La stimulation mécanique induite par le calcium propagation des ondes dans des monocouches de cellules: l'exemple de bovins cellules endothéliales de la cornée

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier la communication intercellulaire via les jonctions communicantes et les canaux HEMI en quantifiant la propagation de l'onde calcique intercellulaire induite par une stimulation mécanique dans des monocouches de cellules endothéliales cornéennes primaires. Cette étude est réalisée en isolant tout d'abord les cellules endothéliales cornéennes primaires à partir d'yeux de bovin frais. Dans un deuxième temps, deux à trois jours après leur semis dans des lamelles-chambres, la monocouche confluente de cellules est chargée avec le colorant fluorescent sensible au calcium flu O 4:00 AM. Ensuite, nous appliquons un stimulus mécanique contrôlé et localisé sur une seule cellule de la monocouche afin d'induire une onde calcique intercellulaire, qui est visualisée au microscope confocal.

Les résultats montrent la propagation de l'onde calcique intercellulaire. L'inhibition des canaux jonctionnels et des canaux HEMI est finalement utilisée pour élucider les propriétés et la régulation des différentes connexines et pannexines, ainsi que des isoformes formant les canaux jonctionnels et les canaux HEMI. Le principal avantage de la propagation de l'onde calcique intercellulaire induite par stimulation mécanique est qu'elle fournit une méthode simple et fiable pour examiner la contribution et les propriétés des canaux de connexion et des canaux axonaux de manière non invasive.

En outre, la méthode repose sur les molécules et cascades de signalisation physiologiques présentes dans les systèmes cellulaires étudiés. Enfin, elle est facilement adaptable à divers systèmes cellulaires, notamment les cellules primaires et les modèles cellulaires exprimant de façon ectopique certaines isoformes de connexion ou de PanIN. Cette méthode peut fournir des informations sur la fonction et la régulation dynamique des canaux jonctionnels à base de connexion et de PanIN ainsi que des canaux HEMI, grâce à l'inhibition par ARNsi des connexines ou des PanIN endogènes selon leurs isoformes, et à l'utilisation d'inhibiteurs sélectifs des canaux jonctionnels et des canaux HEMI.

Ce système n'est certainement pas limité aux deux types de cellules endothéliales cornéennes. Il peut être adapté à pratiquement n'importe quel type cellulaire ainsi qu'à des tissus plus complexes. Cette procédure utilise un œil frais énucléé provenant d'une vache âgée de moins de 18 mois et prélevé moins de cinq minutes après le décès.

Cet échantillon a été transporté au laboratoire dans une solution saline équilibrée d'Earl contenant une solution d'iode à 1 %, à quatre degrés Celsius. Transférez d'abord l'œil dans une boîte de Pétri de 100 millimètres par 20 millimètres. Ensuite, rincez l'œil avec de la EBSS contenant de l'iode à 1 %.

Ensuite, stérilisez-le avec une solution contenant 70 % d'éthanol à partir de ce moment. Travaillez dans une hotte stérile. Disséquez soigneusement la cornée de l'œil et placez-la dans une boîte de Pétri de 35 millimètres par 10 millimètres contenant du EBSS, avec la couche de cellules épithéliales orientée vers le haut.

Retirez soigneusement tout tissu irien restant encore attaché à la cornée. Si nécessaire, transférez la cornée dans un autre plat contenant du EBSS, avec la couche des cellules endothéliales orientée vers le haut, puis rincez deux fois avec du EBSS. Ensuite, placez la cornée avec la couche endothéliale orientée vers le haut dans un creuset en forme d'entonnoir et recouvrez-la de milieu de croissance.

Pour rincer, retirez le milieu à l’aide d’une pipette aspirante. Appliquez 300 microlitres de solution de tripsine à 0,5 gramme par litre sur la couche endothéliale de la cornée. Placez le sablier contenant la cornée dans une boîte de Pétri couverte et transférez-le dans l’incubateur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après avoir récupéré le sablier, gratter délicatement les cellules endothéliales de la cornée à l’aide d’une pipette Pasteur en verre courbée et polie à la flamme. Aspirer la solution contenant les cellules endothéliales et l’ajouter à un flacon de culture de 25 centimètres carrés contenant quatre millilitres de milieu de culture. Ensuite, appliquer 300 microlitres de milieu de croissance sur la cornée.

Répétez le grattage et ajoutez la solution contenant les cellules endothéliales au flacon de culture. Répétez cette étape une fois de plus, puis placez les flacons de culture contenant les cellules endothéliales cornéennes dans le milieu de croissance, dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Deux jours plus tard, ajoutez six millilitres de milieu de culture et renouvelez le milieu de croissance tous les deux jours.

Les cellules doivent être confluentes entre sept et dix jours après leur isolement jusqu'au passage. Commencez par aspirer le milieu de culture, puis rincez deux fois avec du EBSS. Ajoutez ensuite deux millilitres de solution trips aux cellules et placez le flacon dans l'incubateur pendant trois à quatre minutes.

Ensuite, ajoutez 12 millilitres de milieu de croissance et pipetez le milieu trois fois de haut en bas pour disperser les cellules. Puis comptez les cellules à l’aide d’un hémo-cytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Ajoutez 165 000 cellules dans des lames de culture à deux puits.

Ensuite, préparez des flacons de culture carrés de 75 centimètres carrés pour un nouveau passage à une densité de 6 250 cellules par centimètre carré, ajoutez du milieu de culture frais jusqu'à un volume total de 25 millilitres, puis placez les flacons et les lamelles-chambres dans l'incubateur. Le milieu est renouvelé tous les deux jours et la confluence du feuillet cellulaire doit être atteinte en trois à quatre jours. Chargez d'abord les cellules dans la lamelle-chambre avec 10 micromolaire de fluo-4 AM dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation douce, pendant que les cellules s'incubent dans le fluo-4 AM. Couplez une micropipette en verre ayant un diamètre de pointe inférieur à un micromètre à un nanopositionneur piézoélectrique, puis reliez-le à un amplificateur monté sur un micromanipulateur.

Régler la tension du nano-positionneur entre 0,2 et 1,5 volt. Éliminer la solution de 4:00 AM. Laver ensuite les cellules cinq fois avec du chlorure de sodium tamponné au phosphate, puis incuber les cellules avec du PBS pendant au moins cinq minutes à température ambiante avant la mesure.

Excitez à 488 nanomètres à l'aide d'un laser à argon et utilisez un séparateur de faisceau HFT 48. Collectez l'émission fluorescente à 530 nanomètres à l'aide d'un filtre d'émission passe-long, LP 505, avec le diaphragme réglé au minimum ; ici, un objectif à immersion huile de 40 x est utilisé. Placez la lamelle-chambre sur la platine d'un microscope confocal et repérez une zone de cellules confluentes.

Ensuite, déplacez le micromanipulateur afin de positionner la micropipette en verre de manière à ce qu'elle touche la membrane cellulaire selon un angle de 45 degrés. Utilisez le micromanipulateur pour toucher brièvement moins de 1 % de la membrane de la cellule unique avec la micropipette en verre et provoquer une stimulation mécanique d'une seconde. Puis mesurez les variations spatiales de la concentration en ions calcium après la stimulation mécanique, à l'aide d'un microscope confocal pour acquérir et stocker les images.

Enfin, dessinez une région d’intérêt polygonale pour définir la surface totale des cellules réactives à l’aide du logiciel du microscope confocal. Des transitoires calciques induits par une stimulation mécanique sont montrés à différents points temporels dans des cellules endothéliales cornéennes bovines en conditions contrôles, à l’aide d’images représentatives de fluorescence pseudo-colorées ; les intensités de fluorescence avant la stimulation sont représentées sur la première image. La flèche blanche sur la deuxième image identifie la cellule stimulée mécaniquement.

L'onde calcique se propage à six couches cellulaires voisines, couvrant une zone totale de cellules atteintes par l'onde, donnant une aire active de 62 870 micromètres carrés. Le graphique en courbes montre l'évolution temporelle de la valeur de fluorescence normalisée ou FN dans la cellule stimulée mécaniquement, étiquetée ms, et la valeur moyenne de FN dans les couches cellulaires voisines une à cinq, indiquées sur le graphique comme MB1 à MB5. Ces images montrent des changements significatifs dans la propagation des ondes calciques intercellulaires après traitement par des nucléotides exogènes (graphique de gauche) et après traitement par des inhibiteurs de l'ectonucléotidase (graphique de droite). Plus précisément, le graphique de gauche montre une diminution significative de l'aire active après traitement de cellules endothéliales cornéennes bovines avec les exogènes Aras Aase 6 et Aase 7, qui hydrolysent l'ATP et l'ADP, inhibant ainsi la voie de communication intercellulaire paracrines.

L'astérisque indique une valeur P inférieure à 0,001 en présence par rapport à l'absence d'ace. Le graphique de droite montre une augmentation significative de la zone active après traitement des BCEC avec un inhibiteur sélectif des ectonucléotidases, l'A RL 6 7 1 56, renforçant ainsi la voie de communication intercellulaire péricrine. L'astérisque indique une valeur P inférieure à 0,001 en présence par rapport à l'absence d'a RL Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en cinq à dix minutes pour une expérience dans une condition donnée, lorsqu'elle est correctement effectuée. La réalisation d'une série complète d'expériences permettant de comparer différentes conditions prend une journée pour établir des conclusions statistiques. Des expériences indépendantes réalisées à différents jours et à partir de différents lots de cellules isolées doivent être utilisées.

La mesure et la quantification de la propagation des ondes calciques intracellulaires permettent l'identification et la caractérisation de la régulation biologique cellulaire de différentes connexines et d'isoformes de canaux jonctionnels gap et de canaux HEMI. Je tiens également à souligner que cette méthode ne doit pas être utilisée isolément, mais qu'elle doit être complétée par d'autres approches moléculaires et fonctionnelles, allant du transfert de colorant à la libération de TP en passant par l'électrophysiologie.