Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer le module d’élasticité des cellules vivantes à l’aide d’un microscope à force atomique. Ceci est réalisé en effectuant d’abord des mesures de spectroscopie de force FM à divers endroits de la cellule. Dans un deuxième temps, chaque courbe de distance forcée est analysée pour déterminer le point où la pointe A FM entre initialement en contact avec la cellule.

Ensuite, en commençant par le point de contact, les premiers 200 à 300 nanomètres de données d’indentation sont montés sur le modèle hertz. Afin d’extraire le module d’élasticité, les résultats donnent une carte 2D de la rigidité cellulaire obtenue en utilisant le mode de cartographie de force où chaque pixel représente une seule courbe de distance forcée. Pour commencer cette procédure, nettoyez le support de porte-à-faux avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le sécher.

Chargez ensuite un bru DNP 10 cantilever dans l’A FM selon les instructions du fabricant. Ensuite, calibrez la sensibilité du levier optique inverse. Ce paramètre décrit la quantité de réponse de la photodiode en volts par nanomètre de déviation en porte-à-faux.

Pour ce faire, chargez d’abord une lame de verre propre sur la platine d’échantillon. Installez la tête FM et ajustez le faisceau laser et l’alignement selon les instructions du fabricant. Une fois aligné, engagez l’embout A FM sur la lame de verre avec le P huit O retiré.

Réalignez le miroir sur une lecture de photodiode de moins deux volts. Effectuez ensuite une mesure par spectroscopie de force avec une réponse maximale de la photodiode ou un point de déclenchement de deux volts positifs. Une fois l’acquisition des données terminée, zoomez sur la zone de contact ferme de la courbe de force et effectuez un ajustement linéaire à cette région.

Pour trouver la pente en volts par nanomètre, réinitialisez l’alignement du miroir à une déviation libre de zéro volt. Ensuite, calibrez la constante du ressort en porte-à-faux à l’aide de la méthode de réglage thermique décrite par Levy et Malam. Pour commencer, soulevez le scanner en l’éloignant de l’étage d’échantillonnage afin qu’il n’y ait pas d’interactions entre la pointe et l’échantillon.

Capturez ensuite les données thermiques en enregistrant les vibrations thermiques de la poutre en porte-à-faux. Le logiciel A FM analyse un spectre de puissance d’une telle vibration thermique et le trace dans une fenêtre de données. Ensuite, effectuez un ajustement au segment de données centré sur la fréquence la plus basse, également connue sous le nom de pic de résonance fondamentale, pour déterminer la constante de ressort.

Afin de préparer l’un FM pour les plaques de culture, installez un accessoire de chauffage de la vaisselle sur l’étage a FM et réglez la température à 37 degrés Celsius. Attendez 20 minutes que le système atteigne un équilibre thermique stable. Une fois préchauffé, placez une boîte de culture sur une platine FM et fixez-la à l’aide de la pince fournie avec le chauffe-plat pour les mesures de plus de 30 minutes, un milieu indépendant du dioxyde de carbone doit être utilisé pour remplacer le milieu de culture normal.

Ensuite, appliquez une petite goutte de milieu de culture à 37 degrés Celsius sur l’extrémité du cantilever A FM et abaissez la tête a FM jusqu’à ce que la pointe soit juste immergée dans le liquide. À l’aide d’une caméra CCD à vue de dessus, réalignez le faisceau laser sur le cantilever. L’alignement dans un liquide sera différent de celui d’un air en raison du changement de l’indice de réfraction du milieu.

Une fois aligné, engagez l’embout A FM sur une zone exempte de cellules de la boîte de culture et effectuez l’étalonnage de la sensibilité du levier optique inverse dans l’environnement liquide. Pour commencer les mesures des propriétés mécaniques des cellules, placez la pointe en porte-à-faux au-dessus de la région de l’œil perlé d’une cellule à l’aide d’un microscope optique. Des ajustements précis de la position des porte-à-faux sont effectués en appliquant des décalages aux scanners X et Y.

Ensuite, passez le mode a FM en mode quatre spectroscopies et réglez le taux d’indentation à cinq micromètres par seconde, ce qui est suffisamment faible pour éviter les effets hydrodynamiques. Ensuite, réglez le point de déclenchement de déviation sur deux nano newtons. Afin d’éviter d’endommager les cellules, ajustez cette valeur en fonction de la rigidité de l’échantillon.

De plus, sélectionnez l’option de déclenchement relative, qui corrigera toute dérive du signal de déviation. Réglez ensuite la distance de force à cinq micromètres pour vous assurer que la pointe sera complètement détachée de la cellule entre les mesures de force. Collectez trois courbes de force à différents endroits dans la région des noyaux d’au moins 30 cellules pour chaque condition.

Bien qu’il soit avantageux de prendre plusieurs courbes sur chaque cellule. Pour obtenir des données statistiques fiables, en prendre trop peut entraîner des changements de la rigidité cellulaire à la détresse de la sonde FM A. Caractérisez davantage la distribution des propriétés mécaniques dans une seule cellule à l’aide du mode de cartographie des forces.

En mode de cartographie de force, réglez la taille de balayage sur 30 micromètres, la résolution sur 32 par 32, et les paramètres d’indentation sont les mêmes que ceux sélectionnés pour les courbes de force unique. Le A FM prendra ensuite des courbes de force simples à chaque pixel de la région d’échantillonnage et fournira une carte de rigidité de la région entière. Ensuite, analysez les courbes de force enregistrées à l’aide de MATLAB pour calculer la rigidité de la cellule.

Commencez par adopter un algorithme publié pour la première fois par Lynette Al, qui calcule à la fois un ajustement linéaire et un ajustement hertz à partir de chaque point à l’aide de matlab. Calculez l’erreur quadratique relative des deux ajustements et additionnez ces valeurs en chaque point. Le point qui atteint l’erreur d’ajustement totale minimale est sélectionné comme point de contact initial : la localisation de ce point est cruciale pour une mesure précise du module jeune des cellules.

Ensuite, calculez le delta de déformation de l’échantillon. En utilisant les équations suivantes, la déformation est égale à zéro avant le contact de la cellule où Z est inférieur à Z zéro et est égal à la différence entre la déviation en porte-à-faux D et la distance totale Z au-delà du point de contact. Calculez ensuite la force d’indentation F à l’aide des équations suivantes où la force est égale à zéro avant le contact de la cellule où Z est inférieur à Z zéro et égal à la constante de ressort K du porte-à-faux multipliée par la déviation du porte-à-faux au-delà du point de contact.

L’ajustement du carré d’Elise est ensuite appliqué aux données de déformation de l’échantillon en fonction de la force d’indentation dans la région post-contact du modèle hertz afin d’extraire le module de Young de la cellule en fonction de la forme de la pointe utilisée illustrée. Voici des courbes de force représentatives tirées de trois cellules de fibroblastes T cultivées sur trois surfaces différentes. Comme vous pouvez le voir ici, différentes surfaces peuvent grandement influencer la rigidité du cytosquelette cellulaire.

La déformation moyenne des cellules cultivées sur une surface en plastique dur est indiquée en rouge. Ceux cultivés sur un gel de polyacrylamide rigide sont représentés en violet, et ceux cultivés sur un gel de polyacrylamide élastique sont représentés en bleu. Après avoir soigneusement identifié les points de contact dans les courbes, les forces d’indentation en fonction de la déformation cellulaire peuvent être montrées avec précision.

De plus, leur modulaire de Young, I peut être calculé avec précision à partir des premiers 300 nanomètres d’indentation après contact. On voit ici un fibroblaste qui a été transfecté avec une protéine fluorescente verte marquée menton, un type de filament intermédiaire. Plus l’image est lumineuse, plus Menton se trouve dans cette région.

Cela peut être lié à la rigidité du cytosquelette cellulaire. En utilisant la technique de cartographie de force A FM présentée ici, il est possible de montrer une carte de rigidité similaire d’un blaste à fibre avec une résolution de 32 par 32 pixels où chaque pixel représente 2,5 par 2,5 microns de surface cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, il aura une bonne idée de la façon d’utiliser la microscopie à force atomique pour mesurer l’élasticité des cellules de tissus vivants.