Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

L’objectif général de l’expérience suivante est de distinguer les souches de staphylocoques dorés résistantes à la méthicilline ou SARM et sensibles à la méthicilline ou MSSA par des phages de bactéries lytiques anti-modifiées spécialement sélectionnés. Lorsque des bactéries sont attachées aux longues queues flexibles du phage lytique, la distance entre les cellules attachées et la surface du capteur est plus grande que la pénétration de l’onde acoustique du QC m. Par conséquent, le signal de l’événement de liaison n’est pas généré.

Le remplacement du phage intact par un sphéroïde permet d’obtenir un phage entièrement fonctionnel avec des queues courtes, qui lient les bactéries dans la profondeur de pénétration de l’onde acoustique du QC m, contribuant ainsi aux changements de fréquence et de dissipation lorsque les stéroïdes des phages sont déposés sur le cristal A-Q-C-M-D et exposés à la suspension bactérienne mixte, ils se lient à la fois aux souches SARM et MSSA de staphylocoque doré, mais pas d’autres bactéries séparant le staphylocoque doré des autres bactéries à la surface cristalline. Enfin, lorsque des billes spécifiques de l’anticorps PPP deux A de Mr.RSA sont ajoutées, un signal est généré en présence de souches de staphylocoque doré Mr.RSA. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR sont que cette méthode ne nécessite pas d’extraction d’ADN et n’est pas sensible aux données empiriques.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du dépistage et de la désinfection du staphylocoque orus, elle peut également être appliquée à d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la fabrication de biocapteurs nécessite précision, exactitude et patience. Commencez par nettoyer les pièces de quartz codées en or par gravure au plasma dans l’Argonne pendant 10 minutes, puis stérilisez les pièces pendant six heures sous la lumière UV dans une armoire stérile après stérilisation à 50 microlitres de suspension de phage à la surface d’or de chaque pièce dans une boîte de Pétri stérile, puis incubez les pièces pendant la nuit dans une chambre humide à température ambiante le lendemain matin. Retirez la suspension de phage restante pour le titillation, puis lavez chaque morceau de quartz avec du phage lié cinq fois avec du PBS pour éliminer tout phage non lié.

Pour tester l’infectiosité des phages immobilisés sur une surface sèche, étalez d’abord une culture nocturne de staphylocoque doré sur un NZY eRate et laissez la suspension sécher. Placez ensuite une pièce de quartz recouverte d’or avec un phage immobilisé face vers le bas sur la plaque. Après 12 heures à 37 degrés Celsius, une zone de lyse indiquant une infectiosité peut être observée pour tester l’activité lytique du phage libre dans le liquide.

Tout d’abord, ajoutez une culture bactérienne de staphylocoque doré pendant la nuit à 10 millilitres de NZY dans chacun des quatre flacons de bras de poing de 300 millilitres. Ajoutez ensuite deux fois 10 aux six PFU par millilitre de phage libre à deux des flacons. Maintenant, surveillez l’évolution temporelle de la lyse des cellules de staphylocoque pendant 570 minutes en mesurant la densité optique à des intervalles de 30 minutes pour chaque flacon, en prenant une mesure finale à 24 heures.

Pour tester l’activité lytique d’un phage lié dans un liquide, répétez les étapes qui viennent d’être démontrées, mais ajoutez des morceaux d’or avec un phage lié dans les flacons expérimentaux au lieu du phage libre. Pour préparer les stéroïdes de phage, combinez d’abord 400 microlitres de suspension de phage 1 2600 avec un volume égal de chloroforme de qualité photométrique spectrale dans un flacon d’un millilitre à température ambiante. Ensuite, faites tourbillonner doucement la suspension de chloroforme du phage cinq à six fois à cinq secondes d’intervalle pendant une minute.

Après avoir laissé la suspension se stabiliser pendant 30 secondes, récupérez la fraction supérieure contenant la suspension de stéroïdes. Transférez quelques microlitres de suspension de stéroïdes dans un flacon de 500 microlitres pour la transmission et la microscopie électronique à balayage. Conservez la suspension de stéroïdes restante dans un flacon d’un millilitre pour la fabrication de biocapteurs.

Pour préparer d’abord le biocapteur, nettoyez les capteurs QCMD par gravure plasma dans de l’argon pendant 10 minutes dans un nettoyeur plasma. Rincez ensuite les capteurs à l’hexane pour éliminer toutes les impuretés organiques. Ensuite, nettoyez une auge de l’équilibre du film comme décrit précédemment par Olson et al dans le Journal of Microbiological methods.

En remplissant une auge LB avec une solution de sous-phase et en la nettoyant avec une barrière d’auge. Stabilisez ensuite l’auge à 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Créez maintenant une monocouche de phage sur la solution de sous-phase LB en faisant couler soigneusement un Eloqua de 300 microlitres de suspension aqueuse de phage 1 2600 à l’aide d’une tige de verre comestible inclinée qui est partiellement immergée dans la phase SOPH Après avoir laissé la monocouche se stabiliser pendant 10 minutes, comprimez la monocouche à un taux de 30 millimètres par minute jusqu’à ce qu’une pression constante de 19 newtons par mètre atteigne.

Le dépôt vertical du film est la partie la plus délicate de cette procédure. Pour garantir le succès, il faut s’assurer que tous les composants de cette procédure sont propres et que les paramètres de dépôt monocouche doivent être optimisés. Maintenant, plongez le capteur dans et hors de la monocouche sept fois de suite à une vitesse de 4,5 millimètres par minute pour effectuer un dépôt vertical du film.

Sur le capteur QCMD positionné perpendiculairement. Le dépôt vertical d’un film lie le phage intact à la surface du biocapteur. Enfin, utilisez des biocapteurs de phages fabriqués pour la détection du SARM, la microscopie électronique et l’optométrie du phage libre et lié.

Commencez cette étape en établissant les lignes de base, la fréquence de résonance et la dissipation d’énergie du capteur QCM dans l’eau à l’aide du logiciel qof T. Après environ 30 minutes, prélevez une suspension de cellules bactériennes vivantes de staphylocoque doré sensible à la méthicilline ou de MSSA dans de l’eau à travers la cellule d’essai. La ligne bleue affiche la valeur de fréquence tandis que la ligne rouge indique le niveau de dissipation d’énergie.

Les lignes horizontales montrent l’établissement de la ligne de base. Le chiffre deux au milieu de l’écran indique que les événements sont liés au capteur. Numéro deux sur quatre, surveiller en permanence les changements de fréquence de résonance et de dissipation d’énergie des capteurs pour la première harmonique affichée.

Voici les changements après que les bactéries ont passé la cellule d’essai. Notez qu’il ne faut que quelques secondes pour que la fréquence diminue et que la dissipation d’énergie augmente lorsque les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et la dissipation d’énergie interne atteignent des niveaux de saturation à la suspension des vitesses de latex conjuguées aux anticorps PVP au flux et continuent la surveillance continue de la dissipation de fréquence. L’ensemble du processus de détection montre l’établissement des lignes de base, le changement de fréquence et de dissipation d’énergie de quelques secondes après l’ajout de bactéries, la saturation et enfin, les changements après l’ajout de billes.

Ce tableau montre l’activité lytique des phages démontrée contre toutes les souches testées de S reus, y compris les souches de SARM, comme l’indique le test ponctuel des phages. La taille des plaques variait généralement de cinq à 15 millimètres. Aucune activité n’a été observée contre d’autres cultures d’essai.

Ici, la croissance normale du staphylocoque Urus A TCC 1 2600 dans un milieu Y néo-zélandais sur un incubateur à 37 degrés Celsius est démontrée, le nombre de bactéries passant de 3,2 fois 10 à six à 4,0 fois 10 à huit UFC par millilitre. En environ 24 heures, le phage immobilisé sur une surface d’or a démontré une activité lytique similaire à l’activité du phage en suspension. Le phage immobilisé est resté infectieux lors d’une infection bactérienne fraîche même après une utilisation dans une expérience de culture de 24 heures, plusieurs lavages et un stockage dans du PBS pendant six jours à quatre degrés Celsius.

Sur cette image, on peut observer le lysosome autour de la pièce d’or, indiquant que les phages immobilisés sont capables de lyser les cellules bactériennes. Par conséquent, comme illustré ici, la diminution efficace de la croissance bactérienne observée lors de la co-culture de bactéries et de phages démobilisés est le résultat de l’interaction primaire des bactéries en suspension dans l’eau et des phages liés. Ici, des micrographies électroniques à transmission et à balayage du phage lytique 1 2600 intact sur une surface de substrat d’or sont montrées lorsque la suspension du phage est soumise à un traitement au chloroforme, que la queue du phage se contracte en longueur et s’épaissit et que la tête polygonale devient arrondie ou stéroïdienne.

Malgré les changements structurels importants. L’activité lytique du stéroïde, mesurée par le nombre de plaques, n’a pas changé à la suite du traitement au chloroforme. Les capteurs QCM avec des phages lytiques immobilisés n’ont montré aucun changement significatif dans la fréquence de résonance ou la dissipation d’énergie lorsqu’ils ont été exposés au SARM, ce qui indique que l’interaction des phages SARM a entraîné un changement de masse nominale.

Selon le QCM, cependant, les micrographies électroniques des biocapteurs post-test ont révélé une liaison bactérienne significative à la surface du capteur. Lorsque des suspensions de SARM ont été injectées dans la cellule d’écoulement à l’aide de biocapteurs de stéroïdes phagiques, une diminution substantielle de la fréquence et une augmentation de la dissipation ont été observées. À la suite d’interactions de liaison au SARM de la bactérie phagéro-sphérologue, les capteurs de dosage ont été exposés à des suspensions de vitesse en latex conjuguées à deux anticorps BBP A.

Ces biocapteurs de test SARM ont réagi aux suspensions de vitesse de latex conjuguées à deux anticorps A BPP, car une nouvelle diminution de la fréquence et une augmentation de la dissipation ont été observées. La liaison de la MSA aux sondes de phage et aux vitesses de latex conjuguées aux anticorps PPP deux A a été confirmée à l’aide d’investigations en microscopie électronique à balayage. Lorsque le biocapteur de stéroïdes de phage a été exposé à la MSSA, une diminution substantielle de la fréquence et une augmentation de la dissipation ont été observées à la suite d’interactions de liaison de MSSA de stéroïdes de phage, les capteurs de test ont été testés avec des suspensions de vitesse de latex conjuguées à deux anticorps PPP A.

Initialement, le biocapteur du test MSSA a montré une courte éphémérité d’augmentations de fréquence et de diminutions de la dissipation après quelques minutes d’interactions avec des interactions conjuguées au latex d’anticorps MSSA et PPP deux A. Cependant, la fréquence est revenue à deux niveaux d’introduction d’anticorps A après le PVP, mais l’énergie déci a augmenté. La liaison de la MSSA aux sondes de phage a ensuite été analysée par microscopie électronique à balayage, mais aucune liaison entre la MSSA et le PPP deux vitesses de latex conjuguées aux anticorps A a été observée ici, un profil d’épaisseur symétrique en ellips et une carte d’épaisseur 3D du phage lytique sont montrés.

Une ligne sur la carte d’épaisseur a été tracée pour générer le profil d’épaisseur. Ces dernières images montrent des images représentatives de caméras optiques CCD du SARM capturées par des phages liés à la surface d’or du capteur A-Q-C-M-D et des profils d’intensité 3D du SARM sur des substrats de verre immobilisés par phage à une concentration de 10 à huit UFC par millilitre et de 10 à neuf UFC par millilitre. Chaque cercle rond représente une seule bactérie.

Il est clair que l’augmentation de la concentration de bactéries en suspension liquide de 10 à huit UFC par millilitre à 10 à neuf UFC par millilitre entraîne une augmentation significative des bactéries capturées dans les profils d’intensité 3D. Le nombre de pics blancs sur la couche supérieure est proportionnel au nombre de bactéries capturées et, comme prévu, la densité des pics augmente considérablement lorsque l’exposition bactérienne passe de 10 à huit à 10 à neuf UFC par millilitre. La couche inférieure bleu foncé correspond à la couche de phage en contact avec un substrat doré.

Au fur et à mesure que davantage de bactéries sont capturées, les propriétés optiques des phages changent lorsqu’elles se lient aux bactéries, ce qui donne une couleur bleue plus foncée et plus intense. En suivant cette procédure, nous pouvons définir l’efficacité de capture bactérienne afin de comprendre les interactions entre les bactéries phages après le développement. Cette technique montre la voie aux chercheurs dans le domaine de la phagothérapie bactérienne pour explorer l’inhibition des agents pathogènes chez les animaux et les humains N’oubliez pas que travailler avec des solvants organiques dans les bactéries pathogènes peut être extrêmement dangereux, et qu’il est très important de suivre la réglementation stricte.