Name: Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Découvrez une méthode de biosenseurs à phages lytiques pour différencier les souches MRSA et MSSA de Staphylococcus aureus sans extraction d'ADN. Cette technique améliore le diagnostic clinique des infections bactériennes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les travaux rapportés ici ont été pris en charge par des subventions de l&#39;Université d&#39;Auburn AUDFS et USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle de l&#39;Armée de l&#39;Air des États-Unis, ministère de la Défense ou le gouvernement américain.

1. Préparer le terrain <ol><li> Obtenir souche de type S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051. Souches résistantes à la méthicilline de S. aureus - MRSA1, le SARM 2, le SARM 5, 13 SARM, le SARM 26, 34 SARM, le SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Le phage lytique 12600. </li><li> Obtenir PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées. </li><li> Préparer NZY moyen comme décrit 21. </li><li> Procurez-phosphate solution saline tamponnée (PBS). </li><li> Préparez de l&#39;eau déminéralisée comme sous-phase de Langmuir-Blodgett (LB) de dépôt de la monocouche. </li></ol> 2. Propagation de bactériophages et la titration <ol><li> Incuber 5 ml de culture de nuit de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unités formant colonies (UFC) / ml) avec 500 pi de phage (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; UFP / ml) dans 500 moyen de NZY ml à 2 L Flack sur agitateur-incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Centrifugeuse culture à 4,424 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Surnageant re-centrifugé à 11.325 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Surnageant filtrer à travers un filtre Millipore 0,22 um. </li><li> Centrifuger le filtrat à 75 395 g pendant 1,5 heures. </li><li> Dissoudre le culot dans 100 ul d&#39;eau distillée. </li><li> Préparer des dilutions de 10 fois de suspension de phages dans le milieu NZY. </li><li> Plaque 1 ml de culture de la nuit (ON) de S. aureus ATCC 12600 sur chacun des 2 plaques avec de l&#39;agar NZY pour s&#39;assurer que toute la surface est couverte. Enlevez l&#39;excédent de la culture et de laisser sécher la surface pendant 30 min. </li><li> Détecter un échantillon (10 ul) de la dilution appropriée de phage sur la surface de la plaque et incuber à 37 ° C pendant 18 à 24 h. </li><li> Examiner la formation de plaques et de calculer le titre des phages. Les titres bactériophages (T) sont estimés sur la base du nombre de pLaques (N) formé par le volume 10 ul (v) de la suspension de phages et le facteur de dilution (F). Le titre a été calculé par la formule:. T = N / (vxf) Par exemple, pour le nombre de plaques 75 à la dilution 10 -7 et le volume de 10 pi (10 x 10 -3 ml), le titre est égal 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 unités formant des plages (pfu) par ml de suspension. </li></ol> 3. Phage or immobilisé <ol><li> Morceaux de quartz revêtues d&#39;or propre (60 mm 2) par gravure plasma à l&#39;argon pendant 10 min, puis stériliser pendant 6 heures sous la lumière UV dans une armoire stérile. </li><li> Ajouter 50 microlitres de 1 x 10 9 PFU / ml suspension de phages à la surface d&#39;or de chaque pièce dans une boîte de Pétri stérile, puis incuber pendant la nuit dans une chambre humide à température ambiante. </li><li> Retirez et titrer la suspension de phages restant. </li><li> Lavez morceaux avec phages liés 5 fois avec du PBS pour éliminer non liéephage. </li></ol> 4. Test de Immobilisé infectiosité du phage sur une surface sèche <ol><li> Étaler une culture de la S. Aureus ATCC 12600 O / N sur une plaque de gélose NZY et laisser sécher. </li><li> Placer une pièce d&#39;or avec des phages immobilisés sur la face de la plaque vers le bas. </li><li> Respecter une zone de lyse après 12 heures d&#39;incubation à 37 ° C qui indique infectiosité. </li><li> Utilisez des morceaux couverts d&#39;or sans phage dans des expériences de contrôle. </li></ol> 5. Test de l&#39;activité lytique du phage libre et liée en liquide <ol><li> Ajoutez une culture de S. ON aureus ATCC 12600 à 10 ml de NZY dans tous les 300 ml de quatre flacons arme de poing (6 x 10 6 UFC / ml dans chaque flacon). </li><li> Ajouter dans deux fioles 2 x 10 6 pfu / ml de phage libre. </li><li> Utilisez les deux autres ballons comme témoins. </li><li> Surveiller l&#39;évolution temporelle de S. la lyse des cellules de Staphylococcus à 570 min par la mesure de la densité optique (OD 600) à intervalles de 30 min pour toutes les fioles.</li><li> Prendre une mesure finale à 24 h. </li><li> Répétez les étapes 5.1 à 5.5, mais utiliser des pièces d&#39;or avec des phages liés au lieu de phages libres, et des pièces d&#39;or sans phage dans des flacons de contrôle. </li></ol> 6. Perte de phages liés pendant l&#39;incubation <ol><li> Ajouter 50 pi de 1 x 10 9 PFU / ml phage sur la surface de pièce d&#39;or stérile dans une boîte de Pétri qui est placé dans une chambre humide pendant la nuit à température ambiante. </li><li> Retirez la suspension de phage non lié à la surface d&#39;or et le titre. </li><li> Laver la pièce d&#39;or avec phages liés 5 fois avec du PBS et les placer dans une solution à 1 NZY ml dans 15 ml tube dans un shaker-incubateur à 37 ° C pendant 8 heures. </li><li> Déterminer le titre du phage détaché comme décrit dans 2. </li></ol> 7. Phage Spheroids Préparation <ol><li> La combinaison de 400 pi de stock phage 12600 suspension (10 11 PFU / ml) avec un volume égal de chloroforme qualité spectrophotométrique dans 1 ml flaconà la température ambiante. </li><li> Doucement vortex la suspension de phages chloroforme 5-6 fois (intervalles de 5 secondes) sur une durée minute. </li><li> Laisse la suspension se stabiliser pendant 30 secondes et ensuite la pipette de la phase supérieure contenant sphéroïdes a été prélevée à la pipette pour la préparation de la monocouche. </li><li> Prendre quelques microlitres de la suspension des sphéroïdes pour la transmission et la microscopie électronique à balayage. </li><li> Utilisez une suspension sphéroïde restant pour la fabrication de biocapteurs. </li></ol> 8. Préparation biocapteur <ol><li> Nettoyer les capteurs QCM-D par gravure plasma à l&#39;argon pendant 10 min PDC-32G Harrick propre plasma. </li><li> Rincer capteur avec de l&#39;hexane pour éliminer les impuretés organiques. </li><li> Préparer et nettoyer une goulotte de l&#39;équilibre du film tel que décrit dans 22. </li><li> Remplissez creux LB avec une solution sous-phase et nettoyez-le avec une barrière de creux et de stabiliser le bac à 20 ± 0,1 ° C </li><li> Étaler 300 aliquote de phage 12600 en suspensi aqueusele (10 11 PFU / ml) sur subphase LB. </li><li> Préparer monocouche de phage sur une solution de sous-phase de LB en permettant à 300 aliquote de phage suspension aqueuse 12600 (10 11 PFU / ml) de descendre une tige de verre mouillable inclinée qui est partiellement immergé dans la sous-phase 22,23. </li><li> Stabiliser la monocouche préparé pendant 10 min, et ensuite le comprimer à une vitesse de 30 mm / min (45 cm 2 / min), jusqu&#39;à ce qu&#39;une pression constante de 19 N / m est atteinte. </li><li> Effectuer un dépôt de film sur la verticale positionnée perpendiculairement capteur QCM-D à une vitesse de 4,5 mm / min en trempant successivement capteur dans et hors de la monocouche sept fois. La microscopie électronique de dépôt de monocouches de phages avant l&#39;exposition à des échantillons bactériens ont montré que les couches étaient continu, homogène et uniforme (données non présentées). </li><li> Répétez les étapes 4,5-4,8 avec une suspension sphéroïde phage qui est préparé en 3. </li><li> Utilisez biocapteurs de phages fabriqués pour la détection de SARM, d&#39;électronsmicroscopie et ellipsométrie. </li></ol> 9. Test biocapteur, la discrimination de résistant à la méthicilline et bactéries Staphylococcus sensibles <ol><li> Dans ce protocole, les biocapteurs avec phage non modifié et modifié et sphéroïdes de phages sont préparés. Une microbalance à cristal de quartz avec les quatre chambres d&#39;écoulement de capteur est utilisé pour surveiller la liaison de bactéries au phage immobilisé sur la surface du capteur QCM. PBP 2a anticorps billes de latex conjugués sont utilisés pour discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Toutes les mesures sont effectuées en mode de débit (50 l / min) à 5 MHz. </li><li> Établir une fréquence de résonance de ligne de base du capteur QCM dans l&#39;eau (~ 30 min). </li><li> Dessiner une suspension de cellules vivantes sensibles à la méthicilline staphylococcus bactériens dans l&#39;eau (10 9 UFC / ml) à travers la cellule d&#39;essai. </li><li> Continue de surveiller les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation de l&#39;énergie pour la première harmonique, using le logiciel Q-Soft. </li><li> Lorsque les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation atteint des niveaux de saturation, ajouter la suspension de PBP anticorps billes de latex conjuguées (6,77 x10 10 billes / ml) à la circulation au cours de la surveillance continue de la fréquence et de la dissipation. </li><li> Répétez les étapes 9.2-9.5 pour résistant à la méthicilline cellules bactériennes méthicilline (SARM). </li><li> Définir un changement de fréquence à travers la variation de la masse dues à des bactéries de liaison par l&#39;équation Sauerbrey 24,25 Af = xn-Δm / C, où C est la sensibilité masse constante (C = 17,7 ng x cm -2 x -1 Hz à 5 MHz ), m est la masse, et n est le nombre d&#39;harmonique (n = 1). </li><li> Définir un changement de dissipation d&#39;énergie (Δ D) à partir de l&#39;enregistrement de la décroissance exponentielle de l&#39;oscillation (la fréquence et de l&#39;amplitude d&#39;amortissement, ce qui a permis la quantification de l&#39;énergie dissipée et stockée pendant une période d&#39;oscillation,E dissipée et E stocké, respectivement: Δ D = E dissipée / 2 πE stocké. Δ D est mesuré en unités de dissipation (UA), l&#39;un = 10 -6 unités relatives UA). </li></ol>

<ol><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+lytic+phage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).</li>
<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+methicillin+resistant+and+sensitive+strains+of+Staphylococcus+aureus+using+tandem+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements.</a> J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).</li>
<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Langmuir+monolayers+and+Langmuir-Blodgett+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces%2C+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films.</a> Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).</li>
<li>Barie, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-resistant+gram-positive+cocci%3A+implications+for+surgical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22World.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice.</a> World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).</li>
<li>Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiologic+analysis+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Korean+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens.</a> J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).</li>
<li>Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+of+Staphylococcus+aureus+from+lower+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yiyuanganranxue+Zazhi%22%5BJournal%5D)">Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract.</a> Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).</li>
<li>Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin+resistant%27+Staphylococcus+aureus+infections+during+1978-79%3A+clinical+and+bacteriologic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations.</a> J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).</li>
<li>Knopf, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+caused+by+multiresistant+pathogens.+Clinical+management+exemplified+by+multiresistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Urologe+A%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus.</a> Urologe A. 36, 248-254 (1997).</li>
<li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+differential+inoculum+disk+diffusion+method+and+Vitek+GPS-SA+card+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).</li>
<li>Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapid+ATB+Staph+for+5-hour+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).</li>
<li>Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MicroScan+rapid+gram-positive+panels+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).</li>
<li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+BBL+crystal+MRSA+ID+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of BBL crystal MRSA ID system.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).</li>
<li>Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+Crystal+MRSA+ID+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).</li>
<li>Zambardi, G., Fleurette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+multicentre+evaluation+of+a+commercial+system+for+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).</li>
<li>Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin+resistance+in+staphylococci%3A+molecular+and+biochemical+basis+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).</li>
<li>Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+laboratory+diagnosis+and+susceptibility+testing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).</li>
<li>Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+conventional+susceptibility+tests+with+direct+detection+of+penicillin-binding+protein+2a+in+borderline+oxacillin-resistant+strains+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+%26+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).</li>
<li>Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+phage+as+a+specific+and+selective+probe+for+detection+of+Staphylococcus+aureus-A+surface+plasmon+resonance+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).</li>
<li>Popham, D. L., Young, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+penicillin-binding+proteins+in+bacterial+cell+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis.</a> Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).</li>
<li>Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+shape+determination+by+the+Bacillus+subtilis+class+B+penicillin-binding+proteins+encoded+by+pbpA+and+pbpH%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH.</a> J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).</li>
<li>Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+filamentous+phage+yield+during+computer-controlled+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).</li>
<li>Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+selective+biosensor+for+Salmonella+and+its+detection+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment.</a> J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).</li>
<li>Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+biosensor+for+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive biosensor for Salmonella.</a> Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).</li>
<li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quartz+oscillators+for+weighing+thin+layers+and+for+microweighing%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Phys%22%5BJournal%5D)">The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing.</a> Z. Phys. 155, 206-222 (1959).</li>
<li>Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Dissipation+Kinetics+for+Protein+and+Antibody-Antigen+Adsorption+under+Shear+Oscillation+on+a+Quartz+Crystal+Microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance.</a> Langmuir. 14, 729-734 (1998).</li>
<li>Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+bacteriophage+contract+into+hollow+spherical+particles+upon+exposure+to+a+chloroform-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface.</a> Cell. 23, 747-753 (1981).</li>
<li>Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Capture+Efficiency+and+Antimicrobial+Activity+of+Phage-Functionalized+Model+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces.</a> Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent%27+Reporter+Phage+for+the+Detection+of+Category+A+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. (53), e2740(2011).</li>
<li>Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+mass%22+effect+in+biosensor%27s+QCM+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Missing mass" effect in biosensor's QCM applications.</a> Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).</li>
<li>Gervals, L., Gel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+biotinylated+bacteriophages+on+biosensor+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%22%5BJournal%5D)">Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces.</a> Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).</li>
<li>Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+as+a+molecular+recognition+element+in+biosensors+immobilized+by+physical+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).</li>
<li>Sorokulova, I., Watt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+biopolymer+for+preservation+of+microorganisms+during+sampling+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage.</a> J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Il est bien connu que les phages peuvent être utilisés comme sondes de biocapteurs pour les bactéries pathogènes 28. Il est démontré dans ce travail que phage avec des anticorps 2a PBP peut être utilisé pour résoudre le vieux problème: les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques discrimination rapides. Il a été constaté cependant ces phages de staphylocoques non modifiés normales ne sont pas adaptés pour la détection des bactéries avec des dispositifs QCM, même si elles...

Souches résistantes à la méthicilline de Staphylococcus aureus ont été suggérés comme un facteur dans les infections et les épidémies nosocomiales essentielles 4-8. Les moyens ordinaires de la reconnaissance de la résistance à la méticilline, comme la diffusion test de disque d&#39;oxacilline d&#39;agar écran, ou microdilution, s&#39;appuient sur des conditions de culture adaptées pour améliorer l&#39;expression de la résistance. Les modifications comprennent l&#39;utilisation de l&#39;oxacilline, incubation à 30 ou 35 ° C plutôt qu&#39;à 37 ° C, et l&#39;ajout de NaCl dans le milieu de croissance. En outre, pour la détection correcte par ces types de techniques, une longue période d&#39;incubation de 24 heures au lieu de 16 à 18 heures est nécessaire. Techniques rapides avec le niveau approprié (&gt; 96%) de la sensibilité pour l&#39;identification de la résistance à la méticilline comprennent des techniques de microdilution automatisés tels que le Vitek carte GPS-SA, le système Rapid ATB Staph, et le système de panneau Microscan rapide qui produisent des résultats après 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA système ID est une méthode rapide basée sur la reconnaissance de la croissance de S. aureus, en présence de 2% de NaCl et 4 mg d&#39;oxacilline par litre avec un détecteur de fluorescence sensible à l&#39;oxygène. Sensibilités réclamés varient entre 91 à 100% après 4 h d&#39;incubation 12-14. Ces méthodes phénotypiques sont limités dans leurs exactitudes par l&#39;impact des souches prévalentes qui expriment la résistance hétérogène. Par conséquent, les méthodes les plus largement acceptée pour la reconnaissance de la résistance à la méticilline est l&#39;hybridation du gène mecA 15 PCR ou de l&#39;ADN. Cependant cette technique nécessite l&#39;ADN purifié et est extrêmement sensible à divers adjuvants (impuretés), qui comprennent 16 débris cellulaires. En outre, ces techniques ont besoin de temps pour réaliser. Stratégies pour la reconnaissance du produit du gène mecA, la protéine PBP 2a, pourraient être utilisés pour déterminer la résistance et peuvent être plus fiable par rapport aux techniques de test standard 17. de Staphylococcus aureus, y compris ceux ayant une résistance à la méthicilline 1,2,18. Dans ce travail, nous avons proposé une nouvelle technique dans la détection et l&#39;identification spécifique de SARM, comme la reconnaissance des bactéries avec conformation du SARM en temps réel. A cet effet, un spécifique S. bactériophage aureus avec un large spectre d&#39;hôtes (y compris les souches de SARM) combiné avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine (PBP 2a) ont été utilisés. PBP 2a est une protéine de paroi cellulaire et elle est la cause de la résistivité de l&#39;antibiotique SARM. Cependant anticorps 2a PBP n&#39;est pas spécifique à S. aureus depuis quelques autres bactéries ont des protéines de liaison aux antibiotiques avec une similarité de séquence PBP 2a 19,20. Par conséquent, dans ce travail, S. bactériophage aureus et des anticorps contre la protéine PBP 2a ont été utilisées. Pour être en mesure de développer un biocapteur de spécificationquement détecter et identifier SARM un dispositif à deux temps, a été utilisée. La première étape a utilisé un S. aureus bactériophage monocouche en tant que sonde de détection, tandis que la seconde étape utilise PBP 2a anticorps spécifiques. Par conséquent, la première étape comprendra S. la bactérie Staphylococcus, comme l&#39;autre seront sensibles à la protéine antibiotique contraignant. Lorsque les signaux reçus des deux étapes sont positifs, cela indique la détection spécifique de SARM.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>réactifs</fort></td></tr> <tr><td>salin tamponné au phosphate (PBS) </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme de qualité spectrophotométrique </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>154733</td><td>(99.8 % A.C.S.) </td></tr><tr><td>Hexane-anhydre </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>29609-0</td><td>(95 %)</td></tr><tr><td>Alcool éthylique </td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT</td><td>64-17-5</td><td>190 Proof</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées</td><td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japon</td><td>Le test</td><td></td></tr> <tr><td>SARM-ScreenS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051 de </td><td>l’American Type Culture Collection (Manassas, VA) ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SARM1, SARM 2, SARM 5, SARM 13, SARM 26, SARM 34, SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882 ; Le phage lytique 12600 </td><td>La collection de cultures de l’Université d’Auburn, Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse </td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K Ultra Centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>KSV 2200 LB Balance à film</td><td>KSV Chemicals, Finlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système optique de microscope optique </td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D</td><td>Q-Sense AB, V&#228 ; stra Fr&#246 ; lunda, Suède</td><td>E4</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage (MEB)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL-7000F MEB</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique transmettrice (TEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL, JEM 2010</td><td></td></tr><tr><td>Stericup, Presterilized</td><td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu ; m, GP Express PLUS membrane</td></tr><tr><td>Bio-Assay dish</td><td>NUNC A/S, Denmark</td><td>240835</td><td>Dimensions(mm), 245 x 245 x 25</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson, Pipetman, France</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, CT</td><td>Classic C24</td><td></td></tr><tr><td>Pièces de quartz recouvertes d’or</td><td>Auburn University, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td> <td>faites maisonFisher Brand, USA</td><td>0875713</td><td>100 mmX15 mm </td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, ME</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture</td><td>Corning Incorporated, NY</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Erlenmeyer flacons </td></tr><tr><td>Spectromètre optique</td><td>Genesys 20. Thermo Spectronic, États-Unis.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Harrick Plasma, États-Unis</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Système de purification d’eau Millipore</td><td>Ellipsomètre</td> d’imagerie Millipore <td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Accurion, États-Unis</td><td>nanofilm_ep3se</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software </td><td>Q-Sense AB, Suède</td><td>QSoft, QTools</td><td></td></tr></tbody></table>

biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Un bactériophage lytique structurellement transformée ayant un large spectre d&#39;hôte des souches de Staphylococcus aureus et une protéine liant à la pénicilline (PBP 2a) anticorps billes de latex conjuguées ont été utilisées pour créer un biocapteur conçu pour discrimination résistant à la méthicilline (SARM) et sensible (SASM) S . espèces de Staphylococcus 1,2. Les phages lytiques ont été transformés en sphéroïdes phages par le contact avec l&#39;interface eau-chloroforme. Phage monocouches sphéroïde ont été déplacés sur une surface du biocapteur par Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. Les biocapteurs créés ont été examinés par une microbalance à cristal de quartz avec un suivi de dissipation (QCM-D) pour évaluer les interactions bactéries-phages. Interactions bactéries-sphéroïde conduit à la fréquence de résonance réduite et une augmentation de la dissipation d&#39;énergie pour les deux souches de SARM et SASM. Après la liaison bactérienne, ces capteurs ont été plus exposées à l&#39;anticorps protéine liant à la pénicilline perles de latexs. Capteurs analysés par le SARM ont répondu à PBP 2a perles d&#39;anticorps, bien capteurs inspectés avec MSSA donné aucune réponse. Cette distinction expérimentale détermine une discrimination claire entre résistant à la méthicilline et S. sensible souches de Staphylococcus. Également liées et non liées bactériophages supprimer la croissance bactérienne sur les surfaces et dans les suspensions de l&#39;eau. Une fois phages lytiques sont changés en sphéroïdes, ils conservent leur activité lytique forte et montrent une grande capacité de capture bactérienne. Les phages et les phages sphéroïdes peuvent être utilisés pour les essais et la stérilisation des micro-organismes résistant aux antibiotiques. D&#39;autres applications peuvent inclure l&#39;utilisation en thérapie bactériophage et surfaces antimicrobiennes.

Le phage a démontré une activité lytique contre toutes les souches testées de S. aureus, y compris les souches de SARM, comme indiqué par le test de la goutte de phage. tailles de plaque variaient généralement de 5 à 15 mm. Aucune activité n&#39;a été trouvée contre les autres-cultures d&#39;essai (tableau 1). Une croissance normale de S. aureus ATCC 12600 dans un milieu NZY sur agitateur-incubateur à 37 ° C est représenté en figure 1A (une...

Biocapteurs de phages lytiques et des perles d&#39;anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d&#39;un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d&#39;anticorps reconnaissent SARM.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de discriminer les souches de staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline (MRSA) et sensibles à la méthicilline (MSSA) à l'aide d'un bactériophage lytique anti-modifié spécifiquement sélectionné. Lorsque les bactéries s'attachent aux longues queues flexibles du phage lytique, la distance entre les cellules fixées et la surface du capteur est supérieure à la profondeur de pénétration de l'onde acoustique du QC m. Par conséquent, aucun signal lié à l'événement de fixation n'est généré.Le remplacement du phage intact par des sphéroïdes donne des phages entièrement fonctionnels dotés de courtes queues, qui se lient aux bactéries dans la profondeur de pénétration de l'onde acoustique du cristal AQCM. Ainsi, ils contribuent aux variations de fréquence et de dissipation lorsque les stéroïdes de phage sont déposés sur le cristal AQCMD et exposés à une suspension bactérienne mixte. Ils se lient aux souches MRSA et MSSA de Staphylococcus aureus, mais pas aux autres bactéries, permettant ainsi de séparer Staphylococcus aureus des autres bactéries à la surface du cristal. Enfin, lorsqu'on ajoute des billes liées à l'anticorps PPP2A spécif

biosensor-for-detection-antibiotic-resistant-staphylococcus

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La conception d'un système de flux de travail d'une journée simple pour le diagnostique des pathogènes bactériens permet la reconnaissance rapide des infections du sang. L'inclusion de huit cliniquement pertinentes cibles bactériennes et leurs profils de résistance aux antibiotiques offre au clinicien un premier aperçu sur le même jour, ce qui peut conduire à un traitement plus adéquat.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Source : Zhang, M. et al., Tests rapides de susceptibilité antimicrobienne par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo démontre l’application de la microscopie à diffusion Raman stimulée pour évaluer la susceptibilité aux antibiotiques en suivant l’activité métabolique marquée au deutérium. En surveillant les signaux carbone-deutérium, la méthode permet la détection rapide de populations bactériennes...

Détection de la susceptibilité aux antibiotiques bactériens à l’aide d’un microscope à diffusion Raman stimulée

Cette vidéo présente un test de biocapteur conductimétrique pour étudier l’interaction d’un anticorps avec un antigène cible immobilisé sur une puce de transducteur. Le biocapteur est conçu pour avoir une protéine chimérique bifonctionnelle – une enzyme β-lactamase avec un site catalytique fonctionnel fusionné à un nanocorps pour se lier à l’antigène cible immobilisé. Lors de la liaison, l’hydrolyse catalytique d’un substrat antibiotique par l’enzyme β-lactamase génère un signal électrique,...

Dosage par biocapteur conductimétrique basé sur la β-lactamase pour les interactions protéine-protéine

Un biocapteur optique sans étiquette pour la détection de bactéries rapides est introduit. Le biocapteur est basé sur un silicium poreux nanostructuré, qui est conçu pour capter directement les cellules des bactéries cibles sur sa surface. Nous utilisons des anticorps monoclonaux, immobilisés sur le transducteur poreux, comme les sondes de capture. Nos études démontrent l'applicabilité de ces biocapteurs pour la détection de concentrations bactériennes faibles en quelques minutes sans...

Détection optique de E. coli Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

Nous avons développé une plateforme microfluidique pour des tests rapides de sensibilité aux antibiotiques. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes peuvent survivre à ces conditions stressantes.

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

La plupart des infections bactériennes produisent un biofilm. En raison de leur environnement, les bactéries associées au biofilm sont souvent phénotypiquement résistantes aux médicaments. Les nouvelles molécules antibactériennes qui tuent les bactéries dans les biofilms sont donc une priorité élevée. Nous établissons un test pour dépister rapidement les composés antimicrobiens efficaces pour éradiquer les biofilms.

Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification des molécules abondantes faibles dans des solutions complexes en utilisant moléculaire en combinaison avec un biocapteur capacité d’impression.

Base de détection ultrasensible des biomarqueurs à l’aide d’une empreinte moléculaire biocapteur capacitif

Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Découvrez une méthode de biosenseurs à phages lytiques pour différencier les souches MRSA et MSSA de Staphylococcus aureus sans extraction d'ADN. Cette technique améliore le diagnostic clinique des infections bactériennes.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

Explorer plus de vidéos