Name: Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer ladhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez la spectroscopie de force pour mesurer l'adhésion axonale aux substrats avec une sensibilité de piconewton. Cette méthode laser évalue les propriétés mécaniques des axones pour la recherche en neurosciences.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alberto Guiggiani pour développer le système de contrôle en temps réel, Evelina Chieregatti et Hanako Tsushima des discussions perspicaces, Giacomo Pruzzo et Alessandro Parodi pour le développement de l&#39;électronique et des logiciels personnalisés et Claudia Chiabrera et Marina Nanni pour leurs conseils d&#39;expert et aide à la préparation de culture cellulaire.

1. Configuration optique Le système optique entier a été décrit précédemment 15. En bref, le système pinces optiques est basé sur une onde continue ytterbium (CW) fibre laser fonctionnant à 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulateur spatial de lumière (SLM) (LCOS-SLM, modèle X10468-07 - Hamamatsu) fait varier la phase du faisceau laser IR entrant pour commander la position de la tache de focalisation de piégeage sur la boîte de culture par ordinateur hologrammes générés. Les Blue-pinces logiciels (lien web sur la table de l&#39;équipement) hologrammes générés librement disponibles projetées sur le modulateur spatial de lumière. L&#39;interféromètre pour les mesures de spectroscopie de force reposait sur une photodiode à quatre quadrants (DOU, S5980 avec C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) et une photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs). La source de dissection laser pulsé est un sous-nanoseconde Nd UV: YAG à 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Un modulateur acousto-Modulateur optique (MQ110-A3-UV, 355 nm, la silice fondue-AA-opto-électronique) contrôle la puissance du laser UV directement à l&#39;échantillon. La pincette optique holographique et le laser micro-dissecteur sont intégrés sur un microscope droit modifié (BX51 - Olympus) équipé d&#39;un 60X, 0,9 NA eau trempage étape objective.The du microscope se compose d&#39;un trois-axes linéaires moteur à courant continu de micro-positionnement Système (M-126.CG1, Physique-Instruments) portant une piézoélectrique étape de nano-positionnement à 3 axes séparés (P-733.3DD, Physique-Instruments) pour combiner le mouvement grossier de l&#39;échantillon avec la résolution inférieure au nanomètre de l&#39;élément piézo- étape. Le système de la platine du microscope est équipé de deux boucles de régulation agissant en synergie pour maintenir le point de mise au point de piégeage à la bonne position, en fonction du mode de fonctionnement sélectionné (ou position de serrage de la main, statique ou dynamique) 16. En particulier, une boucle de rétroaction interne agit sur un étage piézo-électrique, pour garder la perle à la sélectioned distance du centre du piège. L&#39;autre boucle externe commande la position de la platine motorisée pour exploiter la région couverte par l&#39;actionneur piézo-électrique sur une surface plus grande que sa course disponible 17. Lorsque l&#39;élément piézo-phase atteint la limite de la course disponible dans une direction, la boucle externe déplace le micro-étape dans la direction opposée, donc l&#39;élément piézo récupère vers sa position centrale, car elle suit le bourrelet emprisonné collée à l&#39;échantillon. Lorsque l&#39;élément piézo-stade atteint la position centrale de sa gamme de cours, le micro scène arrêtée. D&#39;autres détails du système sont présentés dans Guiggiani et al 16,17. Un dispositif à effet Peltier (QE1 chauffage résistif avec commande de chauffage à deux canaux TC-344B - Warner Instruments) contrôle la température de la culture de cellules sous un microscope (37 ° C). Dans la culture, le pH et l&#39;humidité ont été maintenus à des conditions physiologiques en aérant un polydiméthyle conçu sur mesuresiloxane (PDMS) manchon (intégration de l&#39;objectif de microscope) avec humidifié carbogène (95% O2, 5% CO2). 2. Culture cellulaire Préparation Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. Les cultures primaires ont été obtenus à partir de l&#39;hippocampe de souris (C57BL6J, Charles River) au jour embryonnaire 18 (E18). <ol><li> Les neurones ont été étalées à une concentration de 25.000 cellules / ml à fond de verre boîtes de Pétri (P35G-0-14-C - Matek Corporation). La faible concentration des cellules en culture est nécessaire pour éviter la formation d&#39;un réseau dense dès les premiers jours in vitro. A la concentration cellulaire mentionné, la probabilité de trouver des cellules isolées avec un neurites plus pas connecté à d&#39;autres cellules est beaucoup plus élevé. </li></ol> 3. Revêtement perle <ol><li> Microsphères de polymère (Ø 4 pm, laboratoires COOH-fin-Bangs, code produit PC05N/6700) ont été enduites de poly-D-lysine suivant la procédure décrite dans la Polylink Coupling Kit Protein (Polysciences, code produit 19539). Les billes sont recouvertes de la même molécule utilisée pour couvrir le support de la culture et de la faveur cellules adhérence. </li></ol> 4. Choisissez Neuron isolé. Détachez une perle du substrat Culture, Piège et déplacez-côté de la Neuron <ol><li> Mettez la culture boîte de Pétri sur la platine du microscope. Après avoir réglé la mise au point sur l&#39;échantillon par le mouvement de la scène, corriger la position du condenseur objectif éclairant de mettre Kohler-éclairage. Aligner l&#39;optique d&#39;éclairage pour régler l&#39;état Kolher-éclairage est nécessaire pour améliorer la qualité de l&#39;imagerie en champ clair. En utilisant de telles conditions d&#39;alignement, il est également nécessaire pour maximiser l&#39;efficacité de la collecte de laser IR (à travers le condenseur objectif), de la diffusion sonde emprisonné, pour effectuer son suivi interférométrique par le DOU et PD. </li><li> Introduire à la pipette un peu pl de la solution mère de microsphères revêtuà la boîte de culture. Microsphères déposer et adhérer au substrat de culture. Le nombre de pi injecté dans la boîte de culture dépend de la concentration des microsphères de la solution mère. La condition idéale est d&#39;avoir entre un et deux microsphères par champ imagerie de vue. Quand trop de microsphères sont ajoutés à la boîte de culture, ils peuvent déjà attacher au hasard dans les neurones en culture. </li><li> Déplacez-vous dans la boîte de culture, la recherche d&#39;un neurone isolé avec un neurites plus (l&#39;axone), et enregistrer la position de la platine du microscope. </li><li> Déplacer et rechercher une perle adhéré au support de culture. </li><li> Allumez le laser de piégeage IR. A ce stade, aucun des hologrammes sont projetés sur SLM, et de la position de la tache laser IR coïncide avec la position du spot laser UV. Régler la position axiale de la tache infrarouge 3.2 um au-dessus de la surface de support de culture, par le mouvement de la platine du microscope. </li><li> Régler la puissance du laser UV directement à l&#39;échantillon de moins de 1 mW. LeUV laser dissection a déjà été calibré 14: 6.5 uW le support en verre est soumis à une ablation 4 mW une connexion neuronale est complètement disséqué 2,5 mW une neurites est partiellement lésé &lt;1 mW une onde de choc est produite dans la boîte de culture. L&#39;onde de choc optique est suffisamment fort pour détacher le talon du support de verre. </li><li> Allumez le laser UV, tout en laissant le laser infrarouge, et déplacez le spot UV au-dessus de la perle respecté par le mouvement de la platine du microscope. Les perles se détache de la surface, et il est piégé par le laser IR. Ensuite, éteignez le laser UV. </li><li> Déplacer les billes piégées plusieurs micromètres au-dessus du support de verre (de 20 à 30 pm). La levée du talon de cette position, on l&#39;empêche de venir au contact d&#39;autres cellules pendant qu&#39;il est déplacé vers le neurone choisi précédemment. Porter le bourrelet à la position de phase enregistrée précédemment. Régler la vitesse de phase à une valeur faible (10 um / sec) de telle sorte la force de traînée du fluide ne dépasse pas le piège optiquevigueur ping. </li></ol> 5. Déplacer la position du piège par rapport au Coin Dissector laser et Axon Position par hologramme généré par ordinateur, et de calibrer la rigidité pinces optiques <ol><li> Déplacer le bourrelet vers le support de verre de visualiser l&#39;axone. Le bourrelet est maintenu au-dessus de la cellule pour éviter le contact avec celui-ci (environ 5 um au-dessus du support de verre). </li><li> Déplacer la platine du microscope pour déplacer le spot de focalisation UV sur le centre de la largeur de l&#39;axone. Enregistrer la position actuelle de la scène. </li><li> Déplacer le focus position au comptant IR par hologramme généré par ordinateur. Dans cette étape, l&#39;étape est arrêtée dans la position choisie à l&#39;étape précédente. Lorsque l&#39;hologramme généré par ordinateur est projeté sur le SLM, la bille piégée est déplacée par rapport à l&#39;axone. Nous déplacer le point laser IR pour avoir le bourrelet emprisonné aligné sur le centre de la neurite, de la tache laser UV centré sur le même neurites aussi. Le spot IR et donc la perle piégée sont positionnés le long de la neurites5-10 um loin de l&#39;endroit UV. Nous passons la position de l&#39;IR par rapport à la tache UV en fonction de la géométrie des neurites. Dans le cas où les pinces optiques ne sont pas équipés d&#39;un système SLM, la position peut être modifiée par des miroirs inclinables ou déflecteurs acoustiques optiques, sur le chemin optique IR. Le spot laser infrarouge peut être positionné à une distance de 5 à 10 um de la tache UV afin d&#39;éviter une interaction optique du faisceau de dissection avec la sonde piège, qui pourraient influencer son mouvement brownien et modifier les traces de spectroscopie de force. </li><li> Après la définition de la nouvelle position de la tache infrarouge par rapport à la tache UV et la position de l&#39;axone, déplacer la platine pour positionner le bourrelet emprisonné loin de l&#39;axone et éviter la collision avec elle. Déplacer la position axiale du bourrelet emprisonné à environ 2 um au-dessus de la vitre de recouvrement. </li><li> Aligner le DOU du centre Les franges d&#39;interférence sur elle: signaux différentiels QPD x et y sont des zéros lorsque le DOU est centrée. Acquérir 5 sec du mouvement brownien de la bille piégée par le interférométriemètre, à la fréquence d&#39;échantillonnage de 50 KHz. Obtenir la rigidité (pN / nm) et la sensibilité (V / nm) du piège optique par la méthode de spectre de puissance 18. </li></ol> 6. Fixez la perle de l&#39;axone. Effectuer la mesure de force axotomie et simultanée <ol><li> Levez la position perle piégée environ 4 um au-dessus du couvercle en verre, et le déplacer vers la position de scène enregistrée précédemment (voir l&#39;étape 3.2). </li><li> Déplacez le bas talon coincé vers l&#39;axone jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le neurites. La collision entre le bourrelet emprisonné et l&#39;axone est contrôlée par le signal DOU z détecter le déplacement de la bille emprisonnée dans le sens axial. </li><li> Attendre 10 sec avec le bourrelet emprisonné poussé contre l&#39;axone pour favoriser son adhérence à la membrane des neurites. </li><li> Déplacer le micro-étape pour déplacer la bille piégée de l&#39;axone, et vérifier ainsi son adhésion à la membrane cellulaire. Si la perle respecté, il s&#39;échappe du piège optique. </li><li> Déplacer en arrière le piège à laser sur le bourrelet colléeet activer la boucle de force avec serrage état de force égale à zéro. De cette façon, les repositionne piézo-scène la perle, attachés à la cellule, au centre du piège optique. Si le système n&#39;a pas de contrôle de la boucle de rétroaction, la position d&#39;interruption du laser peut être déplacé par la platine du microscope pour le centrer sur la sonde collée. Le centre du piège est atteinte lorsque les signaux QPD sont les mêmes que lorsque la bille est coincée et n&#39;est pas collée à la cellule (y QPD signaux égaux à zéro et x et le signal DOU z donne la même tension somme des quatre quadrants que lorsque le talon est coincé loin de toute surface). </li><li> Définir une condition de force la bride sur l&#39;axe z, le positionnement du laser de piégeage légèrement sur le centre de la bille (environ 100 nm), pour générer une précontrainte sur la sonde piège collée. Dans le cas où le système n&#39;est pas équipé d&#39;une commande de force de serrage, la position de piège optique peut être soulevée vers le haut au pas de 25 nm par la platine du microscope. Le signal DOU z permet de surveiller. Par conséquent, utiliser this signal pour régler la position de la trappe de laser par rapport à la sonde collée. Une telle pré-tension est nécessaire pour détecter la pression exercée sur la membrane après la lésion axonale et la diminution conséquente du mouvement brownien de la sonde adhéré. Une approche similaire a été proposée pour mesurer le relâchement de la tension dans un câble d&#39;attache de la membrane par imagerie vidéo 19. </li><li> Déconnexion du retour de force-pince pour mesurer la force sur la sonde adhérant à la condition de position de serrage (l&#39;élément piézo-étape est bloquée). </li><li> Lancer l&#39;enregistrement simultané des positions des sondes piégés par l&#39;interféromètre (20 fréquence d&#39;échantillonnage KHz), et la cellule pendant laser axotomie en accéléré imagerie à champ clair (20 Hz fréquence de trame). </li><li> Allumez le laser UV pour délivrer des impulsions laser jusqu&#39;à une lésion devient visible sur l&#39;image de l&#39;axone (généralement 200-400 impulsions optiques sont nécessaires énergie par impulsion: 25. NJ), puis éteignez le laser UV. </li><li> Continuez l&#39;enregistrement par l&#39;interféromètre pour environ 3 kmn, jusqu&#39;à ce que les coordonnées x, y et z des traces QPD atteindre un plateau. </li></ol> 7. Quantifier le total relâchement de tension <ol><li> Autre les traces enregistrées QPD (en volts) par la sensibilité étalonnée du piège optique, d&#39;obtenir des traces respectives de nanomètres. </li><li> Filtrer la trace de déplacement z x, y, et par un filtre passe-haut avec les couper à 10 Hz. </li><li> Calculer la variance totale des traces filtrées représentant le mouvement brownien de la bille piégée. Calcul de la variance à 25 msec pour recouvrir les fenêtres de temps de 500 ms (10 000 points de données) 20. Le filtrage des traces passe-haut exclut les effets du mouvement brownien en raison de la fluctuation de la membrane ou le mouvement de l&#39;actine corticale. Le mouvement brownien de la bille est réduite par les forces optiques et les forces d&#39;adhérence sur la membrane cellulaire. Lorsque la membrane est tendue en raison de la libération des tensions sa viscosité augmente, et donc le mouvement brownien de la perle, détectée immédiatementdiatement après axotomy, commence à diminuer. </li><li> Définir T0: début de la diminution de la variance du mouvement brownien, après la livraison de l&#39;énergie laser UV. A l&#39;instant t0 le temps indique le début de la déformation de la membrane. </li><li> Définir t1: la fin de la diminution de la variance du mouvement brownien (quand il atteint un plateau). L&#39;instant t1 marque la fin de la déformation de la membrane. </li><li> Effectuer suivi vidéo des débris ou une égratignure sur le support de verre de couverture, afin de mesurer une éventuelle dérive de l&#39;échantillon au cours de la mesure de force. Pour suivre la particule sur le support de verre, nous appliquons d&#39;abord seuils des images brillantes sur le terrain, afin d&#39;obtenir une pile d&#39;images binaires avec la particule en blanc sur un fond noir. Ensuite, on suivre le centre de masse de particules avec une précision sous-pixel (en utilisant le logiciel ImageJ gratuit). </li><li> Soustraire la dérive mesurée à partir des traces QPD déplacement. Multiplier les traces QPD dérive corrigée par la rigidité optique calibré respectif (k x, k <sub&gt; y, z k) afin d&#39;obtenir les traces Fz Fx, Fy, dans piconewtons. </li><li> Calculer la trace de la force totale de F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2). </li><li> Calculer la libération totale de la force entre T0 et T1 comme F libéré = F tot (t1) - F tot (T0). La force mesurée à l&#39;instant t0 doit être soustraite, car il est dû au déplacement de la sonde à partir du centre de la trappe, lorsque les adhère bourrelet à l&#39;neurites. </li><li> Calculer la surface de contact des neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV: sur la mesure d&#39;image de champ lumineux les longs (L) et à court axes (D) de la neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV. La zone de contact axone est un axone = L x D. </li><li> Normaliser la totale libérée force F publié par la zone de contact axone Un axone. </li></ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li>
<li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+with+molecular+fluorescence+imaging+using+activatable+cell-penetrating+peptides+decreases+residual+cancer+and+improves+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).</li>
<li>Stiess, M., Maghelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+extension+occurs+independently+of+centrosomal+microtubule+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation.</a> Science. 327, 704-707 (2010).</li>
<li>Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+induced+cell+fusion+in+combination+with+optical+tweezers%3A+the+laser+cell+fusion+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap.</a> Cytometry. 12, 505-510 (1991).</li>
<li>Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+delivery+of+liposome+encapsulated+chemical+stimuli+to+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells.</a> J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).</li>
<li>Kress, H., Park, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stimulation+with+optically+manipulated+microsources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell stimulation with optically manipulated microsources.</a> Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Difato, F., Dal, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+optical+tweezers+and+laser+dissector+for+controlled+ablation+of+functional+connections+in+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).</li>
<li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>O'Toole, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stretching+in+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The role of stretching in slow axonal transport.</a> Biophys. J. 100, 351-360 (2011).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Difato, F., Tsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+actin+waves+during+regeneration+after+axonal+lesion+is+enhanced+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.</a> Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).</li>
<li>Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+optical+manipulation+and+electrophysiological+tools+to+modulate+and+record+activity+in+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Optomechatronics%22%5BJournal%5D)">Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks.</a> International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).</li>
<li>Guiggiani, A., Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+and+long-term+interferometric+tracking+by+static+and+dynamic+force-clamp+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers.</a> Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).</li>
<li>Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuiggiani%2C+A+%223rd+Real+Time+Linux+Workshop%22">3rd Real Time Linux Workshop</a>. , (2011).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decrease+in+membrane+tension+precedes+successful+cell-membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.</a> Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).</li>
<li>Kress, H., Stelzer, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+act+as+phagocytic+tentacles+and+pull+with+discrete+steps+and+a+load-dependent+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+mechanotransduction%3A+pathways%2C+probes%2C+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).</li>
<li>Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+surgery+and+optical+trapping+in+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope.</a> Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).</li>
<li>Carter, A. R., King, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous décrivons dans ce travail une méthode quantitative pour comparer l&#39;adhérence des neurites au substrat de culture, en effectuant une mesure par spectroscopie de force simultanée pendant lésion cellulaire induite par laser. La libération mesurée de tension est liée au degré d&#39;adhésion de la cellule au substrat: les cellules avec un plus grand nombre d&#39;adhésions focaux devraient libérer moins de tension. Mesure de la libération de la tension en fonction de piconewtons fournit une quantité physique par lequ...

La microscopie optique est l&#39;un du système de formation d&#39;image moins invasive disponible pour observer les cellules vivantes. Avec l&#39;exploitation des effets tels que la pression de radiation (comme pinces optiques 1), ou flux de photons de haute énergie (comme dans dissection laser 2), cette technologie a été étendue aux nano-manipulation. Le système d&#39;imagerie optique fournit un contrôle précis de visualiser et de manipuler les cibles cellulaires sous 3. Dans le même temps, grâce à l&#39;étalonnage précis de la puissance du laser livré, outils optiques accomplir soit la manipulation de l&#39;échantillon mou ou invasive avec une reproductibilité sans précédent. Plusieurs laboratoires intégrés, dans le même dispositif expérimental, pinces optiques et dissecteur laser afin de réaliser l&#39;ablation organites 4, à fusionner les différentes cellules 5, ou pour stimuler les cellules par entraîné optiquement cargaisons 6,7. Bien pinces optiques, après étalonnage de la rigidité optique, permettent dele contrôle de la force appliquée à la cellule sur une échelle piconewton, les systèmes de dissection laser peut moduler la manipulation optique, qui va de la membrane photo-ration à l&#39;ablation des organites simples ou dissection des structures sub-cellulaires. Cependant, l&#39;étalonnage de dissection laser repose sur l&#39;évaluation qualitative de l&#39;entité de manipulation optique par rapport à l&#39;énergie fournie à l&#39;échantillon, principalement basée sur l&#39;analyse d&#39;images illustrant les changements morphologiques dus à l&#39;échantillon 8. Dans la méthode présentée, nous montrons comment effectuer la mesure de la spectroscopie de force au cours de la dissection axonale laser d&#39;un neurone en développement, pour quantifier, sur l&#39;échelle piconewton, la force produite par un équilibre altération de la structure du cytosquelette d&#39;un compartiment subcellulaire 9. Des neurones en culture adhèrent au substrat, et polarisent au cours du développement. La phase de polarisation se produit durant les cinq premiers jours in vitro. À la deuxième étape de la polarisation, l&#39;un des Extrudment neurites est long, et il faudra différencier pour devenir l&#39;axone 10. Élongation des axones en réponse à la force de traction au niveau du cône de croissance a déjà été modélisé par le modèle de Dennerl 11. Récemment, ce modèle a été étendu pour inclure 12 le rôle de l&#39;adhésion neurites sur les substrats de la matrice extracellulaire. Ce modèle biophysique, proposé après les observations expérimentales 13, a montré que les forces de traction sur le cône de croissance, se propageant le long de la neurites, sont modulés par des adhérences focales au substrat. De même, lésion axonale produit une libération locale de tension se propageant en direction du corps de la cellule. Ainsi, nous avons proposé que la mesure de cette tension libérée dans un emplacement le long de l&#39;axone entre la lésion et le corps cellulaire offre la possibilité d&#39;évaluer l&#39;issue d&#39;amortissement des adhésions focales ne sont pas touchés. Nous calibrer l&#39;énergie nécessaire photons flux de la dissection laser pour contrôler l&#39;étendue de l&#39;avarie de axonale infligéee, de la section complète de la lésion partielle. Après la calibration, nous avons répété lésion partielle des axones des neurones plusieurs différenciation et développé le protocole de quantifier le relâchement de la tension, et obtient ainsi un paramètre quantitatif pour estimer l&#39;adhérence de l&#39;axone au substrat 14. Dans le présent travail, nous décrivons en détail le protocole mis au point, ce qui représente une procédure expérimentale précise pour évaluer et comparer avec sensibilité piconewton l&#39;adhésion axonale au substrat dans différentes conditions expérimentales telles que le traitement chimique 14, ou différents types de support de culture cellulaire.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>RÉACTIFS</fort</td></tr><tr><td>>Microsphères polymères, 4 &mu ; m, COOH coated</td><td>Bangs laboratories</td><td>PC05N/6700</td><td></td></tr><tr><td>PolyLink Protein Coupling Kit</td><td>Polyscience</td><td>19539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Laser IR</td><td>IPG Laser GmbH</td><td>YLM-5-SC-LP</td><td>Laser à fibre d’ytterbium à ondes continues (CW) fonctionnant à 1064 nm, avec polarisation linéaire</td></tr><tr><td>Modulateur spatial de lumière</td><td>Hamamatsu</td><td>LCOS-SLM 10468-07</td><td></td></tr><tr><td>Pince bleue Logiciel</td><td>Optics group, Université de Glasgow</td><td>Logiciel téléchargeable gratuitement</td><td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ » target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Hamamatsu</td><td>Logiciel</td> <td>téléchargeable gratuit<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/ » target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td></tr><tr><td>QPD</td><td>Thorlabs</td><td>S5980 avec carte C5460SPL 6041</td><td>Photo-diode à quatre quadrants pour mesurer x, y déplacement de la sonde piégée</td></tr><tr><td></td><td>Teem Photonics</td><td>PDA100A-EC</td><td>Photodiode pour mesurer z déplacement de la sonde piégée</td></tr><tr><td>nano-Pulse UV laser</td><td>AA-optoelctronics</td><td>PNV-001525-040</td><td>Laser UVA pulsé, longueur d’impulsion 400 ps</td></tr><tr><td>Modulateur optique acoustique</td><td>Olympus</td><td>MQ110-A3-UV, 355nm silice</td><td></td>fondue</tr><tr><td>Microscope droit</td><td>Andor</td><td>BX51</td><td>Équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 60, 0,9 NA</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Warner Instruments</td><td>V887ECSUVB EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif Peltier</td><td>Physic Instruments</td><td>QE1 Chauffage résistif avec chauffage à double canal TC-344B contrôleur</td><td></td></tr><tr><td>Platine de microscope : platine micro+piézoélectrique</td><td>National Instruments</td><td>Trois platines linéaires M-126. CG1 portant un étage de nano-positionnement piézoélectrique à 3 axes séparé P-733.3DD</td><td></td></tr><tr><td>Daq</td><td></td><td>NI PCI-6229</td><td>Acquisition de la position x, y, z de la sonde piégée et envoi de signaux de boucle de rétroaction à l’étage de microscope</td></tr><tr><td>Machine</td><td></td><td></td> Linux Real Time Application Interface (RTAI) <td>Système de boucle de rétroaction en temps réel, pour contrôler la position de l’étage, développé sur un ordinateur de bureau PC dédié</td></tr></tbody></table>

mesure de la tension de sortie pendant laser induced axon lésion axonale évaluer l&#39;adhésion au substrat à piconewton et millisecond résolution

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

La formation des connexions fonctionnelles dans un réseau de neurones en développement est influencée par des signaux extrinsèques. La croissance des neurites des neurones en développement est soumis à des signaux chimiques et mécaniques, et les mécanismes par lesquels il détecte et réagit aux signaux mécaniques sont mal compris. L&#39;élucidation du rôle des forces dans la maturation des cellules permettra à la conception des échafaudages qui peut favoriser l&#39;adhérence cellulaire et l&#39;accouplement du cytosquelette au substrat, et donc d&#39;améliorer la capacité de différents types de neurones pour régénérer après une blessure. Ici, nous décrivons une méthode pour appliquer des mesures de spectroscopie de force simultanés pendant lésion cellulaire induite par laser. Nous mesurons relâchement de la tension dans l&#39;axone partiellement lésé par simultané suivi interférométrique d&#39;une sonde optique piégé adhéré à la membrane de l&#39;axone. Notre protocole expérimental détecte le relâchement de la tension avec sensibilité piconewton, et la dynamique de la libération de tension aurésolution de la milliseconde. Par conséquent, il propose une méthode à haute résolution pour étudier comment le couplage mécanique entre les cellules et les substrats peut être modulée par un traitement pharmacologique et / ou par des propriétés mécaniques distinctes du substrat.

La cellule génère des forces de traction sur le substrat par ses points d&#39;adhésion. Force générée par les éléments du cytosquelette sont en équilibre avec la force antagoniste du substrat de culture. Après lésion induite par laser de la neurite, une partie des câbles tendus de cytosquelette sont perturbés et leur tension équilibrée est libéré en raison de la force antagoniste de l&#39;adhérence du substrat est éliminé. La tension libérée est partiellement diffusé sur les adhésions focales ne sont pas touchés, et le ...

Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l&#39;axone. Le protocole expérimental développé évalue l&#39;adhérence des axones au substrat de culture.

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l&#39;adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer, avec une sensibilité de l'ordre du piconewton, l'adhésion axonale aux substrats. Cette évaluation est réalisée en deux étapes : premièrement, l'utilisation de lasers pour capturer et positionner une microbille à proximité d'un neurone isolé possédant un long neurite ; deuxièmement, le centrage de la bille au-dessus de l'axone à l'aide d'un laser infrarouge.Ensuite, la raideur du piège optique est calibrée en suivant par interférométrie le mouvement brownien de la bille piégée avant de l'attacher au neurite. La dernière étape consiste à effectuer des mesures de force lors de l'application d'impulsions laser UV pour léser l'axone. Enfin, la spectroscopie de force est utilisée pour évaluer la libération de la tension provoquée par la lésion axonale, ce qui représente une estimation de l'adhérence axonale au substrat.L'avantage principal de cette technique par rapport à la technique basée sur la fluorescéine est qu'elle fournit un paramètre physique. La force mesurée avec une sensibilité de piconewtons permet une comparaison directe de l'adhérence axonale au substrat dans différentes conditions expérimentales distinctes, telles que d

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Mesures d'application directe et des forces sur les neurones dans la gamme 2000-1000 Microdyne sont atteints avec une grande précision en utilisant des aiguilles de verre calibré. Cette méthodologie peut être utilisée pour contrôler et mesurer plusieurs aspects du développement axonal, y compris l'initiation axonale, la tension axonale, la vitesse d'élongation des axones, et les vecteurs de la force.

Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale

Laser axotomie suivie par imagerie time-lapse est une manière sensible pour doser les effets des mutations...

Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans</em

Cette vidéo décrit la méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant l’axotomie laser à deux photons et en observant la récupération axonale après une blessure.

L’axotomie laser à deux photons : une méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre et observer la récupération axonale

La vidéo présente une méthode d’évaluation des forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires à l’aide de nanoparticules d’or ancrées au polyéthylène glycol et de sondes de tension en épingle à cheveux d’ADN. Les interactions des lymphocytes T CD8-positifs déclenchent le dépliage de la sonde, émettant une fluorescence tandis que les brins verrouillables maintiennent le signal pour quantifier les forces appliquées par les cellules immunitaires.

Utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour évaluer les forces des récepteurs appliquées par les cellules immunitaires

Imagerie à deux photons, couplé à nanodissection laser, sont des outils utiles pour étudier les processus dégénératifs et régénératifs dans le système nerveux central avec une résolution subcellulaire. Ce protocole indique comment étiqueter, image, et disséquer fibres grimpantes simples dans le cortex cérébelleux in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

L’enregistrement des courants Ca2+ au niveau de la membrane frontale de libération présynaptique est essentiel à une compréhension précise de l’entrée de Ca2+ et de la libération des neurotransmetteurs. Nous présentons une dissociation aiguë de la moelle épinière de la lamproie qui produit des axones réticulospinaux isolés fonctionnels, permettant l’enregistrement directement à partir de la membrane frontale de libération des terminaisons présynaptiques individuelles.

Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l&#39;enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

Nous présentons un protocole utilisant la microscopie time-lapse à excitation de deux photons pour visualiser simultanément la dynamique des lésions axonales et myélines en temps réel. Ce protocole proposé permet d’étudier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui peuvent influencer le destin des axones myélinisés centraux après une blessure et contribuer à une invalidité clinique permanente.

Une Ex Vivo Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour imager les forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires. Cette approche permet de cartographier les forces du récepteur &gt;4,7pN en temps réel et d’intégrer les forces au fil du temps.

Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

Ici, nous décrivons une pince magnétique à haute vitesse qui effectue des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force à la vitesse maximale de 1,2 kHz. Nous introduisons son application aux épingles à cheveux à ADN et aux complexes SNARE en tant que systèmes modèles, mais elle sera également applicable à d’autres molécules impliquées dans des événements mécanobiologiques.

Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

Découvrez la spectroscopie de force pour mesurer l'adhésion axonale aux substrats avec une sensibilité de piconewton. Cette méthode laser évalue les propriétés mécaniques des axones pour la recherche en neurosciences.

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer ladhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l'adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

Explorer plus de vidéos