Modification multi-échelle des implants métalliques avec des gradients des pores, polyélectrolytes et leur surveillance indirecte In vivo

L’objectif global de cette procédure est de modifier des implants métalliques à plusieurs échelles de longueur pour contrôler le comportement cellulaire in vitro et in vivo. Ceci est accompli en produisant d’abord un gradient de taille de pores dans des implants tubulaires tridimensionnels, méthode d’extraction Biofreeze. La deuxième étape consiste à développer des imitations de membrane basale nanofibrillaire basées sur la méthodologie du collagène et de l’alginate couche par couche.

Ensuite, une méthode indirecte pour surveiller de tels implants après l’implantation à l’aide de l’analyse du plasma sanguin. La HPLC et le séquençage peptidique ultérieur sont finalement démontrés : un implant où différentes zones peuvent accueillir différents types de cellules si nécessaire. Pour certains, des tissus multicellulaires peuvent être obtenus, bien que ce système puisse fournir un moyen de modifier les implants métalliques.

Il peut également être appliqué à des systèmes de modèles de culture cellulaire 3D tels que des tissus artificiels ou des modèles de maladies. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé de trouver une technique pour contrôler le mouvement cellulaire autour d’implants en titane poreux in vivo. Pour commencer cette procédure, nettoyez les implants et concevez et fabriquez des moules en téflon comme décrit dans le texte écrit pour la congélation et l’extraction.

Préparez la solution de polymère synthétique PLLA dans un mélange binaire de dioxine et d’eau en introduisant la poudre de polymère dans le solvant organique. Sur un Starr magnétique, chauffer le mélange à 60 degrés Celsius afin d’obtenir une solution homogène. Cette température est choisie parce qu’il s’agit de la limite supérieure de la résistance à la température des seringues en verre de précision à utiliser pour l’introduction de la solution dans les implants.

Pendant ce temps, calculez le volume de la solution polymère nécessaire par rapport à la porosité de l’implant en tenant compte de l’évolution du volume de la solution congelée. Ensuite, introduisez la solution dans les implants à l’aide de seringues en verre de précision avec une précision de 0,1 microlitre. La limite inférieure de la concentration du polymère est de 3 % pour la formation d’un gradient de PO reproductible, ou lorsqu’il devient difficile d’obtenir une distribution homogène dans les échantillons épais au-dessus de 6 %, congelez les échantillons soit directement à moins 80 degrés Celsius, soit avec une période d’incubation préalable de 30 minutes à température ambiante.

Les conditions de gel déterminent en partie la formation des pores. Ainsi, les conditions de congélation peuvent être ajustées en fonction de la porosité visée. Conservez les échantillons toute la nuit à moins 80 degrés Celsius.

La séparation du moule à l’état congelé est une étape très difficile. Des précautions doivent être prises pour diminuer le contact de la solution de fond congelé avec le moule, à l’aide d’un cuir chevelu, Immerger les implants dans de l’éthanol pré-refroidi à 80 % pour obtenir des gradients de porosité. Utilisez un scalpel pré-refroidi pour retirer toutes les pièces du moule à l’exception de la vrille, pour les implants tubulaires et toutes les pièces sauf la partie inférieure pour les implants en forme de disque, effectuez l’extraction à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.

Après l’extraction, retirez les pièces restantes du moule et faites sécher les implants à l’air. Pour la caractérisation de la porosité globale de la structure. L’analyse de l’oxymètre de mercure est nécessaire.

Dans cet exemple, les mesures de l’oxymètre de mercure montrent des pics distincts qui correspondent aux pores des deux côtés de l’implant et aux pores plus petits entre les deux. Cependant, la donnée la plus cruciale est la différence entre les porosités des surfaces intraluminales et extraluminales, qui peuvent être analysées par l’image J pour la distribution de la taille des pores. Suite à la rupture par congélation des échantillons en observant la section efficace avec un microscope électronique à balayage.

En raison de la nature poreuse ouverte des implants utilisés et de la capacité de réflexion de la lumière du titane, il est possible de faire des piles Z de cellules marquées à l’intérieur des implants poreux. Les cellules marquées avec de la PKH 26 ou de la poudre additive calcique peuvent être utilisées pour visualiser les implants avec la microscopie laser confocale pour l’accumulation de plusieurs couches. La reproductibilité la plus élevée est obtenue avec des robots de trempage.

Cependant, si un robot de trempage n’est pas disponible, ces étapes peuvent être effectuées manuellement. Pour préparer la solution de collagène, utilisez du collagène de type 1 de qualité médicale et de l’alginate de sodium. Les concentrations optimisées sont de 0,5 gramme par litre pour chaque 150 millimolaires.

Le tampon de citrate de chlorure de sodium à pH 3,8 dissout la solution de collagène pendant la nuit pour assurer l’homogénéité. Le pH acide de la solution de 3,8 est nécessaire pour une accumulation stable des couches car la structure est instable. Avant la réticulation.

En conception à pH neutre, un support spécifique pour l’utilisation des implants avec des robots de trempage utilisés dans la production de polyélectrolytes multicouches. Déposez les couches à la surface des implants en titane uniquement ou des implants modifiés comme décrit dans le texte. À l’aide d’un système de robot de trempage, on plonge d’abord les implants dans une solution d’alginate pendant 15 minutes, puis on rince la structure avec 150 millimolaires de chlorure de sodium à un pH de 3,8 pendant cinq minutes.

Poursuivez avec une immersion dans une solution de collagène pendant 15 minutes. Pour stabiliser d’abord la membrane basale, préparez la solution de réticulation à 100 millimolaires de genin. Dans le tampon de citrate A-D-M-S-O, à un rapport volumique de un à quatre, dissoudre la génine dans le composant DMSO puis au niveau de l’eau pour éviter l’agglutination, réticuler les échantillons par immersion dans la solution de réticulation entre 12 et 24 heures après.

Rincer avec de grandes quantités de tampon de citrate à pH 3,8 Après avoir lavé les étapes, stérilisez les échantillons soit avec un traitement UV pendant 30 minutes, soit dans un bain antibiotique antifongique. Les principaux paramètres qui déterminent la qualité de l’imitation de la membrane basale sont son épaisseur et le diamètre des fibres. Calculez les diamètres des fibres à l’aide de la microscopie à force atomique ou d’une image FM obtenue en mode contact.

Après séchage des échantillons avec un flux d’azote, avant l’imagerie, quantifier l’épaisseur d’au moins 10 fibres par image pour déterminer l’épaisseur fibrile moyenne. Avec le logiciel Image J, après séchage des films multicouches de collagène alginate de collagène 24, l’épaisseur des films peut ensuite être déterminée par des tests de rayure. À l’aide d’un FM d’abord, utilisez une aiguille de seringue pour gratter le film après localisation de la rayure avec un microscope optique, obtenez des images avec un FM sur des surfaces de 10 par 10 microns carrés à la limite de la rayure.

Calculez les hauteurs à partir des profilés obtenus avec le logiciel A FM, qui fournit l’épaisseur de la couche de film. Après avoir implanté le dispositif dans la trachée des lapins comme décrit dans le texte, prélevez des échantillons de sang dans leurs veines auriculaires, centrifugez les échantillons à 5 000 tr/min pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Utiliser le surnageant obtenu pour l’analyse après extraction du plasma de lapin avec 0,1 % d’acide trior acétique.

Effectuer la purification HPLC en phase inverse de la teneur en protéines plasmatiques en purifiant l’extrait à l’aide d’une colonne de cellule de noyau en phase inverse 305 C 18. Enregistrez l’absorbance à 214 et 280 nanomètres à l’aide du système de solvant et du débit trouvés dans le protocole de texte. Récupérez les fractions de pointe avant de les concentrer par évaporation.

En utilisant l’application de vide rapide, il est important d’arrêter le vide rapide avant le séchage complet. Corréler les pics obtenus à différents moments au cours de la période d’implantation. Utilisez les peptides purifiés qui montrent des tendances constantes au cours de l’implantation pour l’identification par séquençage automatique d’Edmond.

Chargez l’échantillon sur des filtres en fibre de verre traités poly brain pour déterminer la séquence terminale finale des peptides purifiés par dégradation automatique Edmond à l’aide d’un micro séquenceur professionnel. L’étape suivante est l’identification du phényle th et d’un acide aminé par chromatographie sur une colonne de C18. Une fois la séquence obtenue, elle peut être identifiée par un logiciel de dynamitage à l’aide de la base de données Swiss Prote.

En modifiant la concentration de la solution PLLA, il est possible de contrôler la taille des pores du côté luminal supplémentaire des implants. La taille et la forme des pores ont été considérablement affectées par la présence d’implants en titane. La taille des pores variait de 40 à 100 micromètres, l’utilisation de concentrations plus faibles entraînant des pores plus petits, tandis que la taille des pores latéraux intraluminaux était régie par l’extraction restreinte et était d’environ neuf microns, ce qui est inférieur à la taille moyenne des fibroblastes.

En ajoutant une étape d’incubation à température ambiante, il est possible d’obtenir des structures à double porosité où les parois des pores les plus grands ont leur propre porosité. Cette caractéristique est importante pour les implants épais car elle faciliterait le mouvement des gaz et des nutriments. Une fois le gradient de pores formé, il est possible d’ajouter la couche de film d’alginate de collagène sur le dessus de la structure.

Cette couche de film est stable sur le dessus de la mousse PLLA et peut également être maintenue à la surface en l’absence de la formation de fibres de collagène à l’échelle nanométrique. Au fur et à mesure que la couche de film augmente, la croissance du film est exponentielle. Ainsi, on peut obtenir un film épais de plusieurs centaines de nanomètres.

Les implants en titane poreux s’intègrent au tissu hôte et sont complètement remplis entre quatre et six semaines in vivo, comme le montrent les coupes transversales de l’implant explanté. Le tissu à l’intérieur des pores est un tissu conjonctif mature avec un bon niveau de vascularisation. Au cours de cette période, l’analyse HPLC a montré des pics distincts qui fluctuent au cours de l’implantation.

Les fractions maximales d’intérêt ont été séquencées et déterminées comme étant des demi-chaînes d’hémoglobine alpha et bêta, qui avaient montré une tendance similaire avec les lectures de protéines C-réactives. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des gradients PO multi-échelles 3D pour la modification d’implants métalliques et pour des expériences de culture cellulaire.

L’extraction par congélation et la formation de couche par le film sont des métaux simples pour développer vos propres implants modifiés ou microenvironnements pour les cellules.