Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme

L'objectif général de l'expérience suivante est de former des cellules semblables à des ovocytes à partir de cellules souches dérivées de la peau somatique. Cela est réalisé en utilisant des cellules souches indifférenciées pures provenant de la peau de souriceaux nouveau-nés. Dans une deuxième étape, les cellules souches sont dissociées, ce qui les prépare à la différenciation.

Ensuite, les cellules souches sont mises en culture dans un milieu de différenciation défini. Afin d'induire la formation de cellules germinales, des résultats sont obtenus qui montrent l'expression de marqueurs spécifiques des ovocytes, basée sur une PCR en temps réel semi-quantitative. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction.

En fournissant un système clos permettant d'étudier les cellules germinales, la formation et le développement des eSight, tous les milieux requis pour le protocole doivent être préparés deux à trois heures avant leur utilisation et placés dans l'incubateur de culture cellulaire où l'expérience sera réalisée, avec un bouchon desserré. Les deux milieux utilisés ici sont le milieu pour cellules souches, composé de D-M-A-M-F 12 supplémenté avec B 27, BFGF et EGF, et le milieu de différenciation des cellules germinales, composé de M1 99 supplémenté avec FSH, LH, B-S-A-I-T-S, du pyruvate de sodium, de la tuin et de l'EGF. Cellules souches isolées de souriceaux nouveau-nés.

Les souriceaux sont utilisés pour la différenciation in vitro des cellules germinales au passage deux à quatre. Étant donné que l'efficacité de formation des cellules semblables à des cytes ou des OLC est directement liée à la qualité des cellules souches initiales, il est préférable de commencer la différenciation dès que la population apparaît propre et saine, généralement vers le passage 2. 48 heures avant d'initier la différenciation, réalisez une sous-culture des cellules souches à l'aide d'une pipette serologique, retirez tous les agrégats cellulaires sphériques en suspension et le milieu usagé de la boîte de culture, puis transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Il est important de ne recueillir que les agrégats sphériques cellulaires en suspension, et non les cellules attachées au fond de la boîte qui se différencient spontanément.

Centrifuger les cellules à 500 ×g pendant cinq minutes, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans 500 microlitres de milieu frais pour cellules souches. Porter à 37 degrés Celsius. Pipeter doucement les agrégats pour dissocier partiellement les cellules.

Ne pas pipeter les cellules de manière agressive car cela réduirait la viabilité cellulaire. Laver les cellules partiellement dissociées dans 9,5 millilitres de milieu frais préchauffé pour cellules souches dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres à faible adhérence. Remettre les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 48 heures.

Pour commencer la procédure de différenciation des OLC, utilisez une pipette serologique pour prélever les cellules souches depuis la boîte de culture et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Laissez les cellules adhérentes dans la boîte. Faites centrifuger les cellules à 500 × g pendant cinq minutes, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans 500 microlitres de PBS stérile. Pipetez vigoureusement les cellules à l’aide d’une pointe large de 1000 microlitres pour former des agrégats contenant au plus 10 à 20 cellules.

Pour la réussite de ce protocole, il est essentiel de vérifier régulièrement le degré de dissociation afin de s'assurer qu'un niveau adéquat est atteint pendant la dissociation. Prélevez périodiquement un petit échantillon de cellules et observez-les au microscope en lumière blanche pour confirmer que les cellules agrégées forment des agrégats de 10 à 20 cellules individuelles. Évitez de trop dissocier les cellules, car cela entraînerait une viabilité cellulaire réduite.

Ensuite, ajoutez 9,5 millilitres de PBS aux cellules dissociées et transférez 15 microlitres de cette suspension cellulaire dans un hémocytomètre pour le décompte cellulaire. Faites centrifuger les cellules à 500 ×g pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez les cellules dans le milieu de différenciation à une concentration de 1,32 × 10⁶ cellules par millilitre.

Ensemencer les cellules en ajoutant 500 microlitres par puits dans une plaque de culture en suspension à 24 puits à fond plat. Placer la plaque à 24 puits dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius, sous 5 % de CO2, pendant 48 heures. Après 48 heures, prélever 250 microlitres de milieu de chaque puits et les transférer dans un tube de 1,5 millilitre correspondant, préalablement étiqueté.

Ajoutez 250 microlitres de milieu de différenciation frais dans chaque puits. Centrifugez le milieu utilisé à 500 × g pendant cinq minutes, jetez le surnageant et resuspendez les cellules formant le culot dans 50 microlitres de milieu de différenciation frais. Réintroduisez la suspension cellulaire dans le puits correspondant de la plaque de différenciation. Toutes les 48 heures jusqu'au jour 12 de différenciation, renouvelez la moitié du milieu de la même manière.

Au cours des premiers stades de différenciation, les cellules adhèrent au fond de la boîte de culture et s'étalent. Cette image représentative montre des cellules entre 42 et 72 heures de différenciation positives pour OCT4. Un marqueur des cellules souches indifférenciées est indiqué par des noyaux verts, contre-colorés à l'hémostatin et indiqués en bleu.

Au fur et à mesure que la différenciation progresse, certains agrégats cellulaires présenteront des cellules positives pour OCT4 marquées en vert, entourées de cellules négatives pour OCT4. L'échelle de cette image correspond à 100 microns. Cette figure montre une image en lumière blanche d'une structure semblable à un follicule après détachement de la surface de culture ; la barre d'échelle représente 40 microns.

Après une culture prolongée, le LCS grandit jusqu'à atteindre environ 45 microns de diamètre. L'échelle indiquée sur cette image représente 10 microns. De grands LCS OCT4-positifs peuvent être observés soit entourés de cellules, soit isolés dans la culture.

Ces LCS peuvent être collectés avec des cellules d'appoint ou des yeux traités à la trypsine afin d'obtenir des LCS sans autres cellules attachées. Afin de confirmer que les LCS exprimaient des transcrits similaires à ceux des sites ol naturels, les LCS ont été collectés et analysés pour l'expression de marqueurs courants des sites OO tels que Z-P-C-S-C-P trois CMO, T quatre BMP 15 et vasa. Cette figure montre les niveaux de transcrits de ces marqueurs dans 10 LCS par rapport à 10 cytes de souris nouveau-nées.

Les résultats montrent que les LCS expriment moins de ZPC que les cytes. Étant donné que la ZPC est un composant de la structure membranaire spécifique du zop lucidum des CYTE, cela pourrait expliquer la nature fragile et la membrane zita plus mince des LCS. L'expression de la SCP trois de la méiose est plus élevée dans les LCS par rapport aux cytes naturels.

Cependant, un autre marqueur de méiose, CMOs, est exprimé à un niveau plus faible. Cette différence dans les niveaux d'expression pourrait partiellement expliquer l'échec actuel du LCS à achever la méiose. D'autres marqueurs tels que BMP 15 et vasa ne présentent pas de différence significative entre les sites lcs et O.

Lorsque l'on effectue cette procédure, il est important de se rappeler que la santé de la population initiale de cellules souches est essentielle à sa réussite.