Name: génie tissulaire dun être humain 3D In vitro Système de tumeur de test (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez la construction d'un système de test tumoral 3D utilisant des cellules primaires humaines sur un scaffold biologique décellularisé. Cette méthode permet de simuler fidèlement les conditions in vivo pour étudier la progression tumorale.

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Les auteurs tiennent à remercier Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) pour son appui technique pour élaborer des bioréacteurs et l&#39;incubateur de bioréacteur.

Une. Décellularisation de la BioVaSc <ol><li> Rincer le système vasculaire du segment jéjunal porcin via un accès artériel canule et la lumière intestinale avec du PBS -. Répétez jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement propre. </li><li> Préparer un réservoir de verre de 200 mm de diamètre avec 4 adaptateurs et de les relier par des tubes de silicium à la pompe péristaltique (Ismatec). L&#39;unité de commande de pression peut être surveillée par l&#39;intermédiaire d&#39;un capteur de pression qui est connecté à un dôme stérile à usage unique (voir Figure 1). </li><li> Remplir les bouteilles de réservoir avec decellularization (DZ) solution et vérifier le système de tubes de bulles d&#39;air. </li><li> Connectez la lumière intestinale avec attaches de câble aux connecteurs de verre pour l&#39;écoulement luminale. La pompe 500 ml solution DZ dans la accès artériel rouge (Figure 1B) du système vasculaire. Interrompre le processus de pompage toutes les 15 minutes à peu appuyer manuellement sur la totalité lumière intestinale. </li><li> Au cours de la decellularizatile processus, la pression de la solution tampon doit être comprise entre 80 - 100 mm Hg, le modèle de la pression artérielle naturelle. </li><li> Laver le BioVaSc avec du PBS - jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit exempt de restes de cellules (&quot;tout blanc&quot;). </li><li> Remplissez le BioVaSc complètement avec une solution DZ et incuber il plonger dans une solution DZ pendant une nuit à 4 ° C sur agitateur à bascule. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.6. </li><li> Placer la solution dans BioVaSc de DNase et incuber pendant une nuit à 4 ° C sur agitateur basculant. </li><li> Retirer la solution de DNase et rincer avec du tampon de lavage. </li><li> γ-stérilisation avec 25 kGy </li></ol> 2. Les différents types de cellules 2.1 Isolement de cellules primaires humaines cutanée microvasculaire endothéliales (mvECs) et des fibroblastes <ol><li> Couper biopsie de peau (de préférence de prépuce) en bandes de 2 à 3 mm de largeur avec un scalpel et rincez-les 3x avec du PBS - solution. </li><li> Couvrir le tissu avec une solution Dispase et incuber pendant 16 à 18 heures à 4 ° C. </li><li> Épiderme Séparez derme avec 2 pinces et transférer à la fois séparément dans des boîtes de Pétri remplies avec du PBS +. </li><li> Rincer derme bandes 1x avec Versene. </li><li> Ajouter 10 ml de trypsine / EDTA en solution aux bandes de derme et incuber dans l&#39;incubateur pendant 40 min. </li><li> Arrêter la réaction enzymatique immédiatement avec 1% de FCS. </li><li> Transférer des bandes de peau à une boîte de Pétri remplie de VascuLife et gratter chaque bande avec le scalpel 8x chaque côté, en ajoutant un peu de pression. </li><li> Transférer la suspension cellulaire produite par l&#39;intermédiaire d&#39;un tamis cellulaire à un tube de centrifugation et rinçage 3 fois de tamis cellulaire avec VascuLife. </li><li> Centrifuger le tube à 1 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire avec VascuLife. </li><li> Pour isoler les fibroblastes, le derme chop bandes en petits morceaux à l&#39;aide du scalpel. </li><li> Ajouter 10 ml de solution de collagénase à des morceaux de derme. </li><li> Incuber pendant 45 minutes dans l&#39;incubateur, puis centrifuger et retirez soigneusement supernatant. </li><li> Laver 1x à granulés avec du DMEM + 10% FCS +% Penstrep, centrifugeuse et retirez soigneusement le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans du milieu de culture et les transférer dans un flacon de culture T75 pour permettre aux cellules de croître sur le tissu. </li></ol> 2.2 Tumor Cell Line S462 La lignée cellulaire tumorale S462 (aimablement fourni par le Dr Nikola Holtkamp, ​​Université Charité de médecine de Berlin) a été généré à partir d&#39;une tumeur maligne des nerfs périphériques gaine tumeur d&#39;une patiente à l&#39;héréditaire de type syndrome de prédisposition tumorale de neurofibromatose de type 1 9. S462 sont cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FCS. Moyen doit être changé tous les 2 - 3 jours. Une fois par semaine, les cellules doivent être répartis. 3. Système de test de la tumeur: statiques Conditions Culture rapport à la culture dynamiques des systèmes de bioréacteur <ol><li> Couper le Muc-SIS tubulaire ouverte d&#39;un côté et de le fixer entre les deux anneaux métalliques (couronnes de cellules, 10 mm de diamètre, l&#39;auto constructed). Couvrir le Muc-SIS dans un milieu de culture cellulaire pendant la nuit. </li><li> cellules de semences isolé du nombre de cellules définies (voir ci-dessous) sur un ou deux côtés de la SIS (mono-ou co-culture mis en place). <ol><li> Seed 8000 cellules / cm 2 de mvECs primaires dans un volume total de 100 pi sur la surface basolatérale de la SIS (ex-séreuse). Remplir 3 h plus tard, le bien avec le milieu à assurer une culture immergée. </li><li> Laisser les cellules endotheliales à adhérer pendant 3 jours. Retournez le système de culture statique de 180 ° et le transférer sur une plaque de 12 puits. </li><li> Ensemencer un mélange de fibroblastes dermiques primaires (8000 cellules / cm 2) et de cellules tumorales (15 000 cellules / cm 2) dans un volume total de 500 pi sur la surface apicale de la SIS (du côté de l&#39;ancienne lumen). </li><li> Laisser les cellules adhèrent pendant 3 heures et remplissage de la cuve avec un milieu (culture immergée, moyenne: 50% Vasculife + 50% DMEM supplémenté avec 10% de FCS). </li><li> Le système de test de la tumeur est cultivée dans des conditions statiques unT 37 ° C, 5% CO 2 dans l&#39;incubateur pendant 14 jours supplémentaires. Changer le milieu de culture tous les 2 - 3 jours. </li></ol></li><li> Pour la culture dynamique, fixer le SIS-Muc entre deux anneaux métalliques et semences mvECs primaires comme décrit au point 3.2.1. Après 3 jours supprimer le SIS-Muc des anneaux métalliques et insérer la membrane dans le réacteur à écoulement (voir les figures 2C et 2D). Appliquer le primaire fibroblastes dermiques et les cellules tumorales avec une seringue et une canule sur la matrice dans le bioréacteur, et de permettre aux cellules d&#39;adhérer pendant 3 heures avant de remplir le système de bioréacteur avec un milieu de culture. </li><li> Sur les conditions de culture jour dynamiques suivants avec un débit constant milieu (3,8 ml / min, 37 ° C et 5% CO 2) peut être initié. La culture dynamique est maintenue pendant 14 jours, le milieu de culture est changé au bout de 7 jours. </li><li> L&#39;installation d&#39;essai dynamique est cultivé dans un incubateur d&#39;auto-construit qui fournit un flux de média à travers une pompe et la température nécessaire et CO 2 </sub&gt; Contenu. </li></ol> 4. Méthodes de caractérisation pour l&#39;analyse 4.1 Fixation et paraffine-encastrement de la matrice de collagène ensemencée <ol><li> Pour (immuno-histologiques) caractérisations éliminer le milieu de culture et fixer le tissu avec du paraformaldéhyde 4% pendant 2 heures. </li><li> Retirer 4% de paraformaldéhyde et de transférer le SIS de l&#39;insert métallique à une cassette de tissus enrobage. Arrosez le tissu pour enlever restant fixateur et déshydrater pour l&#39;infiltration de paraffine. </li><li> Avant l&#39;intégration dans un bloc de paraffine, couper le SIS à 2 - 3 tranches et les placer dans un moule en métal de base de paraffine rempli de sorte que les surfaces de coupe orientés vers le bas. Ajouter la cassette de tissus sur le dessus du moule en tant que support. </li><li> Couper des tranches de 5 um et flotter dans un bain à 40 ° C de l&#39;eau pour le dressage, puis monter les diapositives sur des lames de verre appropriés. Diapositives non enrobés, sont utilisés pour H &amp; E taches, des lames de polylysine revêtu pour la coloration immunohistochimique pour améliorer la fixation.Laissez sécher complètement les tranches. </li><li> Faire fondre la paraffine, retirez-le avec du xylène et réhydrater tranches pour après coloration. </li></ol> 4.2 Coloration <ol><li> Les tranches réhydratés peuvent être colorées à l&#39;hématoxyline / éosine un aperçu coloration normalisée. </li><li> Pour la coloration immunhistological, fixes et des tranches de tissu paraffine infiltré doivent subir une récupération d&#39;antigène pour permettre anticorps reconnaissent et se lient à leurs épitopes spécifiques. Par conséquent, déparaffinées et réhydratées diapositives sont placées dans un cuiseur à vapeur chauffée avec du tampon au citrate (pH 6,0) pendant 20 min. </li><li> diapositives de transfert aux tampon de lavage (0,5 M tampon TBS + 0,5% de Tween) et les tranches de cercle avec un stylo de PAP pour minimiser le volume nécessaire pour des solutions de coloration. </li><li> Placer la lame dans une chambre à humidité. Pour garantir une visualisation de raifort spécifique de la peroxydase à médiation par des antigène-anticorps se liant, la peroxydase endogène doit être saturée avec 3% de peroxyde d&#39;hydrogène. </li><li> Antib primaireody dilutions sont appliquées sur les tranches, incubées pendant 1 heure à température ambiante et soigneusement lavés avec du tampon de lavage. </li><li> Pour la détection des liaisons antigène-anticorps spécifiques de l&#39;Ultra Vision Quanto Système de détection de HRP DAB (Thermo Scientific) est utilisé selon le protocole recommandé. </li><li> Les noyaux sont contre-colorées avec l&#39;hématoxyline pendant 1 min. </li><li> Les lames sont montées avec un milieu aqueux, on les sèche, et imagés en utilisant un microscope inversé. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

<html> Lorsque l&#39;on compare 2D et 3D des systèmes de culture dans la recherche de la tumeur, les systèmes 3D, en dépit d&#39;être l&#39;approche la plus coûteuse, se sont avérés mieux reproduire les conditions de micro-environnements biologiques. On a pu montrer que certaines cellules tumorales se développent beaucoup plus lentement dans une culture en 3D par rapport à une culture 2D commun 12, qui est conforme à la situation dans un véritable tumeur. Bissell et collaborateurs ont montré dans leur travail que le comportement des cellules cancérigènes du sein correspond à la situation in vivo, y compris la morphologie cellulaire et de signalisation, et plus précisément quand une culture en 3D au sein d&#39;une matrice propose des interactions cellule-ECM. En outre, ils ont souligné l&#39;importance de l&#39;environnement extracellulaire en 3D en démontrant que les changements dans les interactions environnementales ont conduit à la réversion des cellules malignes à un phénotype normal. En outre et surtout, ces résultats peuvent également être confirmées dans des modèles animaux in vivo 10,11. ontenu &quot;&gt; La comparaison directe des expériences in vivo sur les animaux et dans les modèles de tissus in vitro révèle des avantages et des inconvénients dans les deux systèmes. L&#39;un des avantages des modèles in vitro est la permission d&#39;un temps réel beaucoup mieux ou imagerie fixe par microscopie. Une limitation est que ils imitent conditions statiques ou à court terme, alors que les systèmes in vivo progressent souvent. L&#39;absence actuelle de système vasculaire et le transport normal de petites molécules, accueillir les réponses immunitaires, et d&#39;autres interactions cellulaires sont d&#39;autres inconvénients des modèles in vitro 12. Par conséquent, 3D dans des systèmes in vitro tel que présenté dans cette étude offrent des perspectives prometteuses à l&#39;expérimentation animale. Ils offrent une meilleure comparabilité de l&#39;organisme humain et donc de minimiser les erreurs d&#39;interprétation expérimentales. biomimétique dans des systèmes modèles in vivo sera donc devenir plus pertinent d&#39;étudier la façon dont le cancer et les métastases dépendent sur les conditions micro-environnementales qui régissent tumorigenesis 11. Notre étude montre que l&#39;environnement 3D fournie par le SIS-Muc conduit à une formation de tumeur plus semblable à un tissu de cellules, qui n&#39;est pas observée dans la culture de cellule commun 2D (voir la figure 3A). En outre, l&#39;utilisation de cellules primaires dérivées de biopsies de tumeurs est une étape très importante vers une médecine personnalisée, une discipline qui vise à identifier le meilleur traitement en fonction des besoins individuels du patient. Incorporant des cellules tumorales spécifiques au patient primaires isolées à partir de matériel de biopsie permettra de tests in vitro des stratégies thérapeutiques. Ces systèmes de test, il sera possible d&#39;étudier les différentes drogues et leurs combinaisons en un temps et criblage à haut débit de réduction des coûts. En outre, l&#39;intégration de cellules stromales associées à la tumeur comme le montre cette étude est importante pour l&#39;approche personnalisée, puisque la progression des influences microenvironnement de la tumeur de la tumeur 13 et pourrait se révéler comme Conviecible thérapeutique le. En variante à une approche personnalisée, notre modèle de tumeur peut être modifié pour servir de système de test de la tumeur généralisée par l&#39;incorporation des lignées cellulaires tumorigènes établies. Il s&#39;agit d&#39;une adaptation prometteuse à des fins de recherche fondamentale. À la fois pour le dépistage de drogues se rapproche de la présence d&#39;une structure vasculaire est nécessaire de tester la répartition et l&#39;absorption de substances thérapeutiques. La matrice de SIS-Muc permet l&#39;ensemencement avec basolatérale primaire MVEC pour les études d&#39;absorption de la barrière, le réensemencement des structures vasculaires préservés de la BioVaSc permettra d&#39;améliorer encore l&#39;étude de l&#39;administration de médicaments. Afin de créer des modèles de tissu, une matrice biodégradable 3D peut être utilisé en tant que cadre pour une co-culture de différents types de cellules 14. L&#39;utilisation de telles matrices 3D est souvent limitée par l&#39;absence de vascularisation fonctionnelle. Ce problème peut être résolu par l&#39;utilisation de la BioVaSc, qui offre str conservé de vaisseau sanguinuctures, qui peuvent être ensemencés avec des cellules endotheliales. En outre, la BioVaSc fournit des composants extracellulaires, qui assurent l&#39;adhérence des cellules et de faciliter la différenciation des tissus. Il permet également la fonction spécifique des tissus de longue date de tissus 3D bioartificiel 7,8,15. La condition préalable pour l&#39;ingénierie de substituts vasculaires fonctionnelles est l&#39;imitation de physiologique humain et les conditions biomécaniques. Par conséquent, les systèmes de bioréacteurs, qui peut mettre en œuvre ces exigences in vitro, sont d&#39;un intérêt extrême pour la création de modèles de tumeurs biologiques. La combinaison de la BioVaSc, la technologie de bioréacteur et de la co-culture de différents types de cellules est un procédé très prometteur pour produire des tissus de tumeurs vascularisées, ce qui permettra l&#39;étude des mécanismes pertinents pour la progression du cancer tels que l&#39;angiogenèse et la métastase. Nous voyons ces modèles tumoraux comme une approche prometteuse pour compléter les études animales en fournissant un équivalentà la physiologie de la tumeur humaine.

Nouveaux produits pharmaceutiques doivent être validés en ce qui concerne leur qualité, la sécurité et l&#39;efficacité avant l&#39;autorisation de commercialisation. À ce jour, l&#39;expérimentation animale sont la méthode standard pour le dépistage des drogues et de validation. Toutefois, en raison des différences spécifiques à l&#39;espèce, l&#39;expérimentation animale, souvent, ne permettent pas d&#39;évaluer complètement l&#39;effet des composés chez l&#39;homme 1. Pour cette raison, il est important de générer des modèles de tissu humain qui peuvent être utilisés pour des tests in vitro de nouveaux médicaments et de substances. L&#39;un des axes de notre groupe est la création de modèles in vitro d&#39;essai dans notre échafaudage avec vascularisé biologique (BioVaSc) 2,3. Le BioVaSc peut être utilisé comme un système de matrice 3D statique ou dynamique. Pour la culture statique, le segment de jéjunum de porc décellularisé (petite sous-muqueuse intestinale Muc-SIS) est placé dans un insert métallique pour le réensemencement des cellules. Diverses cellules, telles que le cancer et les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur l&#39;échafaudage. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pour la culture dynamique, la BioVaSc est attaché à un système de bioréacteur que s&#39;applique l&#39;écoulement dans tout le système vasculaire ou à travers la surface de l&#39;échafaudage. Bioréacteurs actuels mettent en œuvre des stimuli biologiques, mécaniques, ou électriques qui agissent sur ​​la différenciation ou de la prolifération des cellules 4. Pour bioréacteurs dans le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire, le concept de base est de simuler les conditions dans le corps humain. Dans lequel, les cellules sont fournies un milieu naturel dans lequel ils peuvent interagir les uns avec les autres et leur matrice extracellulaire environnant. Pour la production de systèmes in vitro ou transplantations de test dans, la capacité d&#39;imiter l&#39;environnement naturel des cellules avec une structure de support appropriée et le système de bioréacteur est essentiel 5. Par conséquent, des dispositifs plus complexes et techniquement exigeants doivent être développées afin de s&#39;acquitter de ces tâches 6. Il est en outre possible d&#39;utiliser notre échafaudage pour l&#39;établinfligés aux vascularisé un modèle en raison des structures tubulaires, qui comprennent conservés l&#39;artère d&#39;alimentation, de la veine, et le lit capillaire de liaison. Toutes les cellules porcines ont besoin d&#39;être enlevé par décellularisation chimique, mécanique et enzymatique, et l&#39;échafaudage gamma-stérilisé. Les structures tubulaires vasculaires peuvent ensuite être restaurées réensemencées avec des cellules endotheliales microvasculaires humaines en utilisant un bioréacteur à perfusion recirculation 7, qui imite les paramètres biomécaniques et / ou biochimiques, tels que le pH, la température, la pression, l&#39;alimentation en substances nutritives et l&#39;enlèvement des déchets 6. La ré-endothélialisation des structures tubulaires crée un équivalent humain d&#39;un vaisseau sanguin à l&#39;intérieur de l&#39;échafaudage de collagène 3,7. Dans l&#39;étape suivante, la surface des anciens lumière (muqueuse) peut être ensemencée avec des cellules humaines primaires d&#39;établir des co-cultures 3,7,8. Dans cette étude, un système de test de la tumeur 3D est mis en place par co-culture d&#39;une lignée de cellules de tumeur primaire avec stcellules Romal dans des conditions statiques et dynamiques sur le SIS-Muc.

<table><tbody><tr><td>Solution de collagénase</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>(500 U/ml)</td></tr><tr><td>Solution de dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>(2,0 U/ml)</td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td>200 mg résolue dans 500 ml PBS+ + 1 % PenStrep</td></tr><tr><td>DZ solution</td><td>Roth</td><td>3484.2</td><td>34 g Sodium Désoxychélate, dans 1 L Eau ultra-pure</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>transducteur de pression médical</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr> souris <tr><td>monoclonale anti-humaine Von Willebrand Factor</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>Clone F8/86 0.12 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>souris monoclonale anti-humaine p53</td><td>DAKO Cytomation</td><td>IS616</td><td>Clone DO-7 pompe</td></tr><tr><td>péristaltique</td> prête à l’emploi <td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr> stérile <tr><td>jetable</td><td>dôme MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine / EDTA solution</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05 %</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-Mv)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

génie tissulaire d&#39;un être humain 3d<em&gt; in vitro</em&gt; système de tumeur de test

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Le cancer est l&#39;une des principales causes de décès dans le monde. Les stratégies thérapeutiques actuelles sont principalement développées dans les systèmes de culture en 2D, qui reflètent mal les conditions physiologiques in vivo. Matrices 3D biologiques fournissent les cellules d&#39;un environnement dans lequel les cellules peuvent s&#39;auto-organiser, permettant l&#39;étude de l&#39;organisation des tissus et la différenciation cellulaire. Ces échafaudages peuvent être ensemencées avec un mélange de différents types de cellules pour étudier cellule-cellule 3D-interactions directes. Pour imiter la complexité 3D de tumeurs cancéreuses, notre groupe a mis au point un système 3D in vitro d&#39;une tumeur de test. Nos modèles de systèmes de test de tissu 3D la situation in vivo de tumeurs malignes nerveux périphériques de la gaine (de MPNST), que nous avons établies avec nos décellularisée secteur du jéjunum de porc d&#39;échafaudage vascularisé biologique dérivé (BioVaSc). Dans notre modèle, nous réensemencer une matrice BioVaSc modifié avec des fibroblastes primaires, des cellules endothéliales microvasculaires (mvECs) et la lignée cellulaire de tumeur S462. Pour la culture statique, la structure vasculaire du BioVaSc est retiré et l&#39;échafaudage est découpé restant ouvert d&#39;un côté (petite sous-muqueuse intestinale Muc-SIS). La matrice résultante est ensuite fixé entre les deux anneaux métalliques (couronnes de cellules). Une autre option est de culture de la cellule tête de série, Muc-SIS dans un système de bioréacteur d&#39;écoulement qui expose les cellules à des contraintes de cisaillement. Ici, le bioréacteur est raccordé à une pompe péristaltique dans un incubateur à auto-construit. Un ordinateur régule l&#39;oxygène artériel et la fourniture des nutriments par l&#39;intermédiaire des paramètres tels que la pression artérielle, la température et le débit. Cette configuration permet une culture dynamique soit pulsatile de la pression régulée ou débit constant. Dans cette étude, nous avons pu établir avec succès à la fois un système de culture 3D statique et dynamique pour MPNST. La capacité à modéliser les tumeurs cancéreuses dans un environnement 3D plus naturel permettra à la découverte, le test et la validation deproduits pharmaceutiques à venir dans un modèle humain-comme.

Comme le montre la figure 1B, nous décellularisé le segment jéjunal porc (environ 2 m de longueur et 20 mm de diamètre) avec des structures tubulaires préservés du réseau capillaire. Après chimique, enzymatique et mécanique décellularisation, on a obtenu un échafaudage de collagène I / III, qui peut être utilisé pour la culture cellulaire 3D. Un test de Feulgen a été effectuée pour démontrer la pureté (absence de restes d&#39;ADN) de la matrice (données non présentées). Les figures 2A et 2B montrent la culture statique de SIS-Muc fixé par les couronnes de cellules. Nous avons fixé le SIS-Muc dans un bioréacteur conçu en interne (figure 2C) pour la culture dynamique. Figure 2D illustre le flux dynamique simulée à travers la chambre du bioréacteur. Le bioréacteur est placé dans un système d&#39;incubateur pour elle-même et relié à une pompe péristaltique. Cette configuration permet une culture dynamique soit avec flux pulsatile ou c pression régulée<html> flux onstant. La figure 3 donne une vue d&#39;ensemble de la ligne de façon statique en culture d&#39;une tumeur S462 cellulaire en 2D monoculture (figure 3A) et en 3D coculture (figures 3B-3D). Figure 3B représente le triple de la culture de cellules tumorales S462 et les fibroblastes primaires sur le côté apical de SIS -Muc (ancien côté lumière intérieure) et MVEC sur le côté basolatéral (ancien côté séreuse). L&#39;identification de différents types de cellules est possible par coloration des marqueurs spécifiques du type cellulaire, telles que le facteur de von Willebrand à étiqueter MVEC (Figure 3C). Les cellules S462 p53-positives peuvent être distinguées des fibroblastes primaires en p53 négatif (Figure 3D) et de la distribution 3D de cellules peut être analysée. L&#39;équivalent de la figure 4 montre à la figure 3 de la culture cultivée triple dynamiquement. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Decellularization set-up. (A) bioréacteur et pompe set-up pour la décellulariser BioVaSc, contrôlé par un PC. (B) décellularisée BioVaSc dans le réservoir de verre. Le lumen et l&#39;entrée artérielle sont reliés aux adaptateurs. . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figure 2. Plus de vue de la culture différents set-ups. (A) Vue en coupe de CAO d&#39;un système de culture statique à plaque à puits de microtitration, (B) des inserts métalliques pour la culture statique, la simulation d&#39;écoulement de fluide (C) (de champ de vitesse [m / s]) pour la culture dynamique de la paupière supérieure du bioréacteur d&#39;écoulement , (D) bioréacteur d&#39;écoulement de la culture dynamique relié à la pompe péristaltique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> ent &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figure 3. Vue d&#39;ensemble de la caractérisation immunohistochimique du modèle de tumeur 3D statique. (A) d&#39;hématoxyline tache de la statique de culture culture 2D mono de cellules S462 sur une lame Permanox, (B) coloration H &amp; E de la culture triple 3D statiquement en culture, flèches indiquent les cellules endothéliales, (C) la coloration immunohistochimique pour le facteur de von Willebrand, (D ) coloration immunohistochimique pour p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir chiffre</a> <img alt="Figure 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figure 4. Vue d&#39;ensemble de la caractérisation immunohistochimique du modèle de tumeur 3D dynamique. (A) H &amp; E tache de la culture triple 3D dynamique de culture, flèches indiquent les cellules endothéliales, (B) coloration immunohistochimique pour le facteur de von Willebrand, (C) coloration immunohistochimique pour p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a>

Méthodes pour créer des tissus tumoraux humains 3D comme systèmes d&#39;essai sont décrits. Ces technologies sont basées sur un échafaudage décellularisé biologique vascularisé (BioVaSc), les cellules primaires humaines et d&#39;une lignée cellulaire tumorale, qui peut être cultivée dans des conditions statiques ainsi que dans des conditions dynamiques dans un bioréacteur d&#39;écoulement.

génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Le but global de cette procédure est de concevoir un système d'essai tumoral tridimensionnel à l'aide de cellules primaires sur une matrice biologique décellularisée. Cette réalisation s'effectue tout d'abord en préparant la matrice par un processus de décellularisation au cours duquel un segment alvéolaire porcin est perfusé avec une solution de décellularisation. La deuxième étape consiste à isoler des cellules humaines primaires à partir d'une biopsie de patient en utilisant un protocole d'isolement standard.Ensuite, mettez en place le système de test tumoral en ouvrant sur un côté la sous-muqueuse tubulaire de l'intestin grêle, en la fixant entre deux anneaux métalliques et en l'ensemçant avec des cellules tumorales et des cellules stromales associées à des densités cellulaires définies. La dernière étape consiste à cultiver l'assemblage chargé de cellules dans un dispositif approprié, en conditions statiques ou dynamiques. Enfin, une microscopie immunohistochimique est utilisée pour évaluer les caractéristiques de la croissance tumorale.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les systèmes de test tumoral TT est qu'elle permet de créer des modèles tissulaires tridimensionnels simulant plus précisément les conditions in vivo d'une tumeur que les modèles bidimensionnels courants. L'avantage de la culture dynamique est que les caractéristiques spécifiques aux cellules sont conservées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie tumorale, telles que la manière dont les cellules cancéreuses établissent des interactions cellule-cellule et cellule-matrice dans un environnement tridimensionnel, ce qui contribuera à élucider des processus liés au cancer tels que la progression tumorale et la métastase.Le support biologique vascularisé ou biova utilisé dans ce système de test tumoral est dérivé d'un segment jéjunal porcin. Rincez le système vasculaire du segment al porcin et la lumière intestinale avec du PBS par accès artériel canulé. Répétez jusqu'à ce que ce soit complètement propre.Préparez un réservoir en verre de 200 millimètres de diamètre équipé de quatre adaptateurs et reliez-les au moyen de tubes en silicone à une pompe péristaltique. L'unité de contrôle de pression peut être surveillée à l'aide d'un capteur de pression connecté à un dôme stérile jetable. Remplissez les flacons réservoirs avec la solution de décellularisation ou la solution DZ.Vérifiez le système de tubulure à la recherche de bulles d'air éventuelles. Reliez le lumen intestinal à l'aide de colliers serrants aux raccords en verre destinés au flux luminal. Pomperez 500 millilitres de solution DZ dans l'accès artériel rouge du système vasculaire.Interrompez brièvement le processus de pompage toutes les 15 minutes afin de presser manuellement tout le lumen intestinal. Il est important de surveiller la pression de la solution tampon pendant le processus de décellularisation. La pression doit se situer entre 80 et 100 millimètres de mercure, sur le modèle de la pression sanguine naturelle.Lavez la biova avec du PBS jusqu'à ce qu'elle soit débarrassée des restes cellulaires et que la structure vasculaire soit complètement blanche. Commencez cette procédure en découpant la biopsie cutanée en bandes de deux à trois millimètres de largeur à l’aide d’un scalpel et en les rinçant trois fois avec une solution de PBS. Après avoir incubé le tissu dans la solution disbe, utilisez deux pincettes pour séparer l’épiderme du derme.Transférez séparément dans des boîtes de Pétri remplies de PBS afin d'isoler les cellules endothéliales microvasculaires dermiques primaires ou les MV eecs. Rincez les lambeaux de derme une fois avec de l'ene, ajoutez 10 millilitres de solution de trips dans la solution d'EDTA aux lambeaux de derme et incubez à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Arrêtez la réaction enzymatique avec du FCS à 1 % et transférez les lambeaux de peau dans une boîte de Pétri remplie de vascu life. Grattez chaque lambeau huit fois de chaque côté avec le scalpel, en exerçant une légère pression pour produire une suspension cellulaire.Centrifuger ensuite la suspension cellulaire et le résuspension, suspendre le culot cellulaire avec du vascu life. Pour isoler les fibroblastes. Utiliser d'abord un scalpel pour découper les bandes de derme en petits morceaux.Transférez les morceaux de derme dans un tube Falcon et ajoutez 10 millilitres de solution de collagénase incubée à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, centrifugez la solution et retirez soigneusement le surnageant. Lavez le culot avec du DMEM supplémenté de 10 % de FCS et de 1 % de pénicilline-streptomycine.Après centrifugation, retirez soigneusement le surnageant, resuspendez le culot dans du milieu de culture et transférez dans un flacon de culture T 75 pour permettre aux cellules de migrer hors du tissu ; incubez en conditions statiques. Pour mettre en place le système de test tumoral, commencez par couper la sous-muqueuse intestinale grêle tubulaire ou SIS muc, ouvrez-la sur un côté et fixez-la entre deux anneaux métalliques. Ces couronnes cellulaires autoconstruites ont un diamètre de 10 millimètres.Couvrir le SIS mu avec du milieu de culture cellulaire pendant une nuit le jour suivant, puis ensemencer les cellules MVE CS primaires sur la surface basale du SIS, l'ancien CI. Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Trois heures plus tard, remplir le puits avec du milieu afin d'assurer une culture immergée et replacer le tout dans l'incubateur. Laisser les cellules endothéliales adhérer pendant trois jours après ces trois jours.Retournez le système de culture statique de 180 degrés et transférez-le dans une plaque de 12 puits. Ensuite, observez un mélange de fibroblastes dermiques primaires et de cellules tumorales sur la surface apicale du SIS. Le côté de l'ancien lumen.Laisser les cellules adhérer pendant trois heures. Remplir le puits avec du milieu afin d'immerger la culture, le système de test tumoral en conditions statiques à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 14 jours supplémentaires, en changeant le milieu de culture tous les deux à trois jours pour la culture dynamique. Fixer le SIS mu entre deux anneaux métalliques et ensemencer les cellules MV primitives comme indiqué précédemment.Après trois jours, retirez la membrane SIS des anneaux métalliques et insérez la membrane dans le réacteur à flux à l’aide d’une seringue et d’une canule. Appliquez les fibroblastes dermiques primaires et les cellules tumorales sur la matrice dans le bioréacteur. Laissez les cellules s’adhérer pendant trois heures avant de remplir le système du bioréacteur avec le milieu de culture le jour suivant, placez le bioréacteur dans un système d’incubation auto-construit et connectez-le à une pompe péristaltique.Ce dispositif permet une culture dynamique avec un flux pulsatile régulé par pression ou un flux constant. Dans cette expérience, un flux constant de milieu de 3,8 millilitres par minute est utilisé. Maintenez la culture dynamique pendant 14 jours, en changeant le milieu de culture après sept jours.À l'issue des expériences, les tissus sont fixés, inclus en paraffine, colorés, puis observés à l’aide d’un microscope inversé. Des résultats représentatifs sont présentés ici. Le panneau A donne un aperçu de la lignée cellulaire tumorale S 4 62 en culture statique en monoculture bidimensionnelle, colorée à l’hématoxyline.La co-culture 3D est illustrée dans les panneaux B, C et D. Cette image colorée à l'hématoxyline et à l'éosine montre la culture triple de cellules tumorales S462 et de fibroblastes primaires sur la face apicale du SIS MU et des MVEC. Sur la face basolatérale, les flèches indiquent les cellules endothéliales. Différents types cellulaires peuvent être identifiés par coloration de marqueurs spécifiques aux types cellulaires, tels que le facteur de von Willebrand pour marquer les MVEC, illustré dans le panneau C, et la protéine P53 illustrée dans le panneau D. Les cellules S462 positives pour P53 peuvent être distinguées des fibroblastes primaires négatifs pour P53, et la distribution tridimensionnelle des cellules peut être analysée de la même manière.Différents types cellulaires peuvent être identifiés dans le panneau de culture triple dynamique. Le panneau A est une image colorée à l'hématoxyline et à l'éosine où les flèches indiquent les cellules endothéliales. Le panneau B montre une coloration immunohistologique du facteur de von Willebrand, et le panneau C montre la coloration du P 53 après cette procédure. D'autres méthodes, telles que des tests pharmacologiques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la recherche de nouvelles thérapies anticancéreuses ou l'analyse des voies de signalisation importantes dans la tumorigenèse.En outre, les cellules primaires peuvent être utilisées pour définir le meilleur traitement personnalisé pour chaque patient.

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