génie tissulaire d'un être humain 3D In vitro Système de tumeur de test

Méthodes pour créer des tissus tumoraux humains 3D comme systèmes d'essai sont décrits. Ces technologies sont basées sur un échafaudage décellularisé biologique vascularisé (BioVaSc), les cellules primaires humaines et d'une lignée cellulaire tumorale, qui peut être cultivée dans des conditions statiques ainsi que dans des conditions dynamiques dans un bioréacteur d'écoulement.

L’objectif global de cette procédure est de construire un système de test de tumeur 3D avec des cellules primaires sur un échafaudage biologique décellularisé. Pour ce faire, il faut d’abord préparer l’échafaudage à l’aide d’un processus de décellularisation dans lequel un segment al porcin est pompé avec une solution de décellularisation. La deuxième étape consiste à isoler des cellules humaines primaires à partir de la biopsie d’un patient à l’aide d’un protocole d’isolement standard.

Ensuite, mettez en place le système de test tumoral en ouvrant la sous-muqueuse tubulaire de l’intestin grêle d’un côté, en la fixant entre deux anneaux métalliques et en l’ensemenceant avec des cellules tumorales et des cellules stromales associées dans des densités cellulaires définies. La dernière étape consiste à cultiver la construction chargée de cellules dans une configuration appropriée dans des conditions statiques ou dynamiques. En fin de compte, la microscopie immunohistochimique est utilisée pour évaluer les caractéristiques de la croissance tumorale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les systèmes de test de tumeur TT est qu’avec cette méthode, il est possible de créer des modèles tissulaires 3D qui simulent les conditions in vivo d’une tumeur avec plus de précision que les modèles 2D courants. L’avantage de la culture dynamique est que les caractéristiques spécifiques des cellules sont maintenues. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie tumorale, telles que la façon dont les cellules cancéreuses forment des interactions entre les cellules et la matrice cellulaire dans un environnement 3D, ce qui aidera à élucider les processus liés au cancer tels que la progression tumorale et les métastases.

L’échafaudage vascularisé biologique ou biova utilisé dans ce système de test de tumeur est dérivé d’un segment de jaal porcin. Rincer le système vasculaire du segment porcin et la lumière intestinale avec du PBS par voie d’accès artériel canulée. Répétez l’opération jusqu’à ce qu’il soit complètement propre.

Préparez un réservoir en verre de 200 millimètres de diamètre avec quatre adaptateurs et connectez-les via des tubes en silicone à la pompe péristaltique. L’unité de contrôle de la pression peut être surveillée via un capteur de pression relié à un dôme jetable stérile. Remplissez les bouteilles du réservoir avec une solution de décellularisation ou de DZ.

Vérifiez que le système de tuyauterie ne contient pas de bulles d’air. Connectez la lumière intestinale avec des serre-câbles aux connecteurs en verre pour un flux luminal. Pompez 500 millilitres de solution DZ dans l’accès artériel rouge du système vasculaire.

Interrompez brièvement le processus de pompage toutes les 15 minutes pour extraire manuellement toute la lumière intestinale. Il est important de surveiller la pression de la solution tampon pendant le processus de décellularisation. La pression doit être comprise entre 80 et 100 millimètres de mercure calquée sur la pression artérielle naturelle.

Lavez le biova avec du PBS jusqu’à ce qu’il soit exempt de restes cellulaires et que la structure vasculaire soit complètement blanche. Commencez cette procédure en coupant la biopsie cutanée en bandes de deux à trois millimètres de largeur avec un scalpel et en les rinçant trois fois avec une solution de PBS. Après avoir incubé le tissu avec une solution disbe, utilisez deux pinces à épiler pour séparer l’épiderme du derme.

Transférez les deux séparément dans des boîtes de Pétri remplies de PBS pour isoler les cellules endothéliales microvasculaires dermiques primaires ou les bandelettes de rinçage du derme MV eecs Une fois avec l’ène, ajoutez 10 millilitres de solution EDTA aux bandes de derme et incubez à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Arrêtez la réaction enzymatique avec 1 % de FCS et transférez les bandelettes cutanées dans une boîte de Pétri remplie de vascu life. Grattez chaque bande avec le scalpel huit fois de chaque côté, en ajoutant un peu de pression pour produire une suspension cellulaire.

Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire et réusez, suspendez la pastille cellulaire avec vascu life. Pour isoler les fibroblastes. Tout d’abord, à l’aide d’un scalpel, coupez les bandes de derme en petits morceaux.

Transférez les morceaux de derme dans un tube Falcon et ajoutez 10 millilitres de solution de collagénase incubée à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, centrifugez la solution et retirez soigneusement le surnageant. Lavez la pastille avec du DMEM plus 10 % de FCS plus 1 % de streptocoque.

Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant, remettez la pastille en suspension dans le milieu de culture et transférez-la dans un flacon de culture T 75 pour permettre aux cellules de se développer hors du tissu, d’incuber dans des conditions statiques. Pour mettre en place le système de test tumoral, coupez la sous-muqueuse tubulaire de l’intestin grêle ou SIS muc, ouvrez-la d’un côté et fixez-la entre deux anneaux métalliques. Ces couronnes cellulaires auto-construites ont un diamètre de 10 millimètres.

Couvrez le SIS mu dans un milieu de culture cellulaire pendant la nuit du lendemain, ensemencez le MVE CS primaire sur la surface basale ultérieure du SIS, l’ancien CI.Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Trois heures plus tard, remplissez le puits de milieu pour assurer la culture submergée et remettez-le dans l’incubateur. Laissez les cellules endothéliales adhérer pendant trois jours après trois jours.

Retournez le système de culture statique de 180 degrés et transférez-le sur une plaque à 12 puits. Ensuite, observez un mélange de fibroblastes dermiques primaires et de cellules tumorales sur la surface apicale du SIS. Le côté de l’ancienne lumière.

Laissez les cellules adhérer pendant trois heures. Remplissez le puits avec un milieu pour immerger la culture de culture, le système de test de tumeur dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 14 jours supplémentaires, en changeant le milieu de culture tous les deux à trois jours pour la culture dynamique. Fixez le SIS mu entre deux anneaux métalliques et amorcez les MV eecs primaires comme démontré précédemment.

Après trois jours, retirez le SIS mu des anneaux métalliques et insérez la membrane dans le réacteur à flux avec une seringue et une canule. Appliquez les fibroblastes dermiques primaires et les cellules tumorales sur la matrice dans le bioréacteur. Laissez les cellules adhérer pendant trois heures avant de remplir le système de bioréacteur avec un milieu de culture le lendemain, placez le bioréacteur dans un système d’incubation auto-construit et connectez-le à une pompe péristaltique.

Cette configuration permet la culture dynamique avec un débit pulsatile régulé en pression ou un débit constant. Dans cette expérience, un débit de fluide constant de 3,8 millilitres par minute est utilisé. Maintenez la culture dynamique pendant 14 jours, en changeant de milieu de culture après sept jours.

À la fin des expériences, les tissus sont fixés, paraffinés, intégrés et colorés, puis imagés à l’aide d’un microscope inverse. Les résultats représentatifs sont présentés ici. Le panneau A donne un aperçu de la lignée cellulaire tumorale S 4 62 cultivée statiquement en monoculture 2D colorée à l’hémattoline.

La co-culture 3D est présentée dans les panneaux B, C et D.Cette image colorée H et e montre la triple culture des cellules tumorales S 4 62 et des fibroblastes primaires sur la face apicale du SIS MU et MVEC. Sur la face latérale basale, les flèches marquent les cellules endothéliales. Différents types de cellules peuvent être identifiés en colorant des marqueurs spécifiques au type de cellule tels que le facteur de von Willebrand pour marquer le MVEC montré dans le panneau C et P 53 montré dans le panneau D.Les cellules P 53 positives S 4 62 peuvent être distinguées des fibroblastes primaires P 53 négatifs, et la distribution 3D des cellules peut être analysée de la même manière.

Différents types de cellules peuvent être identifiés dans le panneau de culture triple A est une image colorée H et E où les flèches marquent les cellules endothéliales. Le panneau B montre une coloration immuno-histologique pour le facteur de von Willebrand, et le panneau C montre une coloration pour P 53 Suite à cette procédure. D’autres méthodes, telles que des tests de médicaments, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer ou l’analyse des voies de signalisation importantes dans la genèse tumorale.

De plus, les cellules primaires peuvent être utilisées pour définir le meilleur traitement personnalisé pour chaque patient.