Name: Des circuits neuronaux enregistrement à partir dun cancrelat système nerveux Intact (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez l'enregistrement extracellulaire des signaux sensoriels dans le système nerveux intact du cancrelat. Cette méthode d'électrophysiologie permet d'étudier l'intégration des informations mécanosensorielles dans le SNC.

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Nous remercions Hyewon Cooper pour les illustrations.

Une. Dissection Solution saline cafard utilisé dans ce protocole a la composition suivante: Solution saline cafard 36: (grammes pour 100 ml) 210 mM de NaCl (1,227 g) MM KCl 2,9 (0,0216 g) 1,8 mM de CaCl 2 (0,0265 g) 0,2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1,8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7,2. Ajuster le pH avec du NaOH 1 M ou 1 M de HCl). <ol><li> Sélectionner un cafard mâle de la cuve de rétention qui a cerci robuste (figure 1). Les derniers segments de l&#39;homme sont étroites par rapport à la femme, et ne contenant pas les ovaires et la masse des oeufs, les mâles sont plus faciles à disséquer. Les mâles de P. americana ont une paire de stylets courts entre la cerques. Ces stylets sont pas observées chez les femelles. </li><li> Couper les ailes, les jambes et la tête et la broche du corps, face ventrale vers le haut, à une dish bordée d&#39;élastomère de silicone. </li><li> Avec des pinces ramasser les plaques ventrales et les couper avec des ciseaux fins, à partir de l&#39;extrémité postérieure et antérieure de travail. Toujours garder les organes internes humide avec une solution saline, tout en essayant de garder le cerci sec. On peut utiliser de la cire ou des morceaux de caoutchouc pour positionner les haut de l&#39;abdomen afin de prévenir la saline de mouiller le cerques. Si elles ne sont mouillées, séchez-les avec un morceau de papier de soie. Poussez sur le côté les organes internes et la substance blanche (corps gras). La VNC est au centre du champ, court le long de l&#39;abdomen et doit être visible entre les trachées brillant. Le cordon nerveux est translucide et peut être initialement difficile de voir que l&#39;éclairage est réglé correctement (Figure 2). NE PAS manipuler le VNC avec une pince ou des broches d&#39;insectes, au lieu de manipuler à l&#39;aide de sondes de verre. </li><li> Dégagez le système de trachées de l&#39;animal le mieux possible de la corde nerveuse avec une pince et d&#39;une paire de nécessité de verre finles, divisé très soigneusement les connecteurs VNC longitudinalement entre A6 et A5 ou A5 et A4 ganglions (Figure 3). Cradle la cerques et l&#39;abdomen vers le haut du bain de solution saline avec des épingles à insectes raccourcis et de la cire ou un coin de l&#39;élastomère de silicone qui peut être coupé pour s&#39;adapter à la préparation (figures 4A et B). Soyez très prudent dans le dernier segment abdominal de ne pas endommager les nerfs Cercal qui se projettent dans le ganglion (figures 2D et 5). </li></ol> 2. Enregistrement extracellulaire <ol><li> La préparation, microscope, et appareil d&#39;enregistrement doit être disséqué installation dans une cage de Faraday pour bloquer particulier AC, les champs électriques externes, qui pourraient l&#39;emporter sur les signaux des neurones (Figure 6). </li><li> Placez le microscope de sorte qu&#39;il est sur la platine du microscope. Une fois que la préparation est placée sur la scène, ajuster la position du faisceau d&#39;éclairage de haute intensitépour une meilleure visualisation de celui-ci. </li><li> Connectez l&#39;amplificateur différentiel AC / DC à l&#39;unité d&#39;enregistrement de données intégrée (des détails sur les paramètres matériels et logiciels spécifiques ont été décrits précédemment 25). L&#39;étape de maintien de tête d&#39;une électrode d&#39;aspiration doit être connecté à l&#39;amplificateur. Un fil de masse d&#39;argent qui a été enduit avec Cl - inséré dans les résultats de l&#39;abdomen dans les enregistrements les plus stables. La raison en est que si la solution dans la cavité du corps n&#39;est pas en contact avec le fluide de bain dans la cuvette, le fluide associé à l&#39;électrode d&#39;enregistrement qui reste reliée à la masse. </li><li> Réglez la fréquence d&#39;enregistrement à 4 kHz. Définir l&#39;échelle de la tension (axe des y) à 500 mV (ce peut être ajustée pour optimiser la visualisation de la trace). Lancez le logiciel d&#39;enregistrement en mode continu ou un oscilloscope pour enregistrer l&#39;activité neuronale en réponse à des stimulations. </li><li> Couper l&#39;une des connecteurs VNC proches de A5 et placez l&#39;extrémité de coupe attaché à A6 dans une électrode d&#39;aspiration. Soyez sûr de pull solution saline dans l&#39;électrode d&#39;aspiration pour couvrir le fil d&#39;argent à l&#39;intérieur avant de sucer dans le nerf. </li><li> Avec une pipette coup d&#39;air sec sur les poils situés sur chaque Cercus. Voir si la stimulation des poils sur le ipsilatéral Cercus au conjonctif enregistrée donne une réponse différente de celle controlatéral. Prendre acte de l&#39;amplitude des réponses reçues et du nombre de pics dans un intervalle de temps donné au cours de la stimulation. </li><li> Déplacer l&#39;électrode d&#39;aspiration pour un nerf cercal pour l&#39;enregistrement. Pour obtenir un meilleur ajustement, passer à une pointe d&#39;électrode avec une ouverture plus petite si nécessaire. </li><li> Couper le nerf cercal proche A6, puis aspirer le nerf menant à la Cercus. Il devrait y avoir la décharge spontanée des potentiels d&#39;action. Maintenant, souffler de l&#39;air sur la Cercus et noter les réponses. </li></ol> 3. Stimuler électriquement les nerfs sensoriels pour déterminer Recrutement <ol><li> Changer le logiciel d&#39;enregistrement en mode balayage de sorte qu&#39;il enregistre des traces (100-500 msec.) chaque fois qu&#39;un stimulus est déclenchée. </li><li> Relier l&#39;électrode de stimulation à la sortie du stimulateur. </li><li> Branchez le câble de stimulation avec les deux pistes ou des clips mini-crochet. </li><li> Connecter la sortie de déclenchement BNC à partir du stimulateur à l&#39;entrée de déclenchement de l&#39;appareil d&#39;enregistrement. </li><li> Les paramètres de stimulation suivants devraient susciter une réponse: Durée: 0,3 s; Delay: 10 ms; Fréquence: 1 Hz; Tension: ajuster au besoin pour obtenir un signal dans les enregistrements (un peu plus de seuil et d&#39;être en mesure d&#39;obtenir une réponse maximale). Il n&#39;y a aucune raison d&#39;aller à des tensions beaucoup plus élevés que le seuil maximal pour le recrutement comme une tension élevée peut être dommageable pour le nerf. </li><li> Couper le nerf cercal comme distale que possible afin que une longue racine nerveuse peut être tiré dans l&#39;électrode de succion stimulante (figure 7, tête de flèche). Le conjonctif entre A6 et A5 ou un autre segment plus antérieure peut être utilisé. </li><li> Réglez l&#39;électrode d&#39;enregistrement d&#39;aspiration afin que vous puissiez puaurez-vous un connecteur de coupe dans l&#39;électrode. Assurez-vous de tirer partie saline dans les électrodes d&#39;aspiration pour couvrir le fil d&#39;argent à l&#39;intérieur avant de sucer dans les nerfs. Assurez-vous que l&#39;électrode de stimulation est également fondé sur la saline de bain (dans l&#39;abdomen près de A3 est idéal). </li><li> Fournir une série de stimuli simples de tension croissante jusqu&#39;à un potentiel d&#39;action apparaît à l&#39;écran. Il faut procéder à un enregistrement de la tension de stimulation minimale et la durée de recruter une réponse. Augmenter l&#39;intensité jusqu&#39;à ce qu&#39;une réponse synaptique dans les connecteurs est observée. Le grand pic (des points d&#39;accès extracellulaires) des axones géants apparaît d&#39;abord, puis d&#39;autres plus petits AP de peut aussi être observée. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;il n&#39;y a pas de conflits d&#39;intérêts.

Une des raisons pour exposer les techniques de cette préparation classique est que le système de cerques a été et est un domaine de recherche actif dans le traitement des questions de développement des circuits neuronaux ainsi que des questions concernant la réparation et la régénération synaptique 26-31 encore. Soit la méthode d&#39;évoquer l&#39;activité dans le cafard chaîne nerveuse ventrale peut être utilisé pour examiner les effets des agents pharmacologiques ou des insecticides sur la fonction du système nerveux. Ces expériences sont effectuées par simple dissolution chimiques neuroactives dans une solution saline. Après un échange de cette solution avec le milieu de baignade normale, les changements dans l&#39;activité évoquée ou spontanée peuvent être observés lors de l&#39;enregistrement de connecteurs ou un nerf moteur pour donner une lecture cohérente de l&#39;effet de la substance sur la fonction du système nerveux central. Comme dans toutes les expériences neurophysiologiques un problème commun est le bruit électrique. Probablement le plus grand facteur de qualité de signal pour ces préparations is le joint d&#39;étanchéité de l&#39;électrode d&#39;aspiration sur le tissu nerveux. Un joint d&#39;étanchéité qui ne tire pas complètement dans le nerf cercal ou conjonctif est idéal. Les enregistrements peuvent aussi être effectuées avec des électrodes à double crochet placées sous la chaîne nerveuse et l&#39;isolation du VNC avec un mélange d&#39;huile minérale et de vaseline. Le mélange peut être chargé dans une seringue et expulsé autour de la chaîne nerveuse 32. Aussi une dissection minutieuse est aussi critique ici comme dans toute préparation CNS. Certains peuvent trouver plus facile d&#39;accéder à la CNS en disséquant la cuticule dorsale. Si cela réduit le risque d&#39;endommager le cordon nerveux ventral, il peut être plus difficile à enlever tous les viscères en utilisant cette approche. Il n&#39;est pas décrit ici mais cette préparation est prête à l&#39;enregistrement intracellulaire dans les interneurones géants 32,33. L&#39;ensemble du cordon nerveux peut également être retiré pour accueillir plusieurs électrodes d&#39;enregistrement et stimulantes simultanément. En fait l&#39;exploration du lobe antennaire, champignon body, et d&#39;autres structures antérieures du système nerveux central est toujours en cours 34-35. Alors que le cafard CNS continue à faire la lumière sur la recherche neurobiologique moderne cette préparation particulière est assez simple pour être utilisé dans les laboratoires universitaires de premier cycle.

Il existe plus de 4000 espèces de blattes, mais seulement environ 30 sont des parasites domestiques. Peut-être la plus reconnue est la blatte américaine Periplaneta americana mal nommée qui est originaire d&#39;Afrique, et on retrouve maintenant un peu partout sur ​​la planète. En plus de sa vitesse rapide de course 1 et le comportement d&#39;évitement, dans les régions tropicales P. americana est capable de voler 2,3. Les caractéristiques prédominantes du système nerveux central de cafard (CNS) sont sa nature segmentée et la décentralisation des processus de contrôle de 4,5. Le cerveau, thoracique et abdominale ganglions sont reliés par les connecteurs interganglionic appariés pour former la corde nerveuse ventrale (VNC). Les ganglions à chaque segment intègrent les centres. Elles sont composées d&#39;une région externe, corticale contenant des cellules responsables de la perméabilité hémato-encéphalique barrière juste sous eux, et le corps cellulaires des neurones originaires en ce que ganglion. Ces corps cellulaires peuvent appartenir à des interneurones, neurones modulateurs ou des neurones moteurs. Ils fournissent des axones qui restent dans le ganglion d&#39;origine (interneurones local), ou axones qui projettent entre les noyaux du système nerveux central (les interneurones interganglionic) ou qui se terminent sur les cellules musculaires périphérique (neurones moteurs). La plupart des corps cellulaires sont positionnés sur le ventre ou ventrolatéralement dans le cortex ganglionnaire 5. Les paires de connecteurs, interganglionic ne contiennent que des axones et aucun corps cellulaires neuronaux. Le neuropil d&#39;un ganglion contient des cellules gliales (névroglie), les secteurs de l&#39;axone, faisceaux d&#39;axones et des dendrites, (neurites de neurones). Le neuropile est dépourvue de corps cellulaires neuronaux. C&#39;est la région dans le ganglion où la communication synaptique directe entre les cellules et l&#39;intégration des entrées nerveuses se produit. La capacité de la blatte américaine P. americana pour détecter et tout à coup face à un prédateur approche (pied, hand, etc.) a été attribué à un circuit réflexe qui consiste à cerques et le géant de 6,7 système de fibres. Le cerques sont une paire de cornes comme des structures de vent sensible situés à l&#39;extrémité de l&#39;abdomen (figure 1). Dans P. americana la surface ventrale de chaque Cercus contient environ 200 filiforme (fil) les poils qui sont organisés en 14 colonnes. Neuf de ces colonnes peut être systématiquement identifiées dans les différents animaux selon les propriétés de la cellule associée au récepteur et axone réponse. Chaque poil se trouve dans une douille qui lui permet de fléchir plus aisément dans un plan qui est spécifique colonne. Le mouvement de la chevelure dans une direction le long de son plan entraîne une dépolarisation de la cellule réceptrice et une salve des potentiels d&#39;action (PA) dans le neurone sensoriel. Mouvement dans la direction opposée inhibe toute PA spontanées en cours 8. Le plan préféré de flexion et la directionnalité de la réponse est différente dans chaque colonne. Ainsi, la filiforcomplexes m cheveux récepteurs sont responsables non seulement pour détecter le mouvement de l&#39;air, mais aussi pour «codage», sous la forme de points d&#39;accès, la direction à partir de laquelle le courant d&#39;air est originaire. Traitement de cette information par le système nerveux central se traduit par une réaction de fuite «approprié» 6,7. Cette spécificité fonctionnelle en forme de colonne des poils sensoriels est préservée d&#39;un animal à. La cellule réceptrice de chaque poil filiforme est responsable de la transduction de la déflexion mécanique des cheveux en un événement de neurones (donnant lieu à une explosion ou à l&#39;inhibition de PA dans l&#39;axone de la cellule du récepteur 9. Les PA se déplacent vers le ganglion abdominal terminal (A6) par l&#39;intermédiaire cercal nerf XI, où ils font synapse avec les axones géants de la corde nerveuse ventrale (VNC). Les axones géants sont soupçonnés d&#39;être responsables de la transmission et de l&#39;excitation ultérieure des neurones moteurs qui se traduit par un comportement de fuite 6,10,11. Le temps de latence du comportement of la réaction de fuite de P. americana est un des plus courts de tous les animaux 7. Latence de comportement est le temps entre l&#39;arrivée d&#39;un stimulus à un mécanorécepteurs et l&#39;ouverture d&#39;une réaction de fuite. Dans des expériences à l&#39;aide de la cinématographie à grande vitesse pour enregistrer la tentative d&#39;évasion d&#39;un crapaud attaque, le cafard a été observée pour commencer son tour à partir du crapaud dans environ 40 ms (temps de début de l&#39;extension de la langue à la blatte mouvement 7,12. Utilisation vent bouffées contrôlées , le temps de latence de comportement pourrait être réduit à 11 ms. D&#39;autres expériences ont montré qu&#39;une vitesse de bouffée de vent minimum de 12 mm / ms (avec une accélération de 600 mm / ms 2) peut évoquer une réaction de fuite, tandis que des vitesses encore plus faibles (3 mm / sec) causé cafards pour arrêter mobile 12 en marchant lentement. La forte corrélation qui existe généralement entre les systèmes de fibres géantes et comportement de fuite a été bien documenté 13,14. Dans instances où une cellule particulière est nécessaire et suffisante pour évoquer un comportement particulier de la cellule est appelée une commande neurone 15,16. Interneurones géants (IG) dans le circuit d&#39;échappement vent de P. americana ne sont pas nécessaires pour le réflexe. Les animaux qui ont subi une ablation IG expérimentalement présentent encore le comportement de fuite donc ces indications géographiques ne sont pas considérés comme des neurones de commande 17,18. Découpage des connecteurs col de l&#39;utérus qui sont rostrale au circuit sensori-moteur influe également sur ​​le comportement, indiquant que descendant entrée du cerveau a un effet sur ​​le sens de la fuite 19. Ces aspects de la lutte amende et la redondance sont primordiaux pour la survie de l&#39;organisme et sont complétées par modulation neurochimique par les amines biogènes 20. Le P. americana nerf préparation de cordon a été un système de modèle élégant pour neuroethologists au cours des dernières décennies de nombreux commençant par le travail de pionnier de Roeder &lt;sup&gt; 21. Il permet aux étudiants d&#39;enregistrer, d&#39;afficher et d&#39;analyser l&#39;activité sensorielle primaire et les réponses qui en résultent par interneurones géants à leur 22,23,24 d&#39;entrée. En plus de transmettre l&#39;idée que les circuits neuronaux identifiables sous-tendent les réponses comportementales à l&#39;environnement, ces exercices doivent inculquer une appréciation pour les contributions biologiques effectués par ce ravageur ménage commun.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Réactif&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td>Kit d'élastomère de silicone 182</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;S7653&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Pour ajuster le pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Pour ajuster le pH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Nom du matériel&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Outils de dissection</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortment</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes en verre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Boîte de 200, électrodes à succion</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>Peut être fixé sur une base ou sur une tige métallique</td></tr><tr><td>Fil d'argent (10/1 000 po)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>quelconque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur différentiel CA/CC</td><td>A-M Systems</td><td>Modèle 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Étage de tête</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Fourni avec l'amplificateur CA/CC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fils électriques</td><td>quelconque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outils en verre</td><td>à fabriquer soi-même</td><td></td><td>Pour manipuler les nerfs</td></tr><tr><td>Câbles et connecteurs</td><td>quelconque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes avec poire</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Boîte de 500</td></tr><tr><td>Béchers</td><td>quelconque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cire ou pâte à modeler</td><td>quelconque ou magasins locaux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 ou S88</td><td></td></tr><tr><td>Embouts en plastique pour électrode à succion</td><td>magasin de bricolage local (marque Watt's)</td><td>&amp;frac14; po de diamètre extérieur × 0,170 po de diamètre intérieur</td><td>Couper en petits morceaux. Tirer sur un flamme et recouper l'extrémité à la bonne taille.</td></tr></tbody></table>

des circuits neuronaux enregistrement à partir d&#39;un cancrelat système nerveux intact

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Le ventrale préparation nerf de la moelle de cafard est un système souple pour les expériences de neuroéthologie, la modélisation des réseaux de neurones, et en testant les effets physiologiques d&#39;insecticides. Cet article décrit le champ d&#39;application de modalités sensorielles de blattes qui peuvent être utilisés pour analyser la façon dont un système nerveux des insectes répond aux perturbations de l&#39;environnement. L&#39;accent est mis ici sur le comportement de fuite médiée par cerques de transmission à fibre géant dans Periplaneta americana. Cette préparation in situ nécessite seulement des compétences de dissection modérée et l&#39;expertise pour produire des enregistrements électrophysiologiques reproductibles de l&#39;activité neuronale. Des peptides ou d&#39;autres agents chimiques peuvent ensuite être appliqués directement sur le système nerveux en solution avec la solution saline physiologique. Insecticides peuvent aussi être administrés avant la dissection et le circuit d&#39;échappement peuvent servir d&#39;indicateur de l&#39;état excité du système nerveux central. Dans ce contexte, les essais décrits ici peuvent aussi être utiles pour res chercheurs intéressés à la régénération des membres et l&#39;évolution du développement du système nerveux pour laquelle P. americana est un organisme modèle établi.

Stimulation de poils sur le cerci par une bouffée d&#39;air provoque des décharges des neurones sensoriels primaires qui peuvent être enregistrées en utilisant des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration fixés, soit de connecteurs entre ganglions abdominaux ou le nerf cercal lui-même (figure 8). amplitudes Spike enregistrées dans les deux régions sont de l&#39;ordre de plusieurs micro-volts à millivolts. En raison de l&#39;intégration sensorielle dans le ganglion le nombre de pics observés dans le potentiel d&#39;action composite ou sous forme de pointes individuels enregistrés du nerf cercal est remarquablement plus grande que celle observée dans les enregistrements des connecteurs. Il faut toutefois noter également qu&#39;il n&#39;y a sensiblement moins de bruit dans l&#39;enregistrement à l&#39;conjonctif dû à la meilleure étanchéité entre l&#39;électrode et le tissu nerveux. En soufflant l&#39;air dans les grandes pointes cerques peut être observé dans les connecteurs (figure 8A). En utilisant cette méthode de stimulation, les enregistrements entre A3 et A4 typique<html> ment montrer une grande caractéristique de pic de la interneurones (s) géant. Enregistrement à partir d&#39;un nerf cercal tout en frottant physiquement le cerci avec une pince a produit une forte buste d&#39;activité (figure 8B 1). Dans un autre enregistrement, 2 bouffées d&#39;air produites chaque une réponse rapide busting dans le nerf cercal (figure 8B 2). Lorsque la stimulation électrique du nerf cercal avec une électrode d&#39;aspiration et l&#39;enregistrement dans la conjonctif entre A3 et A4, on peut observer un certain seuil dans la stimulation de réponses évoquées (Figure 8C 1). La stimulation électrique du nerf cercal suscite manifestement une réponse dans les connecteurs qui peut être quantifiée pour les études de manipulation avec des agents pharmacologiques ou entoure la locale de l&#39;environnement, tels que la température (figure 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Periplaneta americana avec cerci intact. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Figure 2. Vue ventrale de cafard corde nerveuse comme on le voit avec la cuticule ventrale retiré (A). Une vue agrandie du segment indiqué par les flèches est vu dans (B). En (C), les connecteurs ont été déversés entre les formats A4 et A3 avec une sonde de verre. Le 6ème ganglion abdominal est représenté en (D) avec les deux nerfs Cercal laissant à l&#39;extrémité caudale. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Figure 3. Vue ventrale Schéma de cafard corde nerveuse. ys &quot;&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;cerques sont positionnés vers le haut hors du bain de solution saline. L&#39;abdomen ouvert peuvent être inondées avec une solution saline (A) avec l&#39;extrémité caudale du gardon être élevé avec une petite coincée pièce en forme d&#39;élastomère de silicone afin de garder la cerci sur du bain (B). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Figure 5. Le 6 ème de ganglion abdominal avec le nerf cercal (indiqué par des flèches). <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Figure 6. L&#39;équipement mis en place. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir lar</a>ger figure. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Figure 7. Stimulant et l&#39;électrode d&#39;enregistrement mis en place. <img alt="Figure 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Figure 8. Des enregistrements de neurones des connecteurs et le nerf cercal avec diverses procédures de stimulation. Enregistrement avec une électrode d&#39;aspiration des connecteurs entre A3 et A4 en fumant à l&#39;air cerques (A). Enregistrement des neurones Cercal primaires avec une électrode d&#39;aspiration tout en frottant soit physiquement (B 1) ou de fournir des bouffées d&#39;air (B 2) Résultats en rafales rapides de l&#39;activité dans le nerf cercal. Stimulation électrique du nerf cercal produit des réponses dans les connecteurs ( <strong&gt; C 1). Noter l&#39;augmentation progressive de l&#39;intensité de stimulation (les flèches indiquent l&#39;amplitude de l&#39;artefact stimulante) et de l&#39;intensité des réponses évoquées ci-après. La stimulation électrique du nerf cercal fournit un moyen relativement plus contrôlées de stimuler le nerf cercal pour la cohérence de stimulation pour quantifier les réponses (C 2).

Cet article décrit le cafard ventrale dissection du nerf de la moelle et des enregistrements extracellulaires du nerf et connecteurs cercal. Réponses évoquées sont générés par la stimulation électrique du nerf cercal ou stimulation mécanique directe de la cerques.

Des circuits neuronaux enregistrement à partir d&#39;un cancrelat système nerveux Intact

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Cette technique démontre comment un organisme détecte son environnement à travers des stimuli mécano-sensoriels et comment l’information est intégrée et transformée dans les centres supérieurs du SNC en exposant le cordon nerveux ventral et les nerfs circulaires. Tout d’abord, il enregistre à partir des conjonctifs du cordon nerveux ventral, ce qui démontre le type de signaux que le SNC transmet. Ensuite, on enregistre à partir des neurones sensoriels primaires pour comparer l’activité des neurones primaires avec l’activité des connectifs.Les résultats montrent comment le mouvement des poils fins par les vibrations de l’air relie les signaux électriques au SNC et comment ces signaux sont traités. Cette méthode peut donner un aperçu de l’intégration de l’activité des neurones sensoriels et des cafards, ou elle peut être appliquée à d’autres circuits moteurs ou à d’autres organismes modèles. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la dissection peut être un peu difficile pour disséquer l’animal juste comme il faut pour garder les poils sensoriels secs tout en enregistrant à partir du nerf sensoriel primaire.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car elle est difficile à apprendre car elle est facile d’endommager le faisceau nerveux. Sélectionnez un cafard mâle dans le réservoir de rétention qui a robuste environ les derniers segments du mâle sont étroits et n’ont pas d’ovaires ni de masse d’œufs, contrairement à la femelle. Les mâles de P Americana ont également une paire d’yeux courts entre les ailes, les pattes et la tête coupés, non observés chez les femelles.Épinglez ensuite le corps côté ventral vers le haut dans un plat tapissé d’élastomère de silicone avec une pince. Prenez les plaques ventrales et coupez-les avec des ciseaux fins en commençant par l’extrémité postérieure et en travaillant vers l’avant Gardez toujours les organes internes humides avec des essoreuses tout en essayant de garder le circa sec. Cela se fait en utilisant de la cire ou du caoutchouc pour soulever l’abdomen.Si le Cirque est mouillé, séchez-le avec un morceau de papier de soie. Ensuite, écartez les organes internes et la substance blanche. Le VNC devrait maintenant être visible entre la trache brillante E.It s’étend sur toute la longueur de l’abdomen.Il peut être nécessaire d’ajuster l’éclairage pour voir le VNC. Ne manipulez pas le VNC avec des pinces ou des épingles à insectes. Au lieu de cela, manipulez-le à l’aide de sondes en verre.Dégagez le système traché E de l’animal du cordon nerveux du mieux possible avec des pinces avec une paire d’aiguilles en verre fines. Séparez très soigneusement les conjonctifs VNC longitudinalement entre le A six et un cinq ou le A cinq et un berceau à quatre ganglions. Le Siri et l’abdomen vers le haut hors du bain salin.Utilisez des épingles à insectes raccourcies et de la cire ou un coin d’élastomère de silicone. Soyez très prudent dans le dernier segment abdominal pour éviter d’endommager les nerfs circulaires, qui se projettent dans le ganglion. Le microscope de préparation disséquée et l’appareil d’enregistrement doivent être installés à l’intérieur d’une cage de Faraday pour bloquer les champs électriques externes qui pourraient outrepasser les signaux des neurones.Positionnez le microscope de manière à ce qu’il surplombe la platine. Ajustez ensuite la position du faisceau de l’illuminateur de haute intensité. Pour mieux visualiser la préparation, connectez l’amplificateur différentiel AC CDC à l’unité d’enregistrement de données intégrée.L’étage supérieur contenant une micro-électrode doit être connecté à l’amplificateur. Pour stabiliser les enregistrements. Broyez l’abdomen avec le fil d’argent enduit de chlorure.La raison du fil de terre en argent est que la solution à l’intérieur de la cavité corporelle perd le contact avec le liquide de bain dans la parabole. Ensuite, la solution associée à l’électrode d’enregistrement reste mise à la terre. Ensuite, réglez la fréquence d’enregistrement sur quatre kilohertz.Démarrez ensuite l’échelle de tension sur la piste à 500 millivolts. Ajustez-le si nécessaire et réglez le logiciel pour qu’il s’exécute en mode continu ou oscilloscope en fonction de la préparation. Coupez l’un des connecteurs VNC près d’un cinq.Placez ensuite l’extrémité coupée attachée à un six dans une électrode d’aspiration pré-remplie de solution de sonnerie. À l’aide d’une pipette sèche, soufflez de l’air sur les poils situés sur chaque cirque. Vérifiez si la stimulation des poils sur le cirque ipsilatéral au conjonctif enregistré donne une réponse différente de celle du controlatéral.Prenez note de l’amplitude de la réponse et de la fréquence des pics. Déplacez ensuite l’électrode d’aspiration sur un nerf circulaire pour l’enregistrement. Si l’ajustement n’est pas bon, passez à un embout d’électrode avec une ouverture plus petite.Ensuite, coupez le nerf circulaire près d’un six et aspirez le nerf menant au cirque. Cela devrait se traduire par des potentiels d’action spontanés. Maintenant, soufflez de l’air sur le cirque et notez les réponses.Basculez le logiciel d’enregistrement en mode balayage afin qu’il enregistre les traces chaque fois qu’un stimulus est déclenché. Ces traces doivent être comprises entre une et 500 millisecondes. Connectez l’électrode de stimulation à la sortie du stimulateur et connectez la sortie de déclenchement BNC du stimulateur à l’entrée de déclenchement de l’unité d’enregistrement.Maintenant, certains paramètres de stimulation doivent susciter une réponse, ajuster la tension de stimulation pour obtenir un signal juste au-dessus du seuil et capable d’obtenir une réponse maximale. Il n’y a aucune raison d’aller à des tensions beaucoup plus élevées que le seuil maximal de recrutement. Comme une tension élevée peut endommager le nerf, coupez le nerf circulaire aussi distal que possible afin qu’une longue racine nerveuse puisse être tirée dans la route de l’électrode d’aspiration stimulante.Maintenant, le connectif entre les ganglions A six et cinq ou dans un segment plus antérieur peut être utilisé. Aspirez une solution saline dans l’électrode d’aspiration, puis tirez un connecteur coupé dans l’électrode. Assurez-vous que l’électrode de stimulation est mise à la terre dans la solution saline du bain.Idéalement, l’électrode d’enregistrement devrait être dans l’abdomen près d’un trois. Exécutez maintenant une série de stimuli uniques de tension croissante jusqu’à ce qu’un potentiel d’action composé apparaisse à l’écran. Notez la tension et la durée minimales de stimulation pour recruter une réponse.Commencez doucement et augmentez l’intensité jusqu’à ce qu’une réponse synaptique dans les conjonctifs soit observée. Le grand pic et le potentiel d’action extracellulaire des axones géants apparaîtront en premier, puis d’autres potentiels d’action plus petits peuvent également être observés en soufflant de l’air au niveau du cci. De grands pics ont été observés dans les conjonctifs en utilisant ce paradigme stimulant.Les enregistrements des connectifs entre un trois et un quatre ont généralement montré un grand pic caractéristique des interneurones géants enregistrant à partir d’un nerf circulaire tandis que frotter physiquement le Siri avec une pince à épiler produisait une forte explosion d’activité dans un autre enregistrant deux bouffées d’air, chacune produisant une réponse d’éclatement rapide dans le nerf circulaire lors de la stimulation électrique du nerf circulaire avec une électrode d’aspiration et de l’enregistrement dans le conjonctif entre un trois et Un quatre, un seuil dans la stimulation des réponses évoquées a été enregistré. La stimulation électrique du nerf circulaire suscite clairement une réponse chez les conjonctifs qui peut être quantifiée pour des études manipulatrices avec des agents pharmacologiques ou avec des paramètres environnementaux locaux Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas pincer les nerfs avec la pince à épiler ou de ne pas tirer trop fort sur le nerf avec l’électrode d’aspiration.Après avoir regardé cette vidéo, j’espère que vous avez une bonne compréhension de la façon de disséquer le système nerveux des cafards et de collecter des enregistrements extracellulaires sensoriels évoqués.

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Nous démontrons variations de la technique d'enregistrement multi-unité extracellulaire de caractériser les odeurs réponses évoquées dans les trois premières étapes de la voie olfactive invertébrés. Ces techniques peuvent être facilement adaptés pour examiner l'activité d'ensemble dans d'autres systèmes neuronaux ainsi.

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Nous avons déjà développé une technique d'implantation fils tétrode dans le complexe central de cerveau de cafards qui nous permet de surveiller l'activité en unités individuelles de cafards captifs. Nous présentons ici une version modifiée de cette technique qui nous permet d'enregistrer également l'activité du cerveau en se déplaçant librement insectes.

Extracellulaire fil Tetrode enregistrement dans le cerveau des insectes Marcher librement

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Les enregistrements simultanés à long terme à deux étapes de traitement neuronal à se conduire abeilles

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

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Ce protocole présente une méthode d’imagerie de l’activité de la population neuronale avec une résolution unicellulaire chez des espèces d’invertébrés non transgéniques à l’aide de colorants sensibles à la tension d’absorbance et d’un réseau de photodiodes. Cette approche permet un flux de travail rapide, dans lequel l’imagerie et l’analyse peuvent être poursuivies au cours d’une seule journée.

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Découvrez l'enregistrement extracellulaire des signaux sensoriels dans le système nerveux intact du cancrelat. Cette méthode d'électrophysiologie permet d'étudier l'intégration des informations mécanosensorielles dans le SNC.

Des circuits neuronaux enregistrement à partir d'un cancrelat système nerveux Intact

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