Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

L’objectif global de l’expérience suivante est de marquer les protéines d’intérêt avec des phosphates radioactifs afin de quantifier les niveaux de phosphorylation cellulaire des protéines. Ceci est réalisé en cultivant des cellules en présence de phosphore 32 pour marquer radioactivement les modifications phosphate des protéines exprimées dans les cellules. Dans un second temps, les cellules marquées sont lysées et les lysats sont incubés avec des billes d’affinité pour l’immuno purification des protéines à analyser.

Ensuite, des échantillons de protéines marquées et purifiées sont analysés sur du sodium do desal sulfate, une électrophorèse sur gel de poly acrylamide et des membranes de fluorure de poly olaine. Afin de détecter l’incorporation de phosphate radioactif et les niveaux de protéines, on obtient des résultats qui montrent que les kinases répétées 1 et 2 riches en leucine, abrégées L rrk un et L rrk deux, sont phosphorylées dans les cellules à des niveaux comparables basés sur l’autoradiographie et l’immunodétection. L’un des principaux avantages de la technique de marquage métabolique par rapport à d’autres techniques telles que le phospho, l’immuno blotting, est que cette technique permet de déterminer les niveaux de phosphorylation cellulaire totale des protéines, y compris pour les protéines pour lesquelles aucun anticorps phospho n’est disponible.

Le deuxième avantage majeur de cette technique est qu’il est possible d’effectuer des comparaisons quantitatives entre différentes protéines dans leurs niveaux totaux de phosphorylation cellulaire. La démonstration de la procédure sera faite par F gao, un technicien de notre laboratoire Pour commencer la culture HEC 2 93 lignées de cellules T selon les conditions de culture standard en dcos modifiés aigle, milieu ou DMM avec 8 % de veau fœtal, sérum et gentamycine. Plaque d’expansion et expression de la protéine L rrk two marquée à triple drapeau par transfection ou transduction médiée par un vecteur lentiviral, comme indiqué dans le protocole de texte.

Lorsque les cellules sont confluentes à 80 à 100 %, rincez-les avec un dmm préchauffé sans phosphate. Sous un écoulement laminaire, préparez un tube de faucon avec 2,1 millilitres de DM sans phosphate par m par plaque de six puits de cellules à marquer au phosphore. 32 orthophosphate.

Préparez le banc sur lequel les expériences avec les rayonnements ionisants seront effectuées. L’espace de travail est recouvert d’un tapis anti-éclaboussures sur lequel est placée une doublure de protection en matériau absorbant. Prévoyez également un pot en plexiglas sur l’espace de travail et placez le tube de milieu sans phosphate à l’intérieur.

Sortez du réfrigérateur le récipient doublé de plomb contenant la fiole d’orthophosphate marqué au phosphore 32 et apportez-le au banc de radioactivité. Surveillez la contamination radioactive externe du récipient à l’aide d’un compteur Geiger : diluez l’orthophosphate marqué au phosphore 32 dans le tube de dmem sans phosphate. Ajouter une concentration de 24 micro-curies par millilitre.

Conservez le tube dans le pot en plexiglas. Fermez le récipient avec le reste de l’orthophosphate marqué au phosphore 32 avant de le remettre dans le réfrigérateur. Ensuite, retirez de l’incubateur les six plaques de puits avec les cellules à étiqueter et placez-les sur le banc de radioactivité.

Retirer le surnageant moyen et le jeter. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu sans phosphate contenant du phosphore. 32 orthophosphate marqué par puits.

Placez les plaques de culture dans une boîte en plexiglas, puis surveillez le récipient pour détecter toute contamination radioactive externe à l’aide d’un compteur Geiger. Transférez ensuite la boîte en plexiglas avec les cellules dans un incubateur de cellules eucaryotes dédié au marquage métabolique isotopique et incubez les cellules pendant une à 20 heures. À ce stade du protocole, les cellules peuvent être traitées avec un composé si vous le souhaitez, comme indiqué dans le protocole textuel. Après le traitement cellulaire et l’incubation, retirer le milieu des cellules et le jeter dans un tube de collecte de déchets qui est placé dans le bocal en plexiglas.

Rincez les cellules deux fois avec deux millilitres de sérum physiologique tris-tamponné glacé. Jeter la solution de rinçage dans le tube de collecte des déchets. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de tampon de lyse d’immunoprécipitation glacé dans chaque puits et collectez le lysat en pipetant de haut en bas.

Afin de détacher toutes les cellules lysées, transférez le lysat dans un micro tube à centrifuger et incubez sur de la glace au moins 10 minutes avant la centrifusion comme indiqué dans le protocole textuel pour isoler la protéine d’intérêt par immunopurification. Tout d’abord, transférez les microtubes de centrifugation avec des lysats de centrifugation dans la glace. Ensuite, pipetez le surnageant dans des tubes de micro-centrifugeuse contenant un lit de 10 microlitres Volume du drapeau M deux vitesses aro.

Une fois équilibrés comme indiqué dans le protocole de texte, transférez les microtubes de centrifugation dans un tube de 50 millilitres. Après avoir transféré les microtubes de centrifugation dans des tubes de 50 millilitres étiquetés sur de la glace, placez les échantillons sur un dispositif rotatif derrière un bouclier en plexiglas dans la zone désignée d’une chambre froide pour un mélange bout à bout à quatre degrés Celsius pendant une à 20 heures après l’incubation, faites tourner le drapeau lié aux protéines M deux aro billes dans des tubes de micro-centrifugeuse après avoir jeté le surnageant dans un tube de collecte des déchets. Procédez au lavage des perles comme indiqué dans le protocole de texte.

Ensuite, remettez en suspension les billes lavées dans 40 microlitres de tampon de chargement SDS de l’échantillon IP Chauffez les échantillons dans le tampon de chargement à 95 degrés Celsius pendant deux minutes avant de centrifuger pendant une minute à plus de 1000 fois g pour granuler les billes, préparez le module d’électrophorèse sur gel de protéines sur le banc de radioactivité derrière un tamis perspec. Chargez les échantillons sur des gels de page SDS de trois à 8 % de tris-acétate comprenant un marqueur de poids moléculaire qui convient pour discerner les tailles de protéines de haut poids moléculaire avant d’effectuer une électrophorèse. Après l’électrophorèse, retirer le gel de son enveloppe en plastique et le transférer dans un récipient avec un tampon de transfert Western Blot.

Après préparation du gel et de la membrane PVDF. Préparez le sandwich buvard sur la surface du module de transfert semi-sec comme décrit dans le protocole texte. Transférez les protéines à 15 volts pendant une à deux heures après le transfert.

Retirez la membrane PVDF avec les protéines blotted du module de transfert et séchez la membrane pour effectuer une auto-radiographie. Tout d’abord, exposez la membrane à une plaque de phosphorescence pendant un à cinq jours. Lisez le phosphore 32 sur la plaque de phosphorescence exposée à l’aide d’un scanner de phosphorescence et enregistrez l’image sous forme de tiff haute résolution pour détecter les niveaux de protéines via l’immunodétection.

Réhydratez les membranes en les trempant brièvement dans du méthanol, puis en les transférant dans un récipient d’incubation peu profond avec PBS. Bloquez les membranes dans le PBST contenant 5 % de lait. Incuber les transferts avec un anticorps anti-LR K two ou un anticorps anti-drapeau et poursuivre le traitement avec des étapes de lavage appropriées et une incubation secondaire de l’anticorps.

Après l’application d’anticorps, effectuer une détection par chimiluminescence pour confirmer les niveaux relatifs de protéines de LRRK deux. Enfin, la quantification de la corporation du phosphore 32 dans LRK deux à l’aide de l’analyse diamétrale décrite dans le protocole textuel Voici des résultats représentatifs du marquage métabolique de L Rrk un et L Rrk deux dans les cellules T HEC 2 93. On voit un autoradiogramme représentatif de l’incorporation du phosphore 32 ainsi qu’un transfert western représentatif de la détection de L Rrk un et L Rrk deux par leurs étiquettes à triple indicateur.

L’incorporation de phosphate radioactif est observée pour L rrk un et L rrk deux. Lors de la quantification des niveaux de phosphore 32 normalisés aux niveaux de protéines mesurés par analyse métrique de la densité de l’immunodétection avec l’anticorps Anti-Flag. Il a été constaté que L rrk one avait un niveau de phosphorylation moyen qui est inférieur à L rrk deux dans les conditions testées, bien que la signification statistique ne soit pas atteinte, N’oubliez pas que le travail avec la radioactivité peut être extrêmement dangereux et que les précautions telles que l’équipement de protection très individuel et le travail via les procédures fournies par le service de sécurité de votre établissement doivent toujours être prises lors de l’exécution de ce protocole.