Synthèse, Livraison cellulaire et In vivo Utilisation de capteurs de pH à base de dendrimères

L’objectif global de l’expérience suivante est de développer de nouveaux capteurs fluorescents basés sur des tambours Dun avec des propriétés améliorées pour l’imagerie du pH in vitro dans des cellules vivantes et in vivo. Ceci est réalisé en conjuguant d’abord des colorants sensibles au pH à un échafaudage dendritique avec d’autres fractions, telles que des groupes de ciblage ou le pH dans les colorants sensibles. Et des mesures in vitro sont prises pour générer une courbe d’étalonnage du pH à côté de l’image du pH dans les cellules vivantes.

Le capteur est délivré par électroporation et des cartes de pH sont générées à l’aide de la microscopie confocale pour imager le pH dans l’espace extracellulaire du cerveau. Lors de l’activité neuronale physiologique et pathologique, le capteur est micro-injecté dans le cerveau de souris anesthésiées. Les données de fluorescence sont ensuite acquises à l’aide de la microscopie à deux photons.

Les résultats obtenus montrent que les capteurs basés sur les gradateurs réussissent à mesurer les changements de pH avec une haute résolution spatiale et temporelle, à la fois dans les cellules vivantes et in vivo. Bien que plusieurs colorants de conduit de fumée avec un comportement sensible au pH aient déjà été utilisés, ils souffrent de plusieurs inconvénients, tels qu’une faible mobilité et des fuites cellulaires. De plus, ils ne permettent pas la mesure absolue métrique irréfléchie.

Ici, nous avons démontré la conation des colorants sensibles au pH à l’échafaudage génétique D, et comme les performances permettent une mesure précise avec une résolution spéciale et temporelle, cette méthode pourrait être un outil utile pour étudier les processus physiologiques et pathologiques régulés par le pH dans les cellules vivantes. La perturbation de la régulation du pH dans le système neurologique est associée à plusieurs affections telles que les accidents vasculaires cérébraux et l’épilepsie, et le capteur de pH disponible s’est avéré peu efficace, ce qui a conduit à la conception du capteur présenté. Bien que cette imagerie ait été appliquée ici, il s’agit d’une approche générale qui peut être appliquée à d’autres espèces biologiquement pertinentes.

En choisissant le colorant à détection de profit, l’approche synthétique simple et polyvalente rend ces procédures simples. Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody et Sebastian Suli feront la démonstration de la procédure aujourd’hui pour conjuguer les indicateurs de pH à Piam Demers. Commencez par dissoudre le rimer dans du DMSO anhydre à une concentration finale de 50 micromolaires.

Préparez 10 solutions mères micromolaires de fluorescéine NHS et de tétraéthyle RUMINE NHS, également appelées TMR dans un tube de micro-centrifugeuse combiné, un millilitre de solution de déderer G quatre pérams avec huit équivalents, ou 40 microlitres de fluorescéine et huit équivalents, ou 40 microlitres de TMR. Le rapport molaire dans le mélange reflétera la quantité de colorants chargés sur le demer. Remuez la solution à température ambiante pendant 12 heures.

Ensuite, diluez le mélange de un à 10 avec de l’eau désionisée et chargez le mélange réactionnel dans un sac de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons dialysez contre de l’eau désionisée et remplacez l’eau dans le réservoir trois fois sur 24 heures. Le lendemain, transférez la solution dans un flacon en verre et congelez-la à moins 80 pendant quelques heures. Lorsque la solution est complètement congelée, transférez le flacon dans un lyophilisant et lyophilisez-le pendant 24 heures.

Il faut obtenir une poudre violette, ondulée obtenue solide, et la dissoudre dans de l’eau mqe. À une concentration finale de 10 micromolaires. Distribuez la solution en aliquotes de 50 microlitres dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre et stockez-les à moins 20 degrés Celsius.

Pour l’étalonnage in vitro, préparez une solution de 500 nanomolaires de tambour D dans deux PBS millimolaires dans un vétérinaire Q à quartz. Un tampon PBS très dilué est utilisé pour éviter les changements brusques de pH pendant le titrage. Mesurez les spectres d’émission de fluorescéine et de TMR et optimisez les réglages optiques du fluorimètre pour obtenir un bon rapport signal sur bruit.

Ensuite, effectuez un titrage du pH en ajoutant de petits volumes de 0,1 hydroxyde de sodium normal et 0,1 d’acide chlorhydrique normal. Après chaque ajout, secouez le vétérinaire Q pour mélanger. Attendez une minute l’équilibre, puis mesurez le pH à l’aide d’un pH.

spectres d’émission de fluorescéine et de RTM à micro-électrodes doivent être enregistrés pour chaque étape sans aucune modification. Dans les paramètres optiques, tracez l’intensité de fluorescence en fonction du pH. Pour le titrage, le signal de dominance de la tige ne doit pas être affecté par le pH.

Le signal de fluorescéine doit être une courbe sigmoïdale et doit être équipé d’un modèle de liaison unique avec une PK de 6,4 pour l’électroporation. Transférez six fois 10 à la cinquième cellules hela dans 72 microlitres dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre aux cellules remises en suspension. Ajouter du dendri ou une solution aqueuse à une concentration de deux micromolaires, ajouter trois millilitres, un tampon d’électroporation dans un tube de micropuration.

Ensuite, à l’aide d’un embout d’électroporation de 10 microlitres, aspirez les mélanges de cellules et de rimes. Ensuite, insérez la micropipette dans la station de pipette et réglez les conditions d’impulsion de micro-puration ici. La tension d’impulsion est réglée sur 1005 volts.

La largeur d’impulsion est réglée à 35 millisecondes et le nombre d’impulsions est réglé à deux après la plaque d’impulsion. 20 microlitres de cellules électroporées sur des boîtes à fond de verre avec un milieu frais sans antibiotiques. 12 heures après l’électroporation, imagez les cellules avec un microscope confocal à l’aide d’un ensemble de filtres standard pour la fluorescéine et r domine.

Concentrez-vous sur l’échantillon et ajustez la puissance du laser et le gain du détecteur pour maximiser le rapport signal/bruit. Si l’électroporation réussit, les cellules doivent être fluorescentes dans les deux canaux. La localisation dépend de la taille et de la charge du D sont utilisés. Souvent.

La localisation lysosomale solaire, qui se manifeste par de petites vésicules périnucléaires, est présente en raison d’une endocytose ou d’une compartimentation. Si la localisation lysosomale est prédominante, la majeure partie de la fluorescence est localisée à l’intérieur des vésicules et le signal poreux est observé dans le cytosol. Cela signifie une toxicité et les mesures doivent être éliminées.

Acquérez les deux canaux de manière séquentielle, acquérez plusieurs images et faites la moyenne des images pour améliorer la qualité de l’image. Pour générer une courbe d’étalonnage du pH, utilisez des tampons avec opfor à différents phs pour agglomérer les pH intracellulaire et extracellulaire à la même valeur. Acquérez au moins 20 images cellulaires par pH et mesurez au moins cinq points de pH 5,5 à pH 7,5.

Il rappelle que les pH B six sont toxiques pour les cellules mais peuvent être tolérés pendant une courte période, alors acquérez des images aussi courtes que possible. Si vous voyez un signe d’apoptose, jetez les cellules et recommencez. Suite à l’acquisition.

Utilisez l’image J ou un logiciel analogue pour l’analyse des données. Tout d’abord, déterminez le rapport vert/rouge. Ensuite, tracez le rapport en fonction du pH pour produire une tendance linéaire qui donnera une courbe d’étalonnage qui pourra être utilisée pour convertir le rapport en pH dans de futures expériences.

Pour la préparation d’échantillons in vivo, commencer avec C 57 noir six J et des souris femelles entre le 28e et le 70e jour postnatal. Après avoir anesthésié les souris avec de l’uréthane, effectuez un pincement des orteils pour vous assurer que l’animal est complètement anesthésié et appliquez une pommade oculaire pour réduire la réponse corticale au stress et l’œdème cérébral. Pendant la chirurgie, injectez deux milligrammes par kilogramme de poids corporel de dexaméthasone, phosphate de sodium par voie intramusculaire.

Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, rasez la tête de l’animal, puis placez un champ chirurgical et appliquez un gel de lidocaïne à 2,5 % sur le cuir chevelu. Utilisez des ciseaux pour couper le lambeau de peau recouvrant le crâne des deux hémisphères. Lavez l’os exposé avec une solution saline et une pince, retirez délicatement le périoste.

Cela fournira une meilleure surface d’adhérence. Pour la colle et le ciment dentaire, appliquez un poteau de tête en acier sur mesure avec une chambre d’imagerie centrale et à l’aide de cyanoacrylate, collez-le en place dans un uni à peu près parallèle au crâne sur la région corticale d’intérêt. Fixez le poteau en place avec du ciment dentaire blanc.

Fixez la tête de la souris et effectuez une craniotomie d’un diamètre de deux à trois millimètres en perçant sur la région d’intérêt. Fréquemment, tout au long de la procédure de forage, utilisez une seringue pour appliquer du LCR A stérile frais sur le crâne afin de minimiser l’échauffement du cortex pendant la chirurgie. Après la craniotomie, transférez l’animal à l’étape d’imagerie pour maintenir la tête immobile sous l’objectif.

Vissez la chambre d’imagerie sur le poteau réglable. Appliquez une bouche en plastique sur mesure reliée à l’oxygène. Cela fournira de l’air enrichi en oxygène pendant l’expérience pour faciliter la respiration des animaux.

Pour injecter le capteur dans le cortex cérébral, chargez une pipette en verre d’un diamètre de pointe de quatre millimètres et une électrode en chlorure d’argent. Avec la solution de DRUM à une micromolaire, l’électrode facilitera l’enregistrement des potentiels de champ extracellulaire avec un dispositif de micro-injection. Insérez la pipette dans le cortex à une profondeur d’environ 150 microns.

Injectez pendant une à deux minutes à une pression de 0,5 livre par pouce carré pour optimiser la configuration optique de l’imagerie. Ajustez la puissance du laser pour minimiser le blanchiment et les dommages causés par les photos. En règle générale, la puissance laser utilisée est d’environ 20 milliwatts et le gain PMT est maintenu constant à 667 volts.

Réglez la longueur d’onde du laser pour exciter le capteur à 820 nanomètres et dirigez le logiciel pour détecter simultanément la fluorescéine et la fluorescence dominante des bâtonnets à travers les filtres FTSE et TRIT standard. Réglez également la fréquence d’acquisition sur une fréquence d’images de deux hertz pour la correction de l’arrière-plan. Acquérez un cadre sombre avec l’obturateur laser fermé pour mesurer le bruit thermique moyen provenant des PMT et du piédestal.

Enfin, acquérez des images de fluorescence dépendantes du pH et stockez-les pour une analyse ultérieure. Analysez les données comme précédemment pour évaluer le comportement in vitro de la fluorescéine et de la rumine. Chargé sur le rimer, un titrage du pH a été effectué à l’aide d’un fluorimètre.

Cette figure montre un titrage typique d’une sonde de pH. La fluorescéine et la rumine peuvent être excitées séparément à 488 nanomètres et 550 nanomètres respectivement, ce qui permet une diaphonie minimale entre les deux canaux, comme on peut le voir clairement. La fluorescéine présente un comportement dépendant du pH tandis que le signal de dominance R ne change pas de manière significative dans la plage de pH physiologique.

Par conséquent, le rapport de ces deux signaux ne dépend pas de la concentration du capteur, mais uniquement du pH. Ensuite, pour délivrer l’indicateur intracellulaire, les cellules hela ont été électroporées avec les capteurs de décompte et l’imagerie confocale a été réalisée comme décrit dans cette vidéo. Ces images confocales montrent les cellules du canal de la fluorescéine à gauche, du canal R domine au milieu et affichées sous la forme d’une carte métrique du rapport de pH à droite.

De forts signaux de fluorescéine et de r domine sont observés, qui se localisent ensemble, démontrant l’intégrité de la structure du capteur. Une carte métrique de rapport est reconstruite en divisant les deux images pixel par pixel et est représentée par une pseudo échelle de couleurs. Pour calibrer la réponse du capteur à l’intérieur des cellules, un serrage du pH avec des ionophores a été effectué comme indiqué ici.

Les indicateurs réagissent facilement au pH par un changement du rapport vert-rouge. Les données résultantes ont été utilisées pour générer une courbe d’étalonnage permettant des mesures de pH précises. La tendance linéaire de l’étalonnage démontre la capacité du capteur à répondre au pH sans aucune perturbation de l’environnement cellulaire.

Pour démontrer comment les capteurs basés sur les dendri peuvent être utilisés pour l’imagerie in vivo, l’imagerie du pH a été réalisée dans le cerveau d’une souris anesthésiée dendri ou injectée. Les signaux de fluorescéine et de r domine ont été obtenus simultanément avec une excitation de 820 nanomètres, et la carte de rapport a été construite pixel par pixel, similaire aux mesures de cellules vivantes. Notamment, les indicateurs se localisent dans l’espace extracellulaire, les zones non fluorescentes de l’image identifient les corps cellulaires ou les petits vaisseaux sanguins pour vérifier la réponse du capteur au pH.

Nous avons utilisé l’hypercapnée. En effet, le dioxyde de carbone est connu pour modifier l’équilibre des tampons carbonatés dans le sang et les tissus, entraînant une acidification des tissus. Comme on le voit sur ce graphique, l’inhalation de 30 % de dioxyde de carbone est suffisante pour induire une forte réponse du capteur qui est complètement réversible lors de la ventilation de la souris.

Ces résultats démontrent le potentiel des capteurs embarqués pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques du pH dans les cellules vivantes et in vivo. A, notre procédure est compatible avec d’autres mesures comme les enregistrements électrophysiologiques. Cela a permis d’obtenir simultanément des informations complémentaires sur le processus biologique en cours.

Cette méthode, après son développement, a ouvert la voie à des chercheurs en biologie cellulaire et en neurobiologie pour explorer les processus régulés par le pH dans les cellules de culture et in vivo.