Microscopie intravitale pour l'imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

L’objectif général de cette procédure est de visualiser les structures subcellulaires des glandes salivaires murines. Ceci est accompli en exposant d’abord chirurgicalement les glandes salivaires sans les endommager. Dans un deuxième temps, l’animal anesthésié est immobilisé sur la platine du microscope.

Ensuite, les glandes salivaires sont soigneusement positionnées afin de ne pas compromettre leur fonction lors de l’étape finale. La souris est stabilisée à l’aide d’un support personnalisé afin de minimiser les artefacts de mouvement dus au rythme cardiaque ou à la respiration de l’animal. En fin de compte, la dynamique des structures subcellulaires peut être imagée par microscopie intra-vitale.

Avant l’anesthésie, pesez les souris pour déterminer la dose appropriée d’anesthésique. Ensuite, induire une pré-anesthésie par inhalation de fluor. Une fois que les animaux sont inconscients, confirmez la sédation toutes les 15 minutes par pincement et gardez les souris sous une lampe chauffante pendant toute la durée de la chirurgie.

Surveillez la température corporelle des animaux à l’aide d’un thermomètre à sonde rectale. Rasez maintenant le cou de la souris avec une paire de tondeuses électriques, puis utilisez une éponge de gaze imbibée d’éthanol pour essuyer la face ventrale du cou, en séchant l’excès d’alcool avec la lingette kim. Ensuite, utilisez une paire de pinces à épiler incurvées ternes pour soulever un petit morceau de peau à l’extrémité inférieure des muscles massiteurs et faites une petite incision.

Insérez les ciseaux dans l’incision, en pointant les pointes vers le haut vers le dessous de la peau et en ouvrant les lames plusieurs fois jusqu’à ce que la peau se soit séparée du tissu sous-jacent. Ensuite, en commençant près de la base des glandes salivaires où le canal nerveux et les vaisseaux sanguins relient la glande au reste du corps. Utilisez les ciseaux pour couper une bande de peau détachée de trois millimètres de large et 10 millimètres de long.

Après avoir nettoyé la zone de la plaie, l’ouverture résultante sera de forme ovale et mesurera environ huit sur 12 millimètres. Les deux glandes salivaires seront visibles. Utilisez une seringue pour appliquer du gel de couplage optique au milieu de la coupe, puis utilisez des morceaux frais de gaze stérile pour essuyer le gel vers l’extérieur de l’ouverture jusqu’à ce que tout le sang et les cheveux lâches soient éliminés.

Maintenant, utilisez une pince à épiler numéro sept pour trouver l’extrémité de la glande salivaire droite, en saisissant le tissu conjonctif à quelques millimètres au-dessus du haut de la glande. Ensuite, déchirez le tissu conjonctif autour de la glande sans blesser le parenchyme. Une fois la glande exposée, séparez doucement le tissu conjonctif de la glande, en éliminant tout saignement avec une solution saline.

Assurez-vous que tous les tissus conjonctifs sont séparés et que la glande est complètement exposée. Avant d’amener l’animal au microscope, placez un morceau épais de gaze et une compresse chauffante sur la platine du microscope, en recouvrant également le haut de la compresse chauffante d’un mince morceau de gaze. Placez une lamelle au centre de la scène.

Placez ensuite la souris sur son côté droit sur la gaze, en fixant l’animal avec un morceau de ruban adhésif sur le côté ventral de la patte avant droite et une suture en soie accrochée autour des incisives. Créez une certaine tension entre le fil et la patte et attachez-les à la scène. Avec plus de ruban de masquage, la glande salivaire devrait se reposer naturellement.

Au milieu de la lamelle. Utilisez des coins en plastique couplés à la platine du microscope pour stabiliser davantage la tête et le thorax de la souris. Ensuite, placez un petit morceau de tissu de nettoyage des lentilles sur la glande.

Étendez légèrement le presse-étoupe et placez un support personnalisé sur le presse-étoupe. Ensuite, couplez fermement le stabilisateur à la platine à l’aide d’une pince métallique et de ruban adhésif. Couvrez l’animal avec de la gaze et un coussin chauffant et surveillez la température des glandes exposées avec un thermomètre équipé d’une sonde thermique Immédiatement après avoir stabilisé l’animal, utilisez un éclairage par épifluorescence pour vous concentrer sur la surface de la glande.

Évaluer le flux sanguin dans les capillaires et la morphologie globale des tissus. Pour exciter le gène GFP, utilisez un laser de 488 nanomètres. Réglez la puissance de crête à 0,5 milliwatt pour éviter le photoblanchiment de la protéine de tomate en tandem.

Utilisez un laser de 561 nanomètres, en réglant la puissance de crête à un milliwatt. Évaluez maintenant la stabilité du tissu en pré-scannant la zone sélectionnée. Si la préparation n’est pas stable, ajustez l’animal en conséquence pour trouver le bon plan focal.

En mode pré-impression. Déplacez progressivement l’objectif vers la lamelle jusqu’à ce que les structures ASER, les granules sécrétoires et la membrane plasmique deviennent clairement visibles. Ensuite, pour imager la dynamique des granules sécrétoires, utilisez une vitesse de balayage de 0,5 à deux secondes par image et de 256 par 256 pixels avec une échelle spatiale de 0,2 micromètre par pixel.

Afin de visualiser de manière optimale les granules et la membrane plasmique, réglez l’épaisseur optique entre 0,9 et 1,2 micromètre. Ensuite, enregistrez une image du champ de vision à utiliser comme point de référence. Enfin, stimulez l’exocytose en injectant par voie sous-cutanée 0,1 milligramme par kilogramme d’isoprotérénol et de solution saline fraîchement préparés.

Une minute après l’injection. La fusion des granules sécrétoires avec la membrane plasmique sera détectée par une augmentation de la fluorescence GFP autour des granules et la diffusion du peptide de tomate en tandem dans leurs membranes limitantes. Chez la souris tomate GFPM, les asinine apparaissent comme des structures clairement distinctes qui expriment la GFP cytosolique et le peptide de tomate en tandem ciblé sur membrane, comme l’indiquent les lignes brisées.

Chez les cellules individuelles asinine, les cellules aser sont délimitées par le peptide de tomate en tandem, comme indiqué par les flèches. La GFP est également détectée dans les noyaux qui sont clairement visibles à l’intérieur des cellules ASER. La GFP cytosolique indiquée par la pointe de la flèche est exclue des granules sécrétoires qui apparaissent sous la forme de vésicules circulaires sombres d’environ un à 1,5 micromètre de diamètre.

Pour visualiser les événements exophytiques, une zone représentative de la membrane plasmique qui est enrichie en granules sécrétoires comme indiqué par l’astérisque est mise en évidence après l’injection de l’isoprotérénol. On peut observer une augmentation des niveaux de fluorescence de la GFP indiquée par les flèches vertes autour de certains des granules sécrétoires qui se trouvent à proximité de la membrane plasmique. De plus, après fusion avec la membrane plasmique, le peptide de tomate tandem se diffuse dans les membranes limitantes des granules sécrétoires, comme le soulignent les flèches rouges.

Au bout de 30 à 40 secondes, les granules secrétaires s’affaissent progressivement et leurs membranes limitantes s’intègrent dans la membrane plasmique apicale. L’approche présentée ici représente une percée majeure en biologie cellulaire car elle permet d’imager la dynamique d’un processus spécifique de trafic membranaire chez la souris vivante.