Name: Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Apprenez à isoler les cellules endothéliales ventriculaires embryonnaires à partir d'embryons de souris transgéniques. Cette méthode par dissection, traitement au collagène et séparation magnétique permet d'étudier le développement cardiovasculaire.

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Nous tenons à remercier Andrea Portbury pour la lecture critique du manuscrit, le Laboratoire des services de microscope de l&#39;UNC pour l&#39;aide à la imagerie time-lapse, et le NIH (subvention n R01HL061656) pour le soutien financier.

1. Préparer Perles anticorps conjugués <ol><li> Un jour avant la dissection, mélanger l&#39;anticorps de choix avec les Dynabeads appropriées (par exemple Dynabeads IgG de rat pour un anticorps dirigé chez le rat, 4 x 10 8 perles / ml) selon les instructions du fabricant. Pour l&#39;anticorps anti-CD31 anticorps de rat BD (0,5 pg / pl, utilisé pour isoler des cellules endothéliales), trois anticorps pi est ajouté pour 25 perles pl, pour une concentration finale de 1,5 mg d&#39;anticorps anti-CD31 et 1 x 10 7 perles / 25 pi de tampon. </li><li> Incuber des perles et des anticorps nuit à 4 ° C. </li></ol> 2. Préparation de la plaque de collagène <ol><li> Cellules isolées forment tubules plus rapidement lorsqu&#39;il est cultivé sur un gel de collagène au lieu de simplement une plaque revêtue de collagène. Par conséquent, des gels de collagène sont effectués la nuit avant la dissection, comme décrit dans 6. Sur la glace dans une hotte de culture de tissus, mélanger les réactifs suivants (assez pour 19 puits): 206,4 pi H stérile &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 pi de collagène de type I (4,08 mg / ml), 38,4 ul 10x M199, et 1,15 pi 5 M NaOH. </li><li> Pipeter 20 ul de ce gel de collagène dans les puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 384 puits. Placer la plaque dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 30 min. </li><li> Ajouter 80 ul DMEM à chaque puits et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Retirez le milieu de culture et répéter deux fois plus. </li><li> Après le rinçage final, ajouter 80 ul 10% de FBS / DMEM à chaque puits et incuber pendant la nuit à 37 ° C. Supprimer le milieu de culture avant l&#39;addition des cellules isolées. </li></ol> 3. Accise et de digérer le Cœur <ol><li> Euthanasier une souris timed-enceinte au jour embryonnaire désirée à l&#39;aide d&#39;une technique d&#39;euthanasie approuvé. Toutes les expériences ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation à l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. </li><li> Avec la souris en position couchée, généreusement pulvériser la face ventrale de la femelle à l&#39;éthanol 70% avantdissection. En utilisant une pince pour soulever la peau de l&#39;abdomen inférieur et le muscle à l&#39;écart des organes internes, coupé ouvrir la cavité abdominale inférieure de la femelle de visualiser les organes internes. </li><li> En tenant le col de l&#39;utérus avec une pince, découpez soigneusement caudale à la pince de levage et de commencer la corne utérine de la cavité abdominale. Tout en soulevant la corne utérine, couper n&#39;importe quel tissu conjonctif qui tient la corne en place. Pour finir exciser la corne utérine, couper la jonction de la corne utérine avec l&#39;oviducte pour libérer la corne utérine. </li><li> Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri contenant froid 1x saline tamponnée au phosphate (PBS) et rincer si nécessaire. Couper la corne utérine via la ligne médiane pour exposer les sacs embryonnaires joints. </li><li> Couper un sac embryonnaire à la jonction du placenta et de l&#39;embryon pour éviter de couper accidentellement l&#39;embryon et récupérer un embryon. Placez l&#39;embryon dans une seconde boîte de Pétri avec du PBS froid. Retourner la boîte de Pétri avec la corne utérine à la glace. </li><li> Decapitate l&#39;embryon pour améliorer l&#39;accès à la paroi thoracique. Si génotypage est nécessaire, couper la queue pour enlever et sauver dans un tube Eppendorf placé sur la glace. </li><li> Avec l&#39;embryon sur le dos, couper ouvrir la cage thoracique pour visualiser le cœur et les poumons. Pour éviter de couper le cœur, faire une coupe verticale sur le côté de la cage thoracique, près d&#39;une patte avant, suivi par une coupe horizontale à travers le bas des côtes, puis tirez doucement sur la paroi thoracique et hors de la voie. Up par jour environ 13,5 embryonnaire, la paroi thoracique est transparent, facilitant la visualisation. </li><li> Soulevez délicatement le cœur à l&#39;aide des pinces et couper les vaisseaux ci-dessous. Ensuite, coupez au-dessus des grands vaisseaux de libérer le cœur. Si les vaisseaux pulmonaires ne sont pas coupés, les poumons peuvent être enlevées avec le coeur. Ainsi, enlever les tissus extérieurs, comme les poumons, le cas échéant. </li><li> Séparez et jeter les vaisseaux oreillettes et des ventricules grand. Avec des ciseaux, émincer les ventricules en petits morceaux (environ 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) et placer dans environ 500 pi collagénase (1 mg / ml dans du PBS stérile). Conserver les échantillons sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les ventricules ont été hachées et placées dans la collagénase. </li><li> Répétez les étapes précédentes jusqu&#39;à ce que les ventricules ont été supprimés de tous les embryons, la collecte de chaque cœur dans un tube Eppendorf séparé. Si tous les embryons ont le même génotype, coeurs peuvent être regroupés dans un seul tube Eppendorf. Le nombre d&#39;échantillons traités en une seule fois peut être limité en fonction de l&#39;aimant utilisé pour l&#39;isolation, la DynaMag (123-21D) utilisé ici est titulaire d&#39;un maximum de 16 tubes Eppendorf. </li><li> Placez les ventricules hachés à 37 ° C avec des rocking pendant 45 min. Toutes les 15 min, retirez délicatement les échantillons et la pipette de haut en bas de dissocier mécaniquement les cellules. </li></ol> 4. Isoler les cellules endothéliales <ol><li> Faire passer la solution ventricule collagénase travers un filtre pour éliminer les agrégats de cellules restantes 70 um. </li><li> Centrifuger les cellules à 400 g pendant 10 min. Jeterle surnageant, remplacer avec environ 200 pi 10% de FBS dans DMEM, et la pipette de haut en bas pour dissocier les cellules. </li><li> Répétez l&#39;étape précédente fois. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 10 min après le second 10% de FBS / DMEM laver. Reprendre les cellules dans 50 ul 10% de FBS / DMEM. </li><li> Pendant l&#39;étape de centrifugation finale, préparer les perles. <ol><li> Placer le tube Eppendorf contenant l&#39;anticorps et des perles sur un aimant pendant 1 min. </li><li> Avec le tube en place sur l&#39;aimant, éliminer le surnageant. Retirer le tube de l&#39;aimant et ajouter environ 100 pi 10% de FBS / DMEM. </li><li> Placer le tube sur l&#39;aimant pendant 1 min. Retirer le surnageant et laver de nouveau avec 10% de FBS / DMEM. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 lavages. </li><li> Après le lavage final, remettre en suspension les perles d&#39;anticorps conjugués à 10% de FBS / DMEM (5 pi par exemple). </li></ol></li><li> Pour chaque échantillon de cellules, ajouter 5 pi des perles d&#39;anticorps conjugués. Placez les suspensions de billes cellules à 4 ° C avec bascule foR 30 min. </li><li> Sous une hotte à flux laminaire, placer les tubes Eppendorf contenant des cellules et des billes-anticorps conjugués sur l&#39;aimant pendant 1 min. Retirer le surnageant, retirez les tubes de l&#39;aimant, et laver avec environ 100 pi 10% de FBS / DMEM. Répétez l&#39;opération pour 5 lavages. </li><li> Après le dernier lavage, placez les tubes sur l&#39;aimant pendant 1 minute, retirer le surnageant, et retirez les tubes de l&#39;aimant. Ajouter environ 100 ul DMEM. </li><li> Placer les tubes sur l&#39;aimant pendant 1 minute, retirer le surnageant, et retirez les tubes de l&#39;aimant. Ajouter 100-200 ul préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA. Incuber les échantillons à 37 ° C et 5% CO2 pendant 5 min. </li><li> Placer les tubes sur l&#39;aimant pendant 2 min. Soigneusement transférer le surnageant contenant les cellules dans des tubes Eppendorf. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. </li><li> Eliminer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 80 à 100 ul de milieu de croissance et de la plaque dans un 96 - ou 384 puits boîte de culture traitée, en fonction du rendement attendu(Environ 450-600 cellules des ventricules E14.5-E16.5 embryons). Pour les cellules endothéliales, en utilisant un milieu de culture de croissance de l&#39;endothélium (défini ci-après). </li></ol>

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<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Travailler avec des cellules embryonnaires primaires permet des expériences nouvelles pour traiter in vitro étapes critiques du développement. Toutefois, la procédure d&#39;isolement n&#39;est pas anodin. Les étapes critiques pour isoler un type de cellules comprennent veillant à ce que les cellules sont bien séparés par digestion par la collagénase, puis qu&#39;ils sont bien en suspension au cours des étapes de lavage. Dissection mécanique par pipetage contribue grandement séparer les cellules lors de l&#39;ét...

L&#39;avènement de lignées cellulaires immortalisées a révolutionné la biologie cellulaire de base 1. Les lignées cellulaires actuellement disponibles sont issus d&#39;un large éventail d&#39;organes et englobent tous les principaux types de cellules. Cependant, les lignées cellulaires établies ont certaines limites. Le processus d&#39;immortalisation change évidemment le comportement des cellules, en particulier en ce qui concerne la durée de vie et la prolifération, mais peut également affecter l&#39;expression des protéines inattendus, tels que les protéines du cytosquelette 2. En outre, bien que de nombreuses lignées cellulaires différentes sont disponibles, il ya une diversité importante chez un même type de cellule unique dans un organisme entier. Les cellules endothéliales en particulier montrent divers comportements selon qu&#39;elles ligne artères ou des veines et quel type de flux est présent dans la cuve 3. Encore plus pressant dans une perspective développementale, cependant, est que la grande majorité des lignées cellulaires disponibles sont dérivées de tissus adultes (voir, par exemple til collecte disponible via ATCC). Ces lignées de cellules adultes susceptibles ne récapitulent la nature dynamique de leurs précurseurs embryonnaires. L&#39;évolution rapide des modes d&#39;expression des gènes au cours du développement spatio-temporelles observées suggèrent également qu&#39;une cellule endothéliale d&#39;un organe à un stade de développement donné peut ne pas se comporter de la même manière qu&#39;une cellule endothéliale de ce même organe à un stade de développement différent. Comme alternative à l&#39;utilisation de lignées cellulaires immortalisées disponibles dans le commerce, les cellules primaires peuvent être isolées à partir du tissu d&#39;intérêt spécifique. Parmi les avantages de cette technique, ces cellules primaires peuvent être isolés à partir d&#39;un organe spécifique ou même une partie d&#39;un organe à n&#39;importe quel stade de développement spécifique. En outre, ces cellules primaires peuvent être isolés de la grande variété d&#39;animaux transgéniques disponibles, permettant l&#39;étude in vitro des huitièmes de finale de gènes et knock-in tout en évitant d&#39;autres problèmes tels que l&#39;efficacité de la transfection in. Sans surprise, de nombreuxtechniques ont été publiés en détail comment isoler des types cellulaires spécifiques 4,5. En général, ces techniques consistent à recueillir la région d&#39;intérêt, dissocier les cellules, le marquage du type de cellule spécifique d&#39;intérêt, et d&#39;isoler ces cellules pour une analyse ultérieure. Pour étudier une population embryonnaire précoce des cellules endothéliales coronaires, on ramenait une technique 4 précédemment publié pour être utilisé avec un organe plus petit. Avec cette procédure allégée, nous pouvons isoler les cellules endothéliales coronaires du cœur embryonnaire à des stades embryonnaires spécifiques. Ces cellules peuvent ensuite être utilisés dans des essais endothéliales traditionnelles, telles que les analyses de migration. Jusqu&#39;à ce que les lignées cellulaires embryonnaires deviennent plus nombreux, en collaboration avec les cellules primaires est une technique précieuse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Timed-pregnant</td><td></td><td></td><td>micelles À disséquer au stade embryonnaire d’intérêt</td></tr><tr><td>Anti-souris CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagène</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagénase, type I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des cellules endothéliales</td> <td>(fabriqué en laboratoire comme décrit dans les notes)</td><td></td><td>DMEM contenant 20 % FBS, 5 &mu ; M &#946 ;-mercapt&#8211 ; thanol, 50 &mu ; g/ml ECG, et 1x pénicilline/streptomycine</td></tr><tr><td>&#946 ;-mercapt&#8211 ; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS Biomedical</td><td>Technologies, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à 384 puits</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>La plaque a été préparée avec un gel de collagène fin, comme décrit dans 6 ; surface de travail 10 mm2</td></tr><tr><td>Collagène de type I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Utilisation lors d’une finale concentration de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Utilisé comme indiqué dans 13 <</td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td></td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

La culture cellulaire a grandement amélioré notre capacité à évaluer les différentes populations de cellules dans des conditions de culture innombrables. Alors que des lignées cellulaires immortalisées offrent des avantages significatifs pour leur facilité d&#39;utilisation, ces lignées cellulaires ne sont pas disponibles pour tous les types cellulaires potentiels. En isolant les cellules primaires à partir d&#39;une région d&#39;intérêt, en particulier à partir d&#39;une souris transgénique, des études plus nuancées peuvent être effectuées. La technique de base consiste à disséquer l&#39;organe ou partielle d&#39;intérêt (par exemple le cœur ou une région spécifique du cœur) et dissocier l&#39;organe de cellules individuelles. Ces cellules sont ensuite incubées avec des billes magnétiques conjuguées avec un anticorps qui reconnaît le type de cellule d&#39;intérêt. Les cellules d&#39;intérêt peuvent alors être isolées à l&#39;aide d&#39;un aimant, par une courte incubation de la trypsine dissocier les cellules à partir des perles. Ces cellules isolées peuvent alors être cultivées et analysées comme vous le souhaitez. Cette technique a été conçu à l&#39;origine pour orgue de souris adultes, mais peut être facilement réduite pour une utilisation avec les organes embryonnaires, comme le démontre le présent document. Parce que notre intérêt est dans le système vasculaire coronarien développement, nous avons voulu étudier cette population de cellules embryonnaires au cours des étapes spécifiques. Ainsi, le protocole initial a dû être modifié pour être compatible avec la petite taille des ventricules embryonnaires et le faible rendement potentiel des cellules endothéliales à ces stades de développement. En utilisant cette approche à échelle réduite, nous avons évalué coronaire remodelage plexus dans les cellules endothéliales transgéniques ventriculaires embryonnaires.

En utilisant un anticorps spécifique de l&#39;endothélium qui reconnaît CD31, les cellules endothéliales ont été isolés à partir des ventricules embryonnaires (E) 13,5 (figure 1A) et 18.5 (figures 1B-1D) embryons. Lorsqu&#39;il est cultivé sur une boîte de culture traitée, ces cellules restent arrondis et pourraient former un motif de pavés si près de confluence (figure 1A). Diluer collagène a également été utilisé pour recouvrir les puits, et tandis que les cellules en...

La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l&#39;analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d&#39;embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les cellules endothéliales ventriculaires embryonnaires. Cela est réalisé en récupérant d'abord un embryon pour la dissection. Ensuite, le cœur est excisé.Les atri sont retirés et les ventricules hachés sont transférés dans une solution de collagène. La suspension de cellules individuelles est ensuite incubée avec un anticorps qui reconnaît les cellules endothéliales. Enfin, un aimant est utilisé pour isoler les cellules endothéliales liées à l'anticorps.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la formation de chaînes endothéliales par microscopie en champ clair. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement cardiovasculaire, comme quels facteurs favorisent la migration endothéliale coronaire. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le comportement des cellules endothéliales, elle peut également être appliquée à d'autres types cellulaires tels que les myocytes et les fibroblastes. La veille de la réalisation de la dissection, en travaillant sous hotte de culture cellulaire, associez l'anticorps choisi aux billes dyna appropriées en suivant les instructions du fabricant pour l'anticorps anti-CD 31 de rat utilisé ici.Trois microlitres d'anticorps sont ajoutés à 25 microlitres de billes pour une concentration finale de 1,5 microgramme dans 10 puissance sept billes ; incuber les billes avec l'anticorps toute la nuit à quatre degrés Celsius afin de préparer des gels de collagène pour la formation rapide de tubules à partir de cellules isolées dans une hotte de culture tissulaire sur de la glace. Combiner la collagène de type I, l'eau stérile, le 10 X M 199 et l'hydroxyde de sodium 5 molaire. Selon le protocole décrit, pipeter 20 microlitres du gel de collagène dans les puits d'une plaque de culture tissulaire de 384 puits.Placer la plaque dans une étuve à culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter 80 microlitres de DMM dans chaque puits et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Retirer le milieu de culture et répéter le lavage deux fois supplémentaires ; après le rinçage final, ajouter 80 microlitres de DM contenant 10 % de FBS dans chaque puits et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius.Après avoir euthanasié une souris gestante à un jour embryonnaire déterminé, utilisez une technique approuvée pour retirer la corne utérine conformément au protocole décrit, puis placez-la dans une boîte de Pétri contenant un XPBS et rincez-la. Une fois les poches embryonnaires exposées par une incision médiane au niveau de la jonction entre le placenta et l'embryon, ouvrez une poche embryonnaire et récupérez l'embryon.Placer l'embryon dans une deuxième boîte de Pétri contenant du PBS froid et remettre la corne utérine sur de la glace afin d'améliorer l'accès à la paroi thoracique pour décapiter l'embryon. Si un génotypage est prévu, couper la queue et la conserver dans un tube placé sur de la glace. Placer l'embryon sur le dos et inciser.Ouvrir la paroi thoracique pour visualiser le cœur et les poumons afin d'éviter de couper le cœur. Effectuer une incision verticale le long du côté de la cage thoracique près d'un membre postérieur, suivie d'une incision horizontale au niveau de la partie inférieure des côtes. Ensuite, soulever délicatement la paroi thoracique vers le haut et sur le côté jusqu'à environ le jour embryonnaire 13,5.La paroi thoracique est transparente, ce qui facilite la visualisation. À l’aide de pinces, soulevez délicatement le cœur et sectionnez les vaisseaux en dessous. Si nécessaire, transférez le cœur dans un plat propre pour le séparer des poumons, puis sectionnez au-dessus des gros vaisseaux.Ensuite, séparez et éliminez les oreillettes et les gros vaisseaux des ventricules. Puis, à l’aide de ciseaux, hachez finement les ventricles en petits morceaux et placez-les dans environ 500 microlitres de collagénase sur de la glace. Disséquez et traitez les ventricules des embryons restants, en recueillant chaque cœur dans un tube séparé.Placer les ventricules hachés à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 45 minutes. Toutes les 15 minutes, retirer délicatement les échantillons et pipeter plusieurs fois pour dissocier mécaniquement les cellules. Après l'incubation, faire passer la solution de collagénase des ventricules à travers un filtre de 70 micromètres afin d'éliminer les agrégats cellulaires résiduels, centrifuger les cellules à 400 ×g pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et le remplacer par environ 200 microlitres de DMEM contenant 10 % de FBS, puis pipeter plusieurs fois pour resuspendre les cellules. Centrifuger à nouveau les cellules, puis effectuer un second lavage et une nouvelle centrifugation. Resuspendre finalement les cellules dans 50 microlitres de DMEM contenant 10 % de FBS.Ensuite, préparez les billes en plaçant d'abord le tube contenant l'anticorps et les billes sur un aimant pendant une minute, puis aspirez le surnageant. Retirez ensuite le tube de l'aimant et ajoutez environ 100 microlitres de FBS à 10 % dans du dmm. Replacez le tube sur l'aimant pendant une minute, puis éliminez le surnageant.Répétez le lavage un total de trois fois après le lavage final. Resuspendez les billes couplées à l'anticorps dans du DMM contenant 10 % de FBS pour chaque échantillon cellulaire, ajoutez cinq microlitres des billes couplées à l'anticorps. Incubez les suspensions cellulaires avec les billes à quatre degrés Celsius sous agitation pendant 30 minutes dans une hotte à flux laminaire, placez les échantillons sur l'aimant pendant une minute, puis aspirez le surnageant.Retirez les tubes de l'aimant et lavez-les avec environ 100 microlitres de FPS à 10 % et dm. Répétez l'opération pour un total de cinq lavages après le dernier lavage. Suspendez les billes dans environ 100 microlitres de DMEM.Placez les tubes sur l'aimant pendant une minute. Éliminez le milieu, puis ajoutez de 100 à 200 microlitres de trips préchauffé à 0,25 % dans l'EDTA, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Placez les tubes sur l'aimant pendant deux minutes.Ensuite, transférez soigneusement la cellule contenant le surnageant dans des tubes neufs et centrifugez-les pendant cinq minutes à 400 ×g. Enfin, après avoir éliminé le surnageant, resuspendez les cellules dans 80 à 100 microlitres de milieu de croissance endothélial et effectuez la mise en culture. Dans une plaque de culture traitée de 96 ou 384 puits, selon le rendement attendu, chaque paire de ventricules provenant d'embryons de E 14,5 à E 16,5 donne typiquement entre 450 et 600 cellules, comme le montre ici l'utilisation d'un anticorps spécifique des cellules endothéliales reconnaissant CD 31. Les cellules endothéliales ont été isolées à partir des ventricules d'embryons de jour E 13,5.Lorsqu'elles sont cultivées dans une boîte de culture non traitée, ces cellules restent arrondies et forment un motif en pavé lorsqu'elles sont proches de la confluence. Bien que les cellules adhèrent aux plaques recouvertes de collagène dilué, les cellules isolées des ventricules d'embryons E 18,5 forment moins de chaînes sur ces plaques que sur un gel de collagène. En outre, les cellules établissent plus rapidement des interactions cellule-cellule et forment des chaînes, ainsi que des ramifications, sur le gel de collagène par rapport à la plaque recouverte de collagène, ce qui confirme leur identité.Les cellules de cette figure sont marquées positivement avec le marqueur endothélial ISO-sélectine. De plus, comme indiqué ici, les cellules endothéliales isolées des ventricules d’un embryon E 18,5 se sont révélées positives pour les marqueurs endothéliaux PAM et flick one. Cette figure montre des cellules endothéliales isolées des ventricules d’un embryon E 14,5 et marquées avec le colorant spécifique aux cellules endothéliales, cyto.16 cellules isolées survivent jusqu'à une culture affaiblie, mais sont résistantes à l'immortalisation et sont donc particulièrement adaptées aux expériences terminales. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures et demie si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, d'autres tests, tels que les essais de formation de tubes et les essais de migration en transwell, peuvent être réalisés afin de déterminer le comportement de ces cellules isolées in vitro.

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