Name: Lacquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Apprenez à capturer des films de fluorescence en time-lapse de levures en croissance et à analyser les séries temporelles de cellules uniques. Cette méthode permet d'étudier la dynamique transcriptionnelle au cours du cycle cellulaire.

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Nous remercions Emily Jackson, Joshua Zeidman, et Nicholas Wren pour les commentaires sur le logiciel. Ce travail a été financé par GM95733 (au Mexique), BBBE 103316 et fonds de démarrage du MIT (à NM).

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le protocole ci-dessus décrit une méthode simple pour obtenir et analyser des données de séries chronologiques de fluorescence avec une expérience limitée en microfluidique ou dans le développement de logiciels. Il permet d&#39;obtenir time-lapse films de fluorescence des cellules de levure simples; extraire la taille des cellules pertinentes et les mesures d&#39;expression; suivi curé et missions de la lignée, et analyser le comportement des cellules entières dans le temps en utilisant un dispositif de culture microflu...

Analyse unicellulaire de l&#39;expression génique a permis de mieux comprendre de nombreux aspects de la régulation des gènes. Instantanés statiques d&#39;expression rapporteur fluorescent par cytométrie en flux ou microscopie fournissent des informations utiles sur la distribution de l&#39;expression seule cellule, mais n&#39;ont pas l&#39;histoire et l&#39;évolution des données de séries chronologiques nécessaires pour informer directement la dynamique de l&#39;expression des gènes. Microscopie time-lapse fluorescence présente un moyen d&#39;obtenir deux mesures unicellulaires et leur histoire. Diverses techniques expérimentales et analytiques ont été développées afin d&#39;obtenir et de quantifier les films d&#39;expression rapporteur fluorescent, conférant ainsi un aperçu des caractéristiques de régulation des gènes (cf. 1 pour une revue) tels que la variation de cellule de la cellule 2,3, la formation de persister bactérienne 4, transcription initiation et d&#39;élongation 5, transcription éclatement 6,7, la dépendance du cycle cellulaire 8,9 et héritabilité 10. Cependant, obtaining série temporelle de fluorescence unicellulaire qualité implique des difficultés techniques importantes dans la culture d&#39;une monocouche de cellules dans un environnement contrôlable dans la quantification et à haut débit des films de fluorescence acquises. Ici, nous décrivons une procédure pour obtenir et analyser des films de fluorescence de S. cerevisiae avec aucune expérience requise dans la fabrication du dispositif de culture cellulaire ou dans le développement de logiciels (Figure 1). Tout d&#39;abord, nous détaillons un protocole d&#39;exemple pour produire des films de séries chronologiques de fluorescence pour levure bourgeonnante exprimant un ou plusieurs rapporteurs fluorescents. Bien que des chambres de culture microfluidiques personnalisés ont été construits et utilisés avec succès précédemment 11-13, nous utilisons un dispositif microfluidique disponible dans le commerce à partir de CellAsic (Hayward, CA). Le système confine à la croissance des cellules de la monocouche et permet un contrôle continu du milieu de perfusion. Le protocole de microscopie que nous présentons est un moyen simple d&#39;obtenir Déessfilms rence de levure bourgeonnante, mais tout protocole modifié expérimental (un dispositif de culture personnalisée, les conditions de médias alternatifs, etc.) fournissant des données de films similaires fluorescence de cellules de levure simples peuvent être substitués. Ensuite, nous présentons l&#39;analyse des films en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) basée sur logiciel dans MATLAB (The MathWorks, Natick, MA), surnommé le GUI pour l&#39;analyse rapide des séries chronologiques Fluorescence (greffes), pour extraire des données de séries chronologiques pour des cellules individuelles. GREFFES a des caractéristiques similaires à la polyvalente, logiciel open-source paquet Cell-ID 14 dans la segmentation et le suivi des cellules et dans l&#39;extraction de l&#39;intensité de fluorescence et de l&#39;information géométrique. Toutefois, les greffes fournit d&#39;importantes fonctionnalités supplémentaires. Tout d&#39;abord, il offre une édition interactive facile de segmentation et le suivi des résultats afin de vérifier l&#39;exactitude des données, plutôt que de simplement gating statistique des traces de la région aberrantes après analyse. En outre, elle étend l&#39;analyse aux automatically désigné lignée et les points du cycle cellulaire d&#39;intérêt de la levure bourgeonnante. Déterminer le moment où mère et fille se divisent pour former deux régions de cellules indépendantes est cruciale pour déterminer les mesures à travers le cycle cellulaire 8 cellules entières (y compris toute mère bourgeon connecté). La suite se compose de trois modules pour accomplir ces tâches. Les premières régions cellulaires segments basé sur le contraste entre les images de champ lumineux ciblés et non ciblés, et permet à l&#39;utilisateur de définir et de tester visuellement les paramètres de segmentation. La seconde pistes (. Utilisant Blair et la mise en œuvre de la MATLAB Crocker et al IDL routine de Dufresne, disponible sur: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) et les mesures régions cellulaires à travers le temps; attribue automatiquement lignées et permet une inspection visuelle et la correction d&#39;erreur. Une interface graphique tracé simple est inclus aux propriétés unicellulaires requête. Le troisième module attribue bourgeon émergence et la division times, et délivre des données de séries chronologiques de cellules entières ainsi que leurs dérivées premières et secondes de temps (tel que discuté dans 9). Le module d&#39;analyse fournit en sortie les données dans un fichier de texte délimité par des espaces pour l&#39;étude ultérieure dans le logiciel de statistique de choix. Ainsi, le forfait permet à l&#39;utilisateur d&#39;extraire des données de séries chronologiques de haute qualité par le biais d&#39;une interface graphique. Nous avons utilisé cette méthode pour estimer les taux de transcription en temps réel dans des cellules de levure bourgeonnante simples en fonction du cycle cellulaire 9. Alors que les modules ont été optimisés pour levure bourgeonnante, les paramètres ou, le cas échéant, le code librement disponible peut être adapté à d&#39;autres organismes et les types d&#39;images. Segmentation, le suivi, et la lignée des algorithmes d&#39;affectation peuvent être spécifiques à types d&#39;imagerie affecté et l&#39;organisme en question. Les algorithmes existants pourraient être remplacés, mais conservent l&#39;interface graphique qui permet une inspection visuelle conviviale et la correction des erreurs de segmentation et de suivi qui invariablement occupantsr avec n&#39;importe quel algorithme.

<table><tbody><tr><td>Y04C Plaque de perfusion de levure</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Plateforme de perfusion microfluidique</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Huile Objectif DIC</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Caméra Cascade II EMCCD</td><td>Photométrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampe à arc aux halogénures métalliques Lumen 200</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre dichroïque triple-bandelle et ensemble de filtres d’excitation et d’émission</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>Utilisé pour YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>Contrôleur MAC 5000 et roues à filtres</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>La version 64 bits gère mieux les fichiers de données volumineux que la version 32 bits</td></tr></tbody></table>

l&#39;acquisition de fluorescence time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Microscopie time-lapse fluorescence est devenu un outil puissant dans l&#39;étude de nombreux processus biologiques au niveau d&#39;une seule cellule. En particulier, les films dépeignant la dépendance temporelle de l&#39;expression des gènes permettent de mieux comprendre la dynamique de sa réglementation, mais il ya beaucoup de défis techniques à obtenir et à analyser les films de fluorescence des cellules individuelles. Nous décrivons ici un protocole simple en utilisant un dispositif de culture microfluidique disponible dans le commerce pour produire ces données, et une interface graphique basée sur MATLAB utilisateur (GUI) basée sur logiciel pour quantifier les images de fluorescence. Les segments des logiciels et des cellules de pistes, permet à l&#39;utilisateur de vicaire visuellement erreurs dans les données, et attribue automatiquement lignage et des temps de division. L&#39;interface graphique analyse en outre la série temporelle afin de produire des traces de cellules entières, ainsi que leurs dérivées première et seconde de temps. Bien que le logiciel a été conçu pour S. cerevisiae, sa modularité et sa polyvalence devrait lui permettre de to servir de plate-forme pour l&#39;étude d&#39;autres types cellulaires avec quelques modifications.

Une expérience réalisée et analysée avec succès donnera série surtout à temps continu pour les cellules entières simples avec réalisme attribué apparition des bourgeons et des temps de division. À titre d&#39;exemple, nous avons réalisé le protocole ci-dessus avec une souche de levure haploïde exprimant une copie intégrée de la protéine fluorescente Cerulean (CFP) entraînée par le promoteur constitutif ADH1 d&#39;observer comment la croissance et l&#39;expression globale peuvent varier au fil du temps ...

Nous présentons un protocole simple d&#39;obtenir des films de microscopie par fluorescence de cellules de levure en croissance, et un logiciel GUI basée à extraire des données de séries chronologiques unicellulaires. L&#39;analyse comprend lignée automatisé et l&#39;affectation du temps de division intégrée à l&#39;inspection visuelle et la conservation manuelle de données à chenilles.

L&#39;acquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des films en fluorescence de cellules de levure individuelles en croissance et d'extraire des séries chronologiques d'expression des capteurs pour chaque cellule. Ceci est réalisé en cultivant d'abord une monocouche de cellules dans une chambre microfluidique. La deuxième étape consiste à effectuer une microscopie en fluorescence en prise de vue différée pour un ou plusieurs capteurs.Ensuite, les vidéos sont traitées à l'aide du logiciel graft afin de suivre et mesurer les cellules au fil du temps. La dernière étape consiste à analyser les mesures cellulaires et les attributions de lignage, puis à exporter les séries temporelles d'expression des capteurs pour chaque cellule entière. En définitive, une vitesse de transcription instantanée déduite des séries temporelles d'expression est utilisée pour illustrer les variations de la transcription au cours du cycle cellulaire ainsi qu'en réponse à des concentrations variables de facteurs de transcription.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation génique, telles que la rapidité avec laquelle différents promoteurs réagissent à l'ajout soudain ou à la suppression d'un facteur de transcription actif. Quelle est la variabilité de cette réponse au sein d'une population de cellules, et comment différentes caractéristiques cellulaires, notamment la morphologie et la phase du cycle cellulaire, influencent-elles cette réponse ? En outre, cette méthode permet d'explorer les effets de multiples ajouts et suppressions d'un facteur de transcription actif sur l'expression génique.Préparer des cellules de levure en croissance à l'état stationnaire dans un milieu riche en nutriments, à une densité appropriée pour être chargée dans le dispositif microfluidique, comme décrit dans le protocole en texte. Préparer ensuite une plaque de culture microfluidique Y zero quatre C de cell ASIC en rinçant les puits avec de l'eau stérile après avoir éliminé la solution de transport, en faisant circuler de l'eau à travers les puits un à six à six PSI pendant cinq minutes à l'aide du système de perfusion onyx afin de purger les canaux, puis en faisant circuler le liquide à partir du puit de chargement huit à six PSI pendant 10 secondes. Retirer l'eau de tous les puits et la remplacer par 250 microlitres de milieu SC dans les puits d'entrée, puits un à six, et 50 microlitres de la culture cellulaire préparée dans le puit de chargement cellulaire.Scellez le manifolde en onyx à la plaque avec le puits huit et commencez à amorcer les canaux et la chambre de culture en faisant circuler du fluide par les puits d'entrée un à six à une pression de six PSI pendant deux minutes. Ensuite, faites circuler uniquement le milieu de départ provenant du puits d'entrée correspondant pendant au moins cinq minutes. Maintenez un débit continu à six PSI jusqu'à l'étape au microscope : fixez la plaque sur le support de la platine à l'aide de ruban adhésif afin d'empêcher tout déplacement pendant l'expérience, ce qui améliorera le suivi cellulaire lors de l'analyse des données. Après avoir préparé le microscope conformément au protocole décrit dans le texte, déposez quelques gouttes de liquide à immersion sur l'objectif et fixez fermement le dispositif microfluidique.Sur la platine du microscope inversé, focalisez sur le tiers le plus à gauche de la première chambre de culture en utilisant l'un des marqueurs de position intégrés. Arrêtez l'écoulement provenant du puits d'entrée de milieu et celui provenant du puits de chargement des cellules, puits huit, à six PSI en impulsions de cinq secondes. Déplacez la platine pour examiner la chambre de culture à la recherche de cellules.Augmentez progressivement le temps d'écoulement et la pression jusqu'à l'obtention de la densité cellulaire souhaitée, mais évitez la surcharge et l'obstruction de la barrière la plus à gauche par laquelle le milieu frais pénètre dans la chambre. Commencez à faire circuler le milieu à partir du puits d'entrée contenant le milieu initial à six PSI. Dans Metamorph ou tout autre logiciel d'automatisation et de contrôle de microscopie.Configurer une acquisition multidimensionnelle afin de prendre plusieurs images à plusieurs positions de la platine au cours du temps. Définir le nombre de points temporels et l'intervalle entre ceux-ci. Ensuite, sélectionner plusieurs positions de la platine contenant environ 10 cellules chacune.Configurez l'acquisition de manière à ce que, pour chaque position de la platine et à chaque point temporel, le programme se concentre sur l'image en champ clair en lumière transmise en utilisant la méthode intégrée de mise au point automatique de Metamorph, en implémentant cette mise au point automatique comme un journal personnalisé exécuté au début de chaque position de la platine. Cette approche offre un meilleur contrôle de la précision de la mise au point. Réglez également le programme pour acquérir l'image en champ clair à plus un micron par rapport au plan focal, et pour acquérir une image en champ clair défocalisée à moins quatre microns par rapport au plan focal.Utilisez des journaux personnalisés pour modifier le focus selon les besoins entre les images. Enfin, configurez le programme. Acquérez une image en niveaux de gris pour chaque marqueur fluorescent au plan focal.Utiliser des paramètres optimisés pour une acquisition rapide avec un photoblanchiment minimal. Préparer le programme d'écoulement dans le logiciel de contrôle Onyx. Ensuite, démarrer simultanément le programme d'acquisition dans Metamorph et le programme d'écoulement dans le logiciel de contrôle Onyx.Exécutez le fichier M de formatage des données dans MATLAB pour ouvrir l'interface graphique utilisateur (GUI) de saisie des données. En haut, spécifiez ou parcourez le dossier contenant les fichiers d'image afin de définir le répertoire des données, puis utilisez l'interface graphique pour indiquer les types de données et les fichiers d'image enregistrés lors de l'expérience. Passez ensuite à la sélection des paramètres de segmentation décrits dans le protocole écrit.Le choix des paramètres appropriés pour la segmentation d'images en champ clair peut être difficile et a un effet significatif sur la qualité des données en série temporelle obtenues. Nous nous concentrons sur l'identification de toutes les régions cellulaires, en privilégiant une sur-segmentation plutôt qu'une sous-segmentation des régions. Lors de l'inspection visuelle des données, les régions sur-segmentées peuvent être fusionnées pour former des régions cellulaires complètes, mais les régions sous-segmentées ne peuvent pas être divisées par la suite.Définissez les différents paramètres de segmentation et testez la qualité de la segmentation en cliquant sur Test avec succès. Les régions segmentées apparaîtront en vert avec des bordures magenta. Assurez-vous d'utiliser le curseur pour vérifier plusieurs points temporels dans la vidéo lorsque la segmentation est satisfaisante.Sélectionnez « terminé » pour renvoyer les paramètres de segmentation à l'interface graphique des données formatées. Après avoir sélectionné les paramètres de couleur comme décrit dans le texte, appuyez sur le bouton de seuil automatique pour déterminer automatiquement le seuil. En utilisant la méthode de Tzu, l'image mettra en évidence les zones préservées au-dessus du seuil.Le seuil peut être ajusté manuellement à l'aide de la zone d'édition. Utilisez la barre de défilement pour confirmer que le seuil est approprié pour tous les points temporels. Une fois satisfait, appuyez sur terminé.Pour rétablir le seuil dans le format de données de l'interface graphique, appuyez sur Ajouter et Segmenter. Pour créer le masque de couleur, appuyez sur Formater les données afin de lire les fichiers d'image, traiter les données et créer un fichier dot mat dans le dossier spécifié. Ce fichier servira d'entrée pour l'interface graphique de traitement de la série temporelle.Exécutez le fichier M de la série chronologique du processus dans MATLAB pour ouvrir l'interface graphique de suivi. Après avoir ouvert l'interface, réglez d'abord la hauteur de la chambre. Celle-ci indique la hauteur de la chambre dans laquelle les cellules sont piégées.Il est utilisé comme contrainte pour approximer le volume cellulaire sous la forme d'un ellipsoïde 3D à partir des axes majeur et mineur de la région cellulaire. Ensuite, définissez les micromètres par pixel. Ce facteur de conversion permet d'étalonner la distance en pixels vers des micromètres dans les images, de sorte que la surface en coupe transversale et le volume puissent être calibrés respectivement en micromètres carrés et en micromètres cubes.Ensuite, utilisez le panneau des filtres pour définir les paramètres minimum et maximum afin d'éliminer les régions indésirables dans le masque. La surface correspond à la superficie de la région en pixels. L'ECC est le facteur d'excentricité, qui devient plus circulaire lorsque la valeur s'approche de zéro.Et SF est le facteur de forme, qui est d'autant plus circulaire que la valeur s'approche de un. Chargez les images dans le panneau d'entrée-sortie du fichier et sélectionnez le fichier de données dot mat produit par l'interface graphique de formatage des données. Le masque de région sera appliqué à chaque canal de couleur et un certain nombre de mesures différentes sont effectuées. Le fichier de données est ensuite enregistré après avoir sélectionné le paramètre de suivi des cellules, comme décrit dans le texte.Cliquez sur les cellules à suivre pour tracer les régions d'une image à l' suivante à l'aide des OID des régions afin d'attribuer des lignées aux bourgeons nouvellement apparus et pour enregistrer les données. Modifiez les paramètres dans les fenêtres contextuelles selon les besoins. Les lignées sont attribuées automatiquement en minimisant les distances entre les bourgeons présumés et les mères potentielles. Dans chaque image.Cliquez sur le bouton au-dessus du panneau d'informations de la cellule sélectionnée et corrigez les régions mal segmentées ainsi que les erreurs d'attribution d'identifiant ou de lignage à l'aide des différents outils graphiques ou des raccourcis clavier décrits dans le protocole textuel afin de bien curer les données. Fusionnez les régions sursegmentées, supprimez les régions qui ne capturent pas entièrement la cellule, et assurez-vous que les relations mère-bud sont correctement attribuées. Supprimez également les identifiants verts en fusionnant les régions.Fixer l'identifiant, attribuer la région à une cellule mère, ne pas attribuer de cellule mère ou supprimer la région. Étant donné que les données du bourgeon seront ajoutées à celles de la cellule mère lors de l'analyse finale, ne pas fusionner une région de bourgeon avec sa cellule mère.Inspecter visuellement les données de chaque image jusqu'au dernier moment d'intérêt. Il n'est pas nécessaire d'inspecter toute la série temporelle. Si les images ultérieures ne sont pas utilisées, veiller à enregistrer les modifications une fois que toutes les régions cellulaires ont été inspectées sur la durée d'intérêt ; les données pour tous les canaux de fluorescence et leurs variations dans le temps sont alors prêtes à être exportées.Effectuez une analyse de séries chronologiques pour étudier l'évolution temporelle des cellules entières. Calculez les informations relatives au cycle cellulaire et prenez les dérivées. Une fenêtre s'ouvrira, permettant de sélectionner les mesures d'intérêt et de saisir les paramètres d'analyse. Saisissez le dernier point temporel validé dans l'interface graphique.Les paramètres par défaut de lissage et d'attribution du cycle cellulaire fonctionnent bien pour les souches haploïdes et diploïdes observées par intervalles de cinq minutes, mais ils peuvent nécessiter des ajustements pour obtenir les meilleurs résultats. Une fois tous les paramètres définis, sélectionnez « analyser » pour exporter les données de séries chronologiques individuelles selon la procédure décrite dans le protocole. Une expérience correctement réalisée et analysée produira principalement des séries chronologiques continues pour des cellules entières individuelles, avec des temps d’apparition et de division attribués de manière réaliste, pour une souche de levure haloïde exprimant une copie intégrée de la protéine fluorescente Ian ou CFP sous le contrôle du promoteur constitutif d’un DH un. Les mesures de cellules entières au fil du temps ont été obtenues à partir de l’analyse des séries chronologiques.Les images en champ clair montrent la cellule mère segmentée en bleu et ses bourgeons en vert. Avec la cellule entière contiguë délimitée en rouge, une dépendance vis-à-vis du cycle cellulaire apparaît pour le volume et l'expression. Ici, les régions hachurées indiquent quand la cellule est en phase S, G2 ou M et possède un bourgeon ; le bourgeonnement commence à la transition G1/S, passant du blanc au gris.L'ombrage et la division cellulaire interviennent lors de la transition de M à G1, passant d'un ombrage gris à un ombrage blanc après la formation du bourgeon. Le volume total combiné augmente plus rapidement qu'auparavant, mais l'émergence coïncide avec une légère diminution de la concentration en protéines ou de l'intensité moyenne. L'augmentation de la protéine intégrée combinée s'accélère également après la formation du bourgeon, par comparaison avec la région de la cellule mère prise isolément.Ces résultats démontrent l'importance d'intégrer correctement les contributions de la bourgeon à la mesure de la cellule entière et soulignent la nécessité d'une attribution adéquate de la formation du bourgeon et du moment de la division. La série chronologique différenciée peut être utilisée pour calculer un niveau instantané relatif d'ARNm et un taux de transcription, qui augmentent tous deux également après le bourgeonnement, permettant ainsi de générer un temps stable. Les dérivées des séries chronologiques de mesures profitent également aux études cinétiques utilisant le système d'expression commutable décrit dans le protocole textuel.Une analyse de série temporelle montre quand le facteur de transcription est localisé dans le noyau et quand le gène cible commence et s'arrête. Les transcriptions illustrées ici sont des microphotographies provenant des quatre canaux d'acquisition indiqués pour une cellule possédant un activateur transcriptionnel PHO4-TetR couplé à une YFP commutable. L'activateur transcriptionnel se localise dans le noyau marqué par la RFP en réponse à une faible concentration de phosphate et induit l'expression d'un rapporteur CFP sous le contrôle d'un promoteur 7XTetO.Les variations du taux de transcription déduites dépendent de la localisation, en moyenne et au niveau individuel de chaque cellule. En suivant cette procédure, d'autres analyses des données temporelles multidimensionnelles au niveau de la cellule unique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment l'expression varie-t-elle dans la population au fil du temps ? Les effets des fluctuations extrinsèques sont-ils transmis sur plusieurs générations ?La cinétique d'activation des gènes change-t-elle lors de la réactivation ? Le cycle cellulaire joue-t-il un rôle, et bien d'autres questions nécessitant l'analyse de la croissance de l'expression génique et des trajectoires lignagères de cellules uniques ?

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