Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l'aide Time-lapse de microscopie confocale

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer un enregistrement en direct de la migration des cellules de la crête neurale afin de montrer la formation des structures faciales crâniennes en développement. Ceci est accompli en montant d’abord un poisson-zèbre transgénique SOX 10 KD anesthésié dans de l’agarose afin de minimiser les mouvements tout au long de l’expérience. Ensuite, sous un microscope confocal, la photo-activation UV est effectuée pour convertir KD du vert au rouge dans les cellules de la crête neurale.

Ensuite, en se concentrant sur les cellules de la crête neurale photoconverties. Un Zack est généré de la structure en développement avant qu’une vidéo en accéléré ne soit enregistrée. Des résultats sont obtenus qui montrent le développement de cellules de la crête neurale crânienne dans le palais primaire du poisson-zèbre dans un embryon de poisson-zèbre transgénique SOX 10 KD.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’imagerie statique, est que des processus de développement complexes tels que la migration cellulaire peuvent être visualisés en temps réel. Cela rend les résultats plus accessibles à la communauté scientifique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la formation des structures dérivées des cellules de la crête neurologique et la façon dont les gènes PTO influencent leur développement.

Pour vous préparer au montage des embryons, utilisez une fiole de 125 millilitres pour mélanger de l’eau E trois avec un micro-ondes aéros à bas point de fusion pour dissoudre la solution. Ensuite, ajoutez de la trica et placez le flacon dans un bain-marie à 50 degrés Celsius pour garder au chaud et imbriquer les liens fluorescents brillants transgéniques soine KD embryons de poisson zèbre à 60 heures après la fécondation. Ensuite, transférez-les chacun sur une lame de chambre avec du papier de soie.

Absorbez l’excès d’eau E trois, puis utilisez la solution d’agarro pour couvrir l’embryon. À l’aide d’une pointe de micro-chargeur, positionnez l’embryon parfaitement dorsalement, en veillant à ce que les embryons soient complètement immergés dans l’agarro. Une fois l’agarro réglé, utilisez E trois 0,015 % trica pour remplir la diapositive de la chambre afin d’effectuer la conversion photo.

Commencez par utiliser un objectif d’immersion dans l’air 20 x pour vous concentrer sur l’embryon. Appuyez ensuite sur le bouton d’éclairage L 100 du microscope et sélectionnez les canaux dans le logiciel. Ouvrez les icônes.

Affichez les commandes d’acquisition A un réglages, puis cliquez sur le bouton de configuration confocale. Ensuite, cliquez sur auto et sélectionnez DPI 4, 88 et 561.9 pour les canaux 1, 2 et 3 respectivement avant de refermer la fenêtre. Désactivez ensuite les canaux un et trois avant de cliquer sur le bouton de suppression du verrouillage et d’appuyer sur le bouton de balayage à partir d’une image par seconde et HV 200.

Commencez à vous concentrer sur les cellules d’intérêt. Augmentation progressive du nombre d’images par seconde jusqu’à une pour 32, et réduction de la tension à 100 à 120 en fonction du bruit de fond. Lorsque l’embryon est net, saisissez le bord vert sur le bord droit de l’écran et rétrécissez-le pour l’adapter à la zone à convertir en photo avant de faire un clic droit avec la souris.

Changez le nombre d’images par seconde à un et le nombre d’images HT à 200 et appuyez sur scan. Une image agrandie de la zone de conversion de photos sera désormais visible. Photo suivante.

Convertissez les cellules en activant le premier canal pendant cinq à 60 secondes jusqu’à ce que le signal KD vert soit presque absent. Désactivez ensuite la chaîne dappy. Activez les canaux deux et trois pour revenir au zoom d’origine.

Faites un clic droit sur la fenêtre de zoom et choisissez revenir à la taille d’origine pour vérifier si les cellules souhaitées ont été converties correctement en photo. Définissez les limites du Zack en choisissant l’icône Capture Z Series dans la barre de menus. Ajustez les tables de recherche ou uts pour configurer un laps de temps.

Choisissez la case A une interface graphique simple et cochez les paramètres suivants. Une toutes les 32 images par seconde. Taille 1024 et en moyenne quatre ou huit x selon le nombre de piles Z qui doivent être prises en une seule boucle.

Ensuite, allez dans la vue des commandes d’acquisition ND et définissez la période. Cliquez ensuite sur Continu, puis sur Zack. Définissez les bordures comme indiqué précédemment.

Démarrez le film, ajoutez une solution E trois à 0,015 % trica dans la chambre, faites glisser tout au long de la journée et remplissez complètement la chambre pour l’imagerie pendant la nuit. Une fois l’imagerie terminée, créez une vidéo de haute qualité à partir du fichier d’imagerie en cliquant sur afficher la projection d’intensité maximale. Faites ensuite un clic droit sur l’image et créez un nouveau document.

Supprimez les cadres inutiles et ajustez les L uts. Dans ce film montrant la genèse de Palato chez le poisson-zèbre, la ligne transgénique SOX 10 K est utilisée pour suivre les cellules de la crête neurale crânienne au fur et à mesure qu’elles se développent pour former le palais primaire. Les cellules les plus antérieures du palais en formation sont photoconverties du vert au rouge 60 heures après la fécondation.

Lorsque les trabécules appariés se sont rencontrés pour former le palais primaire, ces cellules sont ensuite suivies jusqu’à ce qu’elles atteignent leur destination finale. Ce film démontre un développement perturbé du palais conduisant à la formation d’une fente orofaciale, médiée par Morino. Un gène impliqué dans la fente faciale oblique est utilisé à titre d’exemple.

À 60 HPF, la photoconversion unilatérale des cellules de la plaque ethmoïdale la plus antérieure montre une défaillance de l’épanchement entre les cellules de la plaque ethmoïdale médiane et latérale. Ce défaut ressemble à la pathogenèse du développement de la fente faciale oblique chez l’homme, où se produit une insuffisance de l’épanchement entre le processus nasal latéral et la proéminence maxillaire. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour explorer le développement des cellules de la crête neurologique chez le poisson zèbre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser cette méthode pour capturer le processus de développement qui vous intéresse.