li><li> Mesurer les niveaux d&#39;éclairage utilisant un posemètre à établir des normes pour toutes les expériences. </li><li> Déterminer le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement en appliquant un robinet ferme le flacon et compter le nombre de mouches ne parviennent pas à se redresser dans environ 4 sec. Les mouches qui affichent Lorr peuvent encore bouger les jambes et les ailes, mais ne peuvent pas se transformer en position verticale. </li><li> A la fin de la session, compter le nombre total de mouches dans chaque flacon. Remarque: Parfois, une seule mouche peut être pris entre le bouchon et le côté lors du chargement vole dans les flacons expérimentaux. Comme cela se fait dans l&#39;obscurité, il ne peut pas être facilement remarqué, il est donc nécessaire de compter le engourdi totaleer de vol à la fin de l&#39;expérience de calculer correctement les pourcentages. </li></ol> En outre, ce procédé peut également être utilisé pour mesurer la sédation de vol, qui représente un critère d&#39;évaluation du comportement différent. Alors que les mouches sédation ont perdu leur bon réflexe, la sédation nécessite une plus grande exposition à l&#39;alcool. Comportemental, la sédation peut être caractérisé par l&#39;absence totale de l&#39;activité motrice apparente avec des mouches restant immobile dans le flacon après le cabinet d&#39;aa robinet dans le flacon. Pour la sédation, compter le nombre de mouches qui restent immobiles sans jambe en agitant après la livraison d&#39;un robinet cabinet du flacon. En outre, le flacon peut être roulé côté à l&#39;autre afin de déterminer si les mouches individuels conservent leur réflexe saisissant. 4. Analyse des données <ol><li> Déterminer le pourcentage Lorr à chaque fois évaluée sur la base du nombre total de mouches dans chaque flacon. </li><li> différences Estimer entre les points ou les souches de temps circadiens par calculating du LORR de 50% pour chaque échantillon qui tombe à l&#39;intérieur de la partie linéaire de la courbe sigmoïde (voir figure 2 ci-dessous). </li><li> Autres statistiques: <ol><li> Si la comparaison entre les génotypes sont prévues, il est souhaitable d&#39;analyser tout le cours du temps en utilisant des mesures répétées ANOVAand pour déterminer la plage de points de temps que les différences sont significatives par tests post-hoc (Figure 3). Pour ces tests, nous préférons utiliser une valeur de 0,001. Ceci permet à des différences des temps d&#39;exposition individuelles à évaluer ainsi que les différences entre les génotypes à la pente de la courbe. </li><li> Les différences de sensibilité pour peuvent être déterminées pour des moments précis de l&#39;exposition à l&#39;alcool pour une réponse particulière tels que la sédation de la partie linéaire de la courbe (figure 4). </li><li> Les différences entre les souches ou les points de temps circadien peuvent être estimées en utilisant F-statistiques standards et des tests post-hoc. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les coûts de l&#39;abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme pour la société est énorme, tant en termes de coûts humains et économiques 29 30,31. Drosophile comme modèle propose un système rapide et souple pour examiner rapidement les réponses comportementales d&#39;un grand nombre d&#39;individus et en tant que tel a été largement utilisé à la fois pour la recherche et l&#39;alcool 5,7,32-34 circadien 35-37. Ici, nous avons décrit un protocole simple po...

Drosophila melanogaster démontrer réponses comportementales biphasique à l&#39;alcool 1 qui sont analogues aux réponses humaines à ce médicament 2,3. Lors de l&#39;exposition initiale à de faibles concentrations d&#39;alcool, les mouches augmentation de l&#39;activité locomotrice d&#39;exposition, remplacé par un manque de coordination motrice, la perte du contrôle postural et les réflexes de redressement (perte du réflexe de redressement: Lorr), et une sédation (absence complète de l&#39;activité du moteur en réponse à la stimulation mécanique) que l&#39;exposition à l&#39;alcool progresse 4-9. L&#39;horloge circadienne endogène est une forte modulateur de la sensibilité de l&#39;alcool et de la toxicité comme observé chez les souris, les rats 10,11 12, et les humains 13. Les avancées récentes dans la recherche drosophile ont montré l&#39;horloge circadienne module sensibilité aiguë à l&#39;alcool mais pas tolérance à l&#39;alcool 1. Les approches génétiques puissants disponibles chez la drosophile par des études de mutants et les manipulations transgéniques de l&#39;espaceet l&#39;expression des gènes temporelle fournir un système qui permet de rapides progrès dans l&#39;identification des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux comportements complexes. L&#39;utilisation de la drosophile comme un outil d&#39;enquête a permis des avancées importantes dans la compréhension de la neurobiologie de l&#39;alcool qui peuvent être traduits rapidement aux mammifères 14-16. Afin de faciliter la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l&#39;horloge circadienne module la sensibilité à l&#39;alcool et à mesurer de manière uniforme à travers les réponses comportementales points de temps circadiens, un protocole d&#39;administration de l&#39;alcool approprié pour une utilisation dans des conditions de faible lumière rouge est nécessaire. Pour la drosophile, l&#39;alcool peut être administré par une supplémentation alimentaire pour une exposition chronique ou de manière fiable grâce à l&#39;administration d&#39;alcool sous forme de vapeur pour des expositions aiguës. Ici, nous décrivons un protocole d&#39;administration d&#39;alcool approprié pour l&#39;évaluation de la modulation circadienne de la perte-de-réflexe (Lorr) 1 ainsi quesédation. Les mouches sont entraînés avec 12 h: 12 h cycles LD à température constante, puis transférés à un régime de lumière contrôlée pendant 2-5 jours en fonction de la question expérimentale. Les mouches sont exposés à la vapeur d&#39;éthanol dans un dispositif connu sous le nom la barre stabilisatrice. Dans ce dispositif, des quantités contrôlées d&#39;air sont à barboter dans l&#39;eau et l&#39;alcool; les vapeurs sont ensuite mélangés et dirigés dans un boîtier flacon les mouches. Toutes les 5 min vol sont marqués pour le nombre que ne parvient pas à afficher redressement réflexes ou sont devenus des sédatifs. Pourcentages Lorr pour chaque point de temps sont calculés et comparés entre les points de temps circadiens ou entre les souches de mouches. La simplicité et la fiabilité de la livraison d&#39;alcool en utilisant la livraison d&#39;alcool barre stabilisatrice combinée avec des options d&#39;analyse comportementale fournit un avantage significatif pour les expériences menées circadiens dans des conditions sombres.

<table><tbody><tr><td>Alcool 190 proof</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aérateur</td><td>Animalerie</td><td></td> locale <td>Nous utilisons Whisper 60</td></tr><tr><td>Tube en silicone 1/8"</td><td>VWR</td><td>408060-0030</td><td></td></tr><tr><td>120&deg ; Connecteur en Y</td><td>VWR</td><td>82017-256</td><td></td></tr><tr><td>Déconnexions rapides</td><td>VWR</td><td>46600-048</td><td></td></tr><tr><td>Colliers de serrage en plastique</td><td>Produits Bell-art</td><td>132250000</td><td>Soit ce dernier, soit le suivant</td></tr><tr><td>Régulateur d’air miniature</td><td>McMaster-Carr</td><td>8727K11</td><td>Ce dernier ou le précédent</td></tr><tr><td>Support de montage du régulateur d’air miniature</td><td>McMaster-Carr</td><td>9891K66</td><td></td></tr><tr><td>Débitmètre Gilmont taille 12</td><td>VWR</td><td>29895-242</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à outils</td><td>McMaster-Carr</td><td>1722A43</td><td>Pour tenir les débitmètres</td></tr><tr><td>Flacon</td><td>VWR</td><td>89092-722</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc à deux trous</td><td>VWR</td><td>59585-186</td><td>S’adapte aux flacons</td></tr><tr><td>Tubes en verre Pyrex de 5 mm</td><td>Trikinetics</td><td>PGT5x65</td><td>S’adapte le mieux au bouchon précédent</td></tr><tr><td>Ruban téflon</td><td>Quincaillerie</td><td></td><td>Pour obtenir un ajustement parfait dans les bouchons si nécessaire</td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc à deux trous</td><td>VWR</td><td>59582-122</td><td>Convient à nos bouteilles</td></tr><tr><td>Pipettes en verre jetables</td><td>VWR</td><td>53283-768</td><td>Coupé à longueur et plié par chauffage</td></tr><tr><td>Filet en nylon très fin</td><td>VWR</td><td>Diverses</td><td></td></tr><tr><td>ampoules de 15 watts</td><td>Quincaillerie</td><td></td><td>Feu</td></tr> <tr><td>rouge zénithalFiltres</td><td></td><td></td> de lumière de sécurité rouge photographique <td>Lumière rouge zénithière</td></tr><tr><td>Mini lampes de poche avec filtres rouges</td><td>Mag-light</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la barre stabilisatrice: administration de l&#39;alcool à mouches

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) sont un modèle établi pour la recherche de l&#39;alcool et de la biologie circadienne. Récemment, nous avons montré que l&#39;horloge circadienne module la sensibilité à l&#39;alcool, mais pas la formation de la tolérance. Ici, nous décrivons notre protocole en détail. L&#39;alcool est administré à vol utilisant la barre stabilisatrice. Dans cette configuration, la vapeur d&#39;alcool saturé est mélangé avec l&#39;air humidifié dans des proportions fixes, et administré à vol dans quatre tubes simultanément. Les mouches sont élevées dans des conditions normalisées de manière à minimiser la variation entre les répétitions. Trois jours anciens mouches de différents génotypes ou de traitements sont utilisés pour les expériences, de préférence par vol de deux points différents dans le temps (par exemple, CT 5 et CT 17) de faire des comparaisons directes possible correspondant. Pendant l&#39;expérience, les mouches sont exposés pendant 1 heure pour le pourcentage prédéterminé de la vapeur d&#39;alcool et le nombre de mouches qui présentent la perte du réflexe de redressement (Lorr) ou sedation sont comptées toutes les 5 min. Les données peuvent être analysées selon trois approches statistiques différentes. La première consiste à déterminer l&#39;heure à laquelle 50% des mouches ont perdu leur réflexe de redressement et en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) pour déterminer s&#39;il existe des différences significatives entre les points dans le temps. Le second est de déterminer le pourcentage des mouches qui montrent Lorr après un certain nombre de minutes, suivie d&#39;une analyse de variance. La dernière méthode est d&#39;analyser l&#39;ensemble des séries chronologiques en utilisant les statistiques multivariées. Le protocole peut également être utilisé pour des expériences ou des comparaisons non circadiens entre les génotypes.

Modulation circadienne de l&#39;alcool Sensibilité à l&#39;aide de 50% Lorr comme un marqueur. Un exemple représentatif montrant modulation circadienne de la sensibilité de l&#39;alcool au cours de la journée est présenté à la figure 2. Lorr a été mesurée à six points dans le temps au cours de la 2 e journée de DD à Canton-S et les 50% Lorr a été déterminée pour chaque point de temps. L&#39;analyse a montré un effet significatif du moment de la journée (ANOVA: F <...

Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l&#39;alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l&#39;alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d&#39;autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.

La barre stabilisatrice: Administration de l&#39;alcool à mouches

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les comportements induits par l'alcool chez Drosophila, en utilisant un dispositif peu coûteux et facile à monter, particulièrement adapté à la recherche en milieu universitaire ou aux chercheurs nouveaux dans le domaine des études circadiennes. Cela est réalisé en assemblant d'abord la barre à mouches, permettant des comparaisons simultanées de plusieurs groupes de mouches.La prochaine étape de la procédure consiste à cultiver des drosophiles selon des cycles lumineux et obscurs précisés, puis à collecter des mouches âgées de manière comparable pour l'expérience. Ensuite, les mouches sont exposées à des concentrations définies de vapeur d'alcool et les données sont recueillies. En fin de compte, la mesure de la perte du réflexe d'écriture ou de la sédation peut révéler des différences de sensibilité à l'alcool entre les groupes, qu'elles soient liées à l'heure de la journée ou à la génétique.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'observation sont difficiles à apprendre en raison des difficultés liées à l'observation du comportement et de la lumière rouge faible, ainsi que de la détermination des vols ayant perdu leur réflexe d'écriture et de ceux qui ne l'ont pas perdu. Assemblez d'abord la barre à mouches. Commencez par monter le flux d'air.Reliez un court morceau de tube en silicone souple à une prise d'air du bâtiment ou à un aérateur pour aquarium afin de fournir un flux d'air. Divisez le flux d'air à l'aide d'un raccord en Y. Connectez la première branche à un régulateur.Il contrôlera la quantité totale d'air circulant dans le système. Connectez la deuxième branche à un raccord rapide. Cela permettra d'interrompre le flux d'air selon les besoins, sans affecter le débit d'air calibré.Ajoutez un connecteur en Y et reliez chaque tube ramifié à un régulateur de débit d'air. Ensuite, reliez chaque régulateur à un débitmètre. Sectionnez maintenant des pipettes en verre de un millilitre et formez un angle droit dans chaque section.Ces éléments serviront de tubes rigides coudés dans le montage. Insérez la pipette en verre droite destinée à l'entrée d'air à travers un trou et prolongez-la dans le liquide jusqu'à un centimètre au-dessus du fond. Insérez un tronçon coudé en verre à travers l'autre trou jusqu'à ce qu'il pénètre juste dans la bouteille.Utilisez ces sorties pour réunir le flux d'air de chaque bouteille à un raccord en Y. À l’aide de tubulures flexibles, reliez les débitmètres à la section droite d’une pipette. Ceux-ci serviront d’entrées d’air dans les deux bouteilles de solution.Eau ou alcool, maintenir les deux flacons de solution dans un bain-marie réglé à deux degrés au-dessus de la température ambiante. Boucher les flacons avec des bouchons en caoutchouc munis de deux orifices équipés de tubulures en silicone. Relier l'autre extrémité du tube en Y à un flacon doté d'un bouchon en caoutchouc à deux trous.Le flux d'air provenant de ce flacon de mélange acheminera de l'alcool et de l'eau vaporisés vers les vials d'observation. Diviser le flux d'air sortant du flacon de mélange deux ou trois fois afin d'obtenir quatre ou huit flux d'air plus petits, un pour chaque vial d'observation.Continuer d'utiliser du tube en silicone. Les vials d'observation sont des vials pour mouches vides, scellés avec un bouchon en caoutchouc à deux trous, un pour l'entrée et l'autre pour la sortie de la vapeur d'alcool. Des tubes en verre s'adaptent aux trous du bouchon.Couvrez les extrémités du tube en verre avec un filet. Maintenez le filet en place à l’aide d’un petit morceau de tube en plastique souple. Insérez ce tube dans le premier trou jusqu’à ce qu’il s’étende sur environ la moitié de la longueur du flacon.Si nécessaire, utilisez du ruban téflon pour obtenir un ajustement étanche. Insérez le deuxième tube en verre muni de la mousseline jusqu'à ce qu'il soit aligné avec le bord intérieur du bouchon en caoutchouc. Mélangez les fractions appropriées des deux flux d'air traversant de l'alcool ou de l'eau par barbotage.Surveillez continuellement la pression d'air et effectuez les ajustements nécessaires pour maintenir le mélange souhaité d'alcool et de vapeur d'eau dans la bouteille de mélange. Pour ce type d'expérience, veillez toujours à ce que la pièce soit suffisamment ventilée. Pour minimiser les variations entre les réplicas, une attention maximale doit être portée aux conditions d'élevage des mouches.Les mouches doivent être élevées dans des conditions de faible densité avec un synchronisme très précis afin que les mouches de même âge et du même groupe puissent être comparées entre elles. Approcher des mouches au crépuscule. Récolter les animaux fraîchement éclos et les conserver pendant 24 heures dans des flacons de maintien contenant une petite quantité de milieu riche en agar, et ce, simultanément.Le jour suivant, répartir les mouches collectées en cohortes d'environ 30 mouches à l'aide d'un aspirateur et transférer les cohortes dans des flacons frais afin de tester la modulation circadienne du comportement. Préparer suffisamment de cohortes pour tester chaque condition à six points temporels régulièrement espacés au cours de la journée de test afin d'évaluer le comportement de modulation circadienne. Maintenir également les mouches en obscurité constante à 25 degrés Celsius pendant deux jours avant le test.Indépendamment du plan expérimental, transférez les mouches dans la salle d'expérimentation comportementale, éclairée uniquement par une lumière rouge tamisée, au moins une heure avant le test comportemental. Réalisez les expériences sous lumière rouge tamisée afin qu'une stimulation lumineuse ne vienne pas fausser les résultats. Avant de commencer l'expérience, faites circuler de l'air dans le système pendant au moins 10 minutes et étalonnez les débits d'air.Sous les flacons d’observation. Placer un morceau de papier blanc afin d’améliorer la visibilité des mouches grâce à un contraste accru. Une fois le débit d’air stabilisé, déconnecter le raccord rapide et charger un groupe de 30 mouches dans chaque flacon d’observation.Pendant chaque essai sur la barre à mouches, testez chaque condition expérimentale. Cela augmentera la robustesse de l'expérience et minimisera l'impact des variations quotidiennes. Une fois que tous les flacons d'observation sont chargés, reconnectez le flux d'air et démarrez les minuteries.Utilisez un minuteur pour suivre le temps total d'exposition à l'alcool et l'autre pour compter les intervalles de cinq minutes tout au long de l'essai. Surveillez les débits d'air et effectuez les ajustements nécessaires afin qu'ils restent constants. En général, les débits d'air se stabilisent toutes les cinq minutes à l'aide d'une lampe à lumière rouge.Comptez le nombre de mouches ayant perdu leur réflexe d'écriture. Maintenez la lampe à au moins 30 centimètres des flacons. Donnez une tape ferme sur le flacon et comptez combien de mouches ne parviennent pas à s'écrire en environ quatre secondes.Ces mouches peuvent encore bouger leurs pattes et leurs ailes, mais elles ne seront pas capables de se redresser. Si la mouche n'effectue aucun mouvement des membres, elle est complètement sédatée. Cela peut être noté comme un critère différent de l'absence de réflexe d'écriture.La session durera environ une heure ; à la fin, comptez le nombre total de mouches dans chaque fichier en utilisant le protocole décrit. Une modulation circadienne de la sensibilité à l'alcool a été mesurée. L'absence de réflexe d'écriture a été mesurée à six points temporels au cours de la deuxième journée d'obscurité chez Canton S ; l'heure de la journée a eu un effet significatif sur le temps.La moitié des mouches n'ont pas réussi à s'immobiliser. Le pourcentage de mouches des cantons sédatées après 40 minutes avec de la vapeur d'alcool à 30 % a été mesuré au cinquième jour subjectif CT et à la nuit CT 17.Il a été observé qu'un nombre significativement moindre de mouches étaient sédatées pendant la journée subjective par rapport à la nuit. L'analyse d'une série chronologique a mis en évidence des différences au niveau du réflexe d'écriture et de la sédation lorsque les mouches Canton s ont été comparées à celles portant la mutation white 1 1 1 8. Dans un fond génétique Canton S, les mouches white 1 1 1 8 présentaient un meilleur réflexe d'écriture en réponse à la vapeur d'éthanol que les Canton S. Des différences entre les mutants white 1 1 1 8 et les mouches de type sauvage ont également été observées concernant le taux de sédation.La différence est très probablement due aux niveaux modifiés d'ennemis biogéniques associés à la mutation white 1 1 1 8. Il est donc nécessaire de contrôler les réponses comportementales liées à la mutation white 1 1 1 8, présente dans de nombreuses lignées transgéniques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'administrer de l'alcool aux mouches à l'aide du fly barn.Il est essentiel que les mouches soient collectées de manière méthodique et que les observations en lumière rouge tamisée soient autant que possible standardisées.

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Un test simple pour mesurer les effets sédatifs de l'éthanol...

Une façon simple de mesurer la sensibilité d&#39;éthanol dans les mouches

Cette vidéo décrit comment effectuer une injection de mouches adultes vivantes et comprend un exemple de protocole dans lequel des particules marquées et du bleu de trypan sont injectés dans l’abdomen des mouches pour doser la phagocytose.

Injection de mouches drosophiles adultes : méthode d’administration d’un composé ou d’une étiquette

Cette vidéo démontre la nano-injection de suspension bactérienne dans la cavité du corps de la mouche, entraînant une multiplication bactérienne et une infection. La réponse immunitaire de la mouche élimine certaines bactéries, tandis que d'autres échappent à l'élimination immunitaire et survivent à l'intérieur de l'hôte, provoquant une infection.

Infecter des mouches avec une suspension bactérienne à l’aide d’un nano-injecteur

Cette vidéo montre une technique pour infecter la drosophile en introduisant une bactérie pathogène directement dans sa cavité corporelle. Cette méthode contourne les barrières épithéliales et d’autres mécanismes de défense passive, permettant l’induction d’une infection systémique. Au moment de l’infection, la réponse immunitaire qui en résulte est évaluée en surveillant la mortalité des mouches et en effectuant des tests en aval.

Une technique de piqûre septique pour introduire une infection bactérienne systémique chez les mouches

Des tests simples pour mesurer la sensibilité à l’éthanol et la tolérance rapide chez la drosophile facilitent l’utilisation de cet organisme modèle pour étudier ces comportements importants liés à l’éthanol. Ici, un test relativement simple et évolutif pour mesurer la sensibilité à l’éthanol et la tolérance rapide chez les mouches est décrit.

Un, test de comportement évolutives et économiques pour mesurer l&#39;éthanol sédation sensibilité et la tolérance rapide dans<em&gt; Drosophila</em

Décrit ici est l'utilisation de plusieurs outils faits maison pour transférer, refroidir et tuer d'adultes Drosophila, ainsi que pour nettoyer les flacons de culture du verre et de recueillir des œufs. Ces outils sont faciles à fabriquer et sont plutôt efficaces dans la manipulation de La Drosophila.

Outils faits maison simples pour manipuler les mouches des fruits—Drosophila melanogaster

Les méthodes actuelles pour mesurer la sensibilité à l’alcool à Drosophila sont conçues pour tester des groupes de mouches. Nous présentons un simple, faible coût, l’essai à haut débit pour évaluer la sensibilité à la sédation de l’alcool dans un grand nombre de mouches simples. La méthode ne nécessite pas d’outils spécialisés et peut être effectuée en laboratoire à l’aide de matériaux communs.

Méthode à haut débit pour mesurer le temps de sédation de l’alcool du mélanogaster individuel de Drosophila

L’essai Flypub mesure les comportements que la mouche des fruits Drosophila melanogaster affiche sous l’influence de l’éthanol. L’essai peut être facilement maîtrisé par des expérimentateurs à tous les niveaux et appliqué à divers stimuli vaporisés, facilitant l’abus de substances et les études de toxicomanie.

Flypub étudier l’éthanol induit la désinhibition comportementale et la sensibilisation

La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) est largement utilisée pour la recherche biologique et toxicologique. Pour étendre l’utilité des mouches, nous avons développé un instrument, le réseau d’anesthésie en série, qui expose simultanément plusieurs échantillons de mouches à des anesthésiques généraux volatils (AGV), ce qui permet d’étudier les effets collatéraux (toxiques et protecteurs) des VGA.

Le réseau d’anesthésie en série pour l’étude à haut débit d’agents volatils utilisant Drosophila melanogaster

Cet article décrit l’entretien en laboratoire (y compris l’accouplement et l’alimentation) de la mouche diptère inférieur Bradysia (Sciara) coprophila.

Maintenance en laboratoire de la mouche des diptères inférieurs Bradysia (Sciara) coprophila : un organisme modèle nouveau/ancien émergent

Apprenez à mesurer les comportements induits par l'alcool chez Drosophila avec une barre stabilisatrice simple. Cette méthode évalue la sensibilité à l'alcool selon les rythmes circadiens et la génétique.

La barre stabilisatrice: Administration de l'alcool à mouches

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