Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l'aide Time-lapse de microscopie confocale

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire un enregistrement en direct en accéléré de la migration des cellules de la crête neurale afin de montrer la formation des structures faciales crâniennes en développement. Pour ce faire, on commence par monter un poisson zèbre transgénique SOX10 KD anesthésié dans de l'agarose afin de minimiser les mouvements durant toute la durée de l'expérience. Ensuite, sous un microscope confocal, une activation photochimique par rayonnement UV est réalisée pour convertir la fluorescence du marqueur KD du vert au rouge dans les cellules de la crête neurale.

Ensuite, on se concentre sur les cellules de la crête neurale photoconverties. Un empilement en profondeur (Zack) de la structure en développement est généré avant l'enregistrement d'une vidéo en accéléré. Les résultats obtenus montrent le développement des cellules de la crête neurale crânienne formant le palais primaire du poisson zèbre dans un embryon transgénique de poisson zèbre à ARN d'interférence dirigé contre SOX10 (SOX10 KD).

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'imagerie statique, est que des processus développementaux complexes, comme la migration cellulaire, peuvent être visualisés en temps réel. Cela rend les résultats plus accessibles à la communauté scientifique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la formation des structures dérivées des cellules de la crête neurale et l'influence des gènes PTO sur leur développement.

Pour préparer le montage des embryons, utilisez un flacon de 125 millilitres pour mélanger l’eau E3 avec de l’agarose à bas point de fusion en chauffant au micro-ondes afin de dissoudre la solution. Ajoutez ensuite du trica et placez le flacon dans un bain-marie à 50 degrés Celsius pour maintenir la solution au chaud. Incubez les embryons de poisson zèbre transgéniques fortement fluorescents à 60 heures post-fécondation. Transférez-les ensuite individuellement sur une lame à chambre à l’aide de papier essuie-tout.

Éliminer l'excès d'eau E3, puis utiliser la solution d'agarose pour recouvrir l'embryon. Utiliser une micropipette pour positionner parfaitement l'embryon en position dorsale, en veillant à ce que les embryons soient complètement immergés dans l'agarose. Une fois que l'agarose a durci, utiliser du E3 contenant 0,015 % de trica pour remplir la lame à chambre afin d'effectuer la conversion photo-induite.

Commencez par utiliser un objectif à immersion dans l'air de 20 x pour focaliser sur l'embryon. Ensuite, appuyez sur le bouton lumineux L 100 du microscope et sélectionnez les canaux dans le logiciel. Ouvrez les icônes.

Accédez aux paramètres des contrôles d'acquisition de la vue A, puis cliquez sur le bouton de configuration du dispositif confocal. Ensuite, cliquez sur auto et sélectionnez DPI 4 88 et 561,9 respectivement pour les canaux 1, 2 et 3, avant de refermer à nouveau la fenêtre. Puis désactivez les canaux un et trois avant de cliquer sur le bouton de désactivation du verrouillage, puis appuyez sur le bouton de balayage en commençant par une image par seconde et une tension de 200 HV.

Commencez par focaliser les cellules d'intérêt. Augmentez progressivement le nombre d'images par seconde jusqu'à une image toutes les 32, et réduisez la tension à 100-120 selon le bruit de fond. Lorsque l'embryon est en netteté, saisissez le contour vert situé au bord droit de l'écran et rétrécissez-le pour ajuster la zone à photoconvertir avant de cliquer avec le bouton droit de la souris.

Modifier les images par seconde à une et la tension haute à 200, puis appuyer sur numériser. Une image agrandie de la zone de conversion photochimique sera désormais visible. Photo suivante.

Transformer les cellules en activant le canal un pendant une durée allant de cinq à 60 secondes, jusqu’à ce que le signal vert de KD soit presque absent. Ensuite, désactiver le canal dappy. Activer les canaux deux et trois pour revenir au zoom d’origine.

Cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre de zoom et choisissez revenir à la taille d'origine pour vérifier si les cellules souhaitées ont été correctement photo-converties. Définissez les limites du Zack en sélectionnant l'icône Capturer la série Z dans la barre de menu. Ajustez les tables de correspondance ou les uts pour configurer un laps de temps.

Choisissez la case A avec une interface graphique simple et activez les paramètres suivants. Un par 32 images par seconde. Taille 1024 et moyenne de quatre ou huit x selon le nombre de coupes Z à effectuer en une seule boucle.

Ensuite, accédez aux commandes d'acquisition de la vue pour l'acquisition de séquence ND et définissez la durée. Cliquez ensuite sur continu, puis sur Zack. Réglez les limites comme indiqué précédemment.

Démarrez le film, ajoutez une solution de trica à 0,015 % E trois dans la chambre, faites glisser tout au long de la journée et remplissez complètement la chambre pour l'acquisition d'images pendant la nuit. Une fois l'acquisition terminée, créez une vidéo de haute qualité à partir du fichier d'images en cliquant sur Afficher la projection d'intensité maximale. Ensuite, cliquez avec le bouton droit sur l'image et créez un nouveau document.

Supprimez les cadres inutiles et ajustez les courbes L. Dans ce film montrant la palatogenèse chez le poisson zèbre, la lignée transgénique SOX10-K est utilisée pour suivre les cellules de la crête neurale crânienne au fur et à mesure qu'elles se développent pour former le palais primaire. Les cellules les plus antérieures du palais en formation sont photoconverties du vert au rouge à 60 heures post-fécondation.

Lorsque les travées conjuguées se sont réunies pour former le palais primaire, ces cellules sont ensuite suivies jusqu'à ce qu'elles atteignent leur destination finale. Ce film montre un développement palatin perturbé conduisant à la formation d'une fente orofaciale, induite par l'extinction de speck médiée par morino. Un gène impliqué dans les fentes faciales obliques, lb A, est utilisé comme exemple.

À 60 hpf, la photoconversion unilatérale des cellules les plus antérieures de la plaque ethmoïdale montre une effusion défectueuse entre les cellules de la plaque ethmoïdale médiane et latérale. Ce défaut rappelle la pathogenèse du développement d'une fente faciale oblique chez l'humain, où une effusion défectueuse entre le processus nasal latéral et la prominence maxillaire se produit. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie du développement pour explorer le développement des cellules de la crête neurale chez le poisson zèbre.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser cette méthode pour capturer le processus de développement qui vous intéresse.