Construction de tableaux Microdrive pour les enregistrements de neurones chroniques chez la souris Behaving Awake

La conception et l'assemblage de micromoteurs pour des enregistrements électrophysiologiques in vivo des signaux du cerveau de la souris est décrite. En attachant des faisceaux de microélectrodes aux transporteurs carrossables robustes, ces techniques permettent des enregistrements de neurones à long terme et stable. Le design léger permet une performance comportementale sans restriction par l'animal implantation d'entraînement suivant.

L’objectif global de cette procédure est de construire un micro-lecteur qui peut être utilisé pour les enregistrements cérébraux chez les souris pendant qu’elles se déplacent librement dans une chambre expérimentale. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord un faisceau de quatre microélectrodes dans un tede. La deuxième étape consiste à construire la base du micro-variateur et à assembler les composants du variateur.

Ensuite, les tetros sont fixés au lecteur et sont connectés à des broches dorées. La dernière étape consiste à dorer la pointe du tetros pour réduire leur impédance et assurer des enregistrements signal/bruit élevés. En fin de compte, les réseaux de micro-entraînements chroniques sont utilisés pour enregistrer l’activité neuronale de populations de neurones, ainsi que de neurones uniques chez les animaux éveillés.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une solution d’ondes lumineuses assez peu coûteuse pour les enregistrements cérébraux chroniques chez la souris et d’autres petits mammifères. Cette technologie peut résoudre des problèmes clés dans le domaine des neurosciences, tels que la façon dont les neurones codent l’information lors de l’exécution de tâches comportementales. Nous utilisons régulièrement cette technique pour enregistrer à partir de neurones de l’hippocampe dorsal et de l’ulu, mais nous l’avons également utilisée pour cibler des structures plus profondes telles que l’amygdale.

La démonstration visuelle de cette méthode est cruciale car la construction et la partie d’assemblage sont difficiles à apprendre, et aussi parce qu’il s’agit de pièces très petites et délicates pour commencer la fabrication de tetro. Pour l’hippocampe, coupez 30 centimètres de fil de platine iridium isolé de 12,5 micromètres de diamètre, pliez le fil deux fois pour former quatre fils parallèles de 7,5 centimètres de long chacun. Ensuite, fixez un clip recouvert de caoutchouc près du bas du fil drapé et fixez-le au cône tetro motorisé, en vous assurant que le fil est tendu mais pas trop tendu ou que le poids du porteur est cela le fera casser.

Pendant le processus de filage, appliquez 80 rotations dans le sens des aiguilles d’une montre pour enrouler le tero, suivies de 20 rotations dans le sens inverse des aiguilles d’une montre afin de relâcher la tension. Le nombre final de rotations par longueur de fil doit être de huit rotations par micron. Ensuite, réglez le pistolet thermique à 400 degrés Celsius et utilisez-le pour fusionner les fils ensemble.

Faites passer le pistolet thermique de haut en bas sur toute la longueur des fils pendant cinq secondes, en le maintenant à environ deux centimètres du fil à tout moment. Pour faire fondre doucement le revêtement de liaison VG sur les fils, coupez le haut du téro pour former quatre fils séparés, puis relâchez l’extrémité inférieure du clip. Placez le tero terminé dans une boîte de conservation sans poussière pour le ranger jusqu’à ce que le disque soit terminé.

Tout d’abord, construisez la base du micro-lecteur en ponçant un morceau carré de 20 millimètres d’acrylique plexiglas de cinq millimètres d’épaisseur dans une forme qui permettra à la souris de se déplacer librement avec le lecteur après son implantation sur la tête. Ensuite, soudez perpendiculairement deux guides en laiton de 3,3 x 6,3 millimètres. Le guide vertical en laiton maintiendra la vis d’entraînement et les électrodes tandis que la pièce horizontale sera collée dans la base en acrylique.

Ensuite, commencez l’assemblage du lecteur lui-même en passant une vis de poitrine à tête de remplissage à travers le haut du guide et dans un bloc en plastique delrin. Enfilez un sein hexagonal non sur la vis jusqu’à ce que l’écrou touche presque le bas du guide. Cependant, ne le serrez pas complètement.

Au lieu de cela, faites fondre une petite quantité de soudure afin d’assembler l’écrou et la vis. Mais attention à ne rien souder au guide. La rotation de la vis doit déplacer le bloc de delrin dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre verticalement le long du filetage.

Une fois le lecteur assemblé, retournez à la base en acrylique et découpez une fente de trois millimètres de large où se trouvera le lecteur d’électrode. Passez ensuite le guide de soutien-gorge horizontal à travers la fente, puis utilisez de la colle Sano ACRL pour fixer la pièce à la base. Ensuite, placez une carte d’interface électronique sur le dessus de la base et pour marquer l’emplacement des deux trous de vis à l’aide d’une perceuse à pointe de 1,5 millimètre, percez soigneusement des trous au niveau des marques pour les vis qui maintiendront l’EIB en place sur le dessus de la base.

Vissez ensuite deux vis de poitrine dans les trous. Utilisez des ciseaux de micro-dissection pour couper quatre morceaux de tube en polyamide de sept millimètres de long. Alignez-les l’un à côté de l’autre sur un morceau de ruban de laboratoire plié et appliquez du sano ACRL pour les assembler.

Prévoyez suffisamment de temps pour que les tubes de joint sèchent complètement. Ensuite, tamponnez soigneusement une petite quantité de cyanoacrylate sur le visage du delrin. Placez ensuite les quatre tubes de joint sur la colle.

Encore une fois, laissez suffisamment de temps pour que la colle prenne complètement avant d’essayer de déplacer le lecteur. Vérifiez que les tubes en polyamide sont solidement fixés et que l’ensemble se déplace en douceur sans toucher le guide ni rencontrer de résistance. Ensuite, préparez la vis de terre et connectez le fil de terre à la BEI comme décrit dans le protocole texte ci-joint.

Connectez le tetros et/ou les électrodes simples à l’EIB en faisant d’abord passer les fils à travers le tube en polyamide, en leur permettant de s’étendre d’au moins deux millimètres au-delà de l’extrémité du tube. Appliquez ensuite une petite goutte de cyanoacrylate, en fixant le fil sur le tube et en empêchant tout mouvement du fil. Ensuite, connectez les extrémités libres du tero ou d’autres fils à un trou de canal EIB à l’aide d’une broche dorée.

Enfin, coupez tout excès de fil avec les ciseaux fins indiqués. Voici des exemples d’autres configurations de disques qui peuvent être construites pour cibler différentes régions du cerveau. Pour commencer l’inverse, composez l’assemblage du lecteur.

Coupez le tube en polyamide à 10 millimètres et guidez-le à travers le plus petit trou d’un support tetro jusqu’à ce qu’il dépasse de 0,5 millimètre l’extrémité. Ensuite, époxy le tube en polyamide en place et répétez ces étapes pour les trois autres tubes et supports. Une fois que l’époxy a complètement pris.

Guidez chaque tube en polyamide à travers l’un des quatre trous de la base d’entraînement Versa. Enfoncez ensuite une épingle à insectes dans le trou extérieur. Cela maintiendra le transporteur tetro en ligne et servira de rail sur lequel le transporteur pourra voyager.

Répétez cette opération pour les trois autres transporteurs. Ensuite, prenez un capuchon et alignez-le avec les quatre épingles à insectes de sorte que le capuchon recouvre la base et que les transporteurs de téro résident à l’intérieur du capuchon. Vissez une vis à métaux d’un millimètre sur cinq millimètres dans le trou approprié du capuchon et dans le support de téro.

Répétez cette opération pour les trois autres vis. Tournez toutes les vis dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que les supports tetro soient en position supérieure et que les tubes en polyamide soient visibles à travers l’ouverture du capuchon. À l’aide de fines ciseaux de micro-dissection, coupez le tube juste en dessous de la base de manière à ce que les quatre tubes en polyamide soient de la même longueur.

Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, enfilez soigneusement le tetros dans les tubes en polyamide et fixez-les en place avec une petite goutte d’ano. Coupez ensuite les tetros de manière à ce qu’ils ne dépassent que de 2,0 millimètres les tubes. Avant de connecter les fils tero aux prises en or.

Tout d’abord, connectez les fils de terre au capuchon. Ensuite, guidez tous les fils de téro lâches à travers leurs trous de réceptacle respectifs sur le capuchon et installez le capuchon en alignant les trous des broches à insectes et en appuyant sur le raccord à la base. Enfin, coupez tout excès de fil qui dépasse du haut du capuchon.

Tournez d’abord les vis du micro-entraînement dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à leur position la plus basse. Montez ensuite solidement le micro-entraînement sur une pince qui permettra d’abaisser les pointes des électrodes dans la solution de placage or. Remplissez une tour de delrin avec une solution d’or CCO et l’autre tour avec de l’eau distillée et abaissez les pointes des électrodes dans la solution d’or.

Ensuite, ouvrez le programme Nano Z et cliquez sur DC electroplate. Réglez le mode pour qu’il corresponde aux impédances, au courant de placage à moins 1,0 microampères et à la cible à 350 kilo-ohms à 1004 hertz. Ensuite, réglez-le pour qu’il s’exécute cinq fois à cinq secondes d’intervalle avec une pause de deux secondes entre chaque exécution.

Une fois le programme configuré, cliquez sur plaque automatique, le programme lira d’abord l’impédance de chaque canal. Appliquez ensuite le courant spécifié à ce canal, testez à nouveau l’impédance et appliquez le courant si nécessaire jusqu’à ce que l’impédance cible ou une valeur inférieure soit atteinte. Si l’impédance descend en dessous de 100 kilo-ohms, inversez la polarité du courant à 1,0 microampères pour éliminer les particules d’or en excès, puis répétez la galvanoplastie. Les valeurs d’impédance finales typiques sur un faisceau de quatre fils de 12,5 micromètres varient de 150 à 325 kilo-ohms.

Une fois que tous les canaux ont été plaqués à un niveau d’impédance acceptable, fermez le programme Nano Z et déconnectez l’appareil. Ensuite, soulevez les électrodes de la solution de placage et abaissez les pointes dans la tour de delrin d’eau distillée pour rincer les particules d’or en excès. Les ulu dorsaux sont montrés ici.

Les quatre canaux illustrés dans la partie A sont un exemple de signal mal mis à la terre qui se traduit par des valeurs saturées et des signaux extrêmement bruyants. Les quatre canaux illustrés dans la partie B, cependant, sont un bon exemple d’un signal bien ancré avec des oscillations de réseau clairement visibles dans la gamme thêta de quatre à 12 hertz. Sur la gauche, un exemple d’un mauvais enregistrement de Tero.

Étant donné que les quatre fils d’électrodes ont enregistré des formes d’onde de pointe essentiellement identiques, plus d’un millier de formes d’onde de pointe individuelles ont été superposées les unes sur les autres pour chaque canal du téros. Ce motif était probablement dû à la fusion des fils pendant l’étape de fusion de l’isolant de la fabrication du téro, ce qui a fait que le faisceau de fils a agi efficacement comme une seule électrode d’enregistrement. Sur la droite, un exemple d’un bon enregistrement tetro montrant des formes d’ondes de pointe superposées à partir d’une unité putative avec différentes amplitudes sur les quatre fils tede.

Ce type de modèle d’enregistrement de pointes permet d’améliorer la discrimination des unités lors du clustering et de la séparation hors ligne ultérieurs. Après avoir construit cette micro-plongée, il est important de tester chacun de vos canaux d’électrodes et de vous assurer qu’ils se trouvent dans une plage d’impédance appropriée avant de passer à la chirurgie d’implantation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez vous sentir à l’aise pour construire des teros et des variateurs de micro-électrodes pour une implantation chronique chez la souris.

Bonne chance pour construire vos disques et amusez-vous avec vos expériences.