Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d'enquêter sur l'angiogenèse In vivo

L’objectif global de cette procédure est d’étudier l’angiogenèse dans la rétine néonatale de la souris. Ceci est accompli en nucléant d’abord les yeux postnatals, puis en appliquant un fixateur de la troisième étape consiste à disséquer soigneusement la rétine postnatale en forme de pétale, et la dernière étape consiste à colorer le système vasculaire rétinien. En fin de compte, la visualisation du système vasculaire de la rétine chez la souris est réalisée par coloration fluorescente et microscopie confocale.

La démonstration de cette procédure sera assurée par le Dr Simon Tlo, post-doctorant dans mon laboratoire, et Kathleen Allenson, ancienne membre de mon laboratoire. Tout au long de cette procédure, la température par défaut est la température ambiante. Commencez par placer un bébé souris tué sans cruauté sur le côté avec des ciseaux.

Retirez la peau qui recouvre l’œil. Ensuite, avec les ciseaux positionnés sous l’œil, coupez le nerf optique et les tissus environnants et soulevez l’œil. Transférez l’œil énucléé dans une plaque à 24 puits contenant un fixateur, soit 4 % de PFA en deux fois.

PBS procède à la dissection de l’œil suivant pendant qu’on est dans le fixateur. Le décalage entre les deux dissections oculaires sera d’une demi-minute. Avec de la pratique.

Laissez chaque œil se fixer pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, transférez-les deux fois dans du PBS froid sur de la glace pendant au moins cinq à 10 minutes. Avant d’isoler les rétines, prélevez autant d’yeux que vous le souhaitez dans le PBS, à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique qui a été coupée pour élargir le verrat.

Transférez les yeux dans une boîte de Pétri contenant deux fois du PBS sous un microscope à dissection. Enlevez toute graisse autour de l’œil à l’aide de pinces et de ciseaux. Percez le bord de la cornée avec des ciseaux tranchants et coupez autour de la cornée et de l’iris, jetez ces tissus.

Ensuite, insérez la pince entre la rétine et la sclérotique. Retirez la sclérotique en prenant soin de ne pas déchirer la rétine. La couche choroïde peut également être retirée tant qu’il n’y a pas de risque d’endommager la rétine.

Le fait de laisser la couche choroïde en place ne devrait pas affecter de manière significative la qualité de l’immunocoloration. Maintenant, à l’aide d’une pince, retirez le cristallin et l’humeur vitrée. Poursuivez avec l’ablation des vaisseaux aloïdes.

À l’aide d’une pince fine, rassemblez-les au centre de l’œil. Ensuite, retirez-les rapidement du centre de la rétine. Prenez soin d’enlever tout le chardon jaune, car si vous en laissez derrière vous, ils peuvent masquer vos résultats debout.

La rétine en forme de coupe doit maintenant être transférée dans une boîte de Pétri propre et rincée avec du PBS. Maintenant, dans la rétine. Faites quatre à cinq incisions radiales qui atteignent environ les deux tiers du chemin vers le centre.

Utilisez des ciseaux à ressort pour créer cette rétine en forme de pédale. Cette étape demande de la patience et de la pratique pour se perfectionner. Prélevez maintenant la majeure partie du PBS à l’aide d’une pipette de pâturage.

Cela aplatira la rétine. Retirez ensuite tout excès de PBS avec un petit morceau de papier absorbant. Ensuite, appliquez du méthanol à moins 20 degrés goutte à goutte sur la surface de la rétine jusqu’à ce qu’elle soit presque submergée, puis ajoutez généreusement du méthanol.

Les rétines deviendront blanches. Cette étape aide à fixer les rétines et facilitera la perméation. Transférez les rétines dans le méthanol froid dans un petit tube.

À l’aide d’une pipette en plastique de gros calibre. Laissez-les incuber dans le méthanol froid pendant au moins 20 minutes si nécessaire, les rétines peuvent rester dans le méthanol à moins 20 degrés pendant plusieurs mois. L’utilisation de l’anticorps n’est qu’ici.

Le cinéma ne peut pas être utilisé avec succès sur la rétine fixe maternelle. Dans ce cas, la rétine doit procéder directement à l’immunocoloration après les avoir aplaties en forme de pétale. Commencez par pipeter soigneusement le méthanol des rétines.

Ensuite, rincez les rétines rapidement et doucement en une fois PBS. Retirez le PBS et couvrez les rétines avec 100 microlitres de solution de bloc de permanente avec 5 % du sérum approprié. Réglez les rétines pour qu’elles secouent doucement pendant une heure plus tard.

Retirez la solution de bloc de permanente à l’aide d’une pipette et remplacez-la par 100 microlitres de solution de bloc de permanente contenant l’anticorps primaire ou étant sélectionnée avant. Ensuite, réglez les rétines pour qu’elles incubent pendant la nuit à quatre degrés Celsius et balancez-les le lendemain matin. Lavez les rétines quatre fois dans PBS TX pendant 10 minutes par lavage.

Appliquez un balancement doux pendant toutes les étapes de lavage. Si l’anticorps primaire n’est pas conjugué, ajoutez 100 microlitres de l’anticorps secondaire fluorescent approprié, dilué un à 200 dans du PBS tx. Incuber les rétines pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant quatre heures à température ambiante avec une légère agitation pour éliminer l’anticorps secondaire.

Lavez les rétines quatre fois dans PBS TX avec un balancement doux pendant 15 minutes par lavage. Procédez maintenant au montage. Transférez les rétines sur des lames à l’aide d’une pipette en plastique de gros calibre et retirez tout excès de P-B-S-T-X avec un mouchoir.

Ensuite, montez les rétines dans 50 microlitres d’or prolongé et recouvrez doucement la solution avec un lamelle. Pour permettre une extension prolongée de l’or, réfrigérez les lames pendant la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière le lendemain. Procéder à l’imagerie des rétines après la dissection.

La rétine doit ressembler à une fleur plate à l’aide de la sélection ISO B quatre Alexa 4 88. Les cellules endothéliales ont été colorées et apparaissent de couleur verte. Les cellules musculaires vasculaires de soutien ont été visualisées à l’aide du muscle lisse Antifa, l’actine la vue de faible puissance à l’aide d’un objectif cinq fois, a permis une vue d’ensemble de l’organisation vasculaire de la rétine en utilisant une combinaison différente d’anticorps.

Les cellules endothéliales peuvent être observées à l’aide d’une immunocoloration anti-CD 31, soutenant les parasites là où elles sont visualisées à l’aide d’un anticorps contre NG deux. Alternativement, les parasites de soutien ont été colorés avec de l’anti-desmin. La coloration anti-desmine visualise les processus des parasites en forme de doigt et aide à déterminer s’ils sont étroitement associés aux cellules endothéliales.

En revanche, la coloration anti NG deux délimite les noyaux de chaque parasite, ce qui est utile pour quantifier le nombre de cellules parasitaires dans le système vasculaire. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter de toucher et d’endommager la surface de la rétine avec vos outils de dissection. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration BD peuvent être effectuées afin d’étudier la prolifération de cellules spécifiques.