Name: Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Découvrez une méthode robuste de FISH 3D ADN utilisant des sondes directement marquées pour analyser l'architecture nucléaire et l'organisation spatiale des loci génomiques dans des cellules uniques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par le BBSRC et le Wellcome Trust. Nous tenons à remercier Simon Walker à l&#39;aide de l&#39;imagerie et Felix Krueger de l&#39;aide à l&#39;analyse bioinformatique.

1. Générer des sondes d&#39;ADN marquées directement par Nick Translation Note: les sondes directement marquées fabriqués à partir de BAC (100-250 kb) produisent constamment des signaux lumineux. Si les sondes plus petites sont nécessaires, utiliser fosmides (40-50 kb) ou même des plasmides contenant 5-10 inserts ko. Identifier BAC ou clones fosmide correspondant à des gènes spécifiques à l&#39;aide Ensemble ou navigateurs de génome UCSC. Préparer l&#39;ADN BAC haute qualité par précipitation répétée ou utiliser des kits disponibles dans le commerce. Le moins que l&#39;établissement est contaminé par l&#39;ADN génomique bactérienne, moins la sonde est nécessaire par diapositive. Effectuer l&#39;étiquetage en deux étapes: traduction nick introduction aminoallyl-dUTP et le couplage chimique d&#39;un colorant amine-réactif. 1.1. Nick Translation Lors de la traduction nick, DNase I est utilisé pour créer un seul brin pauses. ADN polymérase I s&#39;allonge &#39;extrémités de ces «pseudos» le 3, en remplacement de nucléotides existants par de nouveaux, t<html> présente «traduire» le nick et offrant ainsi la possibilité d&#39;intégrer nucléotides marqués. Aminoallyl-dUTP est choisi en raison de l&#39;incorporation efficace de l&#39;ADN polymérase I et son potentiel de couplage chimique tard aux colorants réactifs avec les amines ou les haptènes. Il est essentiel de trouver le juste équilibre entre DNase I entaille et l&#39;ADN polymérase de traduction I; trop DNase I se traduira par digestion de l&#39;ADN excessive donnant un faible rendement et tailles de fragments courts, trop peu ne sera pas produire suffisamment de pseudos pour la polymérase pour initier la traduction, donnant grande taille de fragment et une mauvaise incorporation de aminoallyl-dUTP. Le protocole suivant fonctionne bien, mais il peut être nécessaire de titrer la DNAse I à partir de différents lots ou par plusieurs fabricants. <ol><li> Mettre en place l&#39;étiquetage réaction sur glace et incuber pendant 2 heures à 16 ° C. Cela devrait produire de l&#39;ADN translation de coupure 0,5-1 mg et peut être intensifié. Diluer DNase I 1:30 tampon DNase I (soit 0,3 U / pl). </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Composant </td><td> Concentration de stock </td><td> Volume ou quantité </td></tr><tr><td> ADN BAC </td><td></td><td> 5-10 mg </td></tr><tr><td> Tampon NTB </td><td> 10x </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 0,1 M </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> 10x </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0,5 mM </td><td> 6 pi </td></tr><tr><td> ADN polymérase I </td><td> 10 U / pl </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 10 U / pl </td><td> 1 pl (d&#39;une dilution 1:30) </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td></td><td> à 50 pi </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Exécuter 1 pi sur un gel à 2% d&#39;agarose pour vérifier la taille des fragments marqués. Pendant que vous courez le gel, garder la réaction sur la glace. Succès nick translatisur se traduira par un frottis avec la majeure partie des fragments de fonctionnement entre 150 pb et 700 pb avec quelques gros fragments à ~ 1 kb (étape cruciale: voir résultats représentatifs). Si nécessaire, ajouter un autre 1 pi d&#39;une fraîche 01:30 DNase I dilution et incuber à 16 ° C pendant 15-30 min. Le temps d&#39;incubation varie en fonction de la quantité et de la qualité de l&#39;ADN BAC. </li><li> Inactiver la DNase I par chauffage à 75 ° C pendant 10 min. </li><li> ADN modifié par une amine Clean-up utilisant un kit de purification PCR. Eluer dans 100 pi H 2 O. </li><li> Ethanol ADN précipité par addition de 10 pl NaOAc 3 M (pH 5,2) et 275 pi d&#39;éthanol. Laisser à -20 ° C pendant au moins 1 heure ou jusqu&#39;au lendemain. Faites tourner à vitesse maximale pendant 30 min à 4 ° C. Lavez culot avec 500 ul d&#39;éthanol à 70% et laisser sécher. Cette étape supprime amines traces qui vont interférer avec la réaction de marquage. Remettre le culot dans 6 pi H 2 O par 1x réaction initiale. </li><li> Utilisation 1 pi à déterminer la concentration de l&#39;ADN modifié par une aminepar spectroscopie UV micro-volume. </li></ol> 1.2. Le couplage du colorant fluorescent Marquage fluorescent de la sonde est obtenue par couplage chimique du colorant. Alexa Fluor colorants succinimidyl ester réagissent avec les amines de l&#39;ADN modifié amino-allyldUTP pour former une liaison covalente, en produisant ainsi des sondes marquées directement. Alexa Fluor 488, 555, 647 et colorants ont été couronnés de succès pour ce processus. <ol><li> Ajustez 4 pg d&#39;ADN modifié amino-allyle à un volume de 5 pi, la chaleur à 95 ° C pendant 5 min, enclenchez refroidir sur glace et ajouter 3 ul de 0,2 M NaHCO3. </li><li> Dissoudre une aliquote de colorant réactif amine dans 2 ul de DMSO anhydre à température ambiante. Ajouter 8 ADN modifié ul avec NaHCO 3, vortex, impulsion de spin et incuber à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 1 heure. </li></ol> Remarque: Les colorants réactifs amine peuvent être utilisées pour marquer plus d&#39;une sonde sur la base du schéma suivant. Depuis oeul 10-20 ng de sonde est utilisée pour l&#39;étiquetage des diapositives, 1 ug donne assez de sonde pour 50-100 diapositives. Il est également possible de stocker l&#39;ADN modifié par une amine pour les réactions futures en matière d&#39;étiquetage à -20 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> quantité d&#39;ADN </td><td> le volume de l&#39;ADN </td><td> 0,2 M NaHCO3 </td><td> Volume de colorant </td><td> Totale </td><td> Assez pour </td></tr><tr><td> 4 x 1 pg </td><td> 1,25 pi de chacun </td><td> 0,75 pi de chacun </td><td> 0,5 pi de chacun </td><td> 2,5 pi (1/4) </td><td> 50-100 diapositives chacun </td></tr><tr><td> 3 x 1,35 ug </td><td> 1,67 pi de chacun </td><td> 1 pl chaque </td><td> 0,67 pi de chacun </td><td> 3,34 pl (1/3) </td><td> 65-130 glisser chaque </td></tr><tr><td> 2 x 2 ug </td><td> 2,5 pi chaque </td><td> 1,5 pi de chacun </td><td> 1 pl chaque </td><td> 5 pi (1/2) </td><td> 100-200glisse chaque </td></tr><tr><td> 1 x 4 pg </td><td> 5 pl </td><td> 3 pi </td><td> 2 pl </td><td> 10 pi (complet) </td><td> 200-400 diapositives </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Ajouter 90 ul H 2 O et sonde marquée purifier l&#39;aide d&#39;un kit de purification PCR. Eluer dans 100 pi 10 mMTris-Cl (pH 8,5). </li><li> Déterminer la concentration de la sonde et l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage par spectroscopie à spectre complet microvolume (voir Figure 2) en utilisant les équations de Beer-Lambert (Les instructions sont données dans la fiche technique accompagnant les Fluor colorants réactifs Alexa ou peut être trouvé en ligne). Sondes contenant des colorants 3-6 par 100 pb fonctionnent bien. Sondes à des degrés moindres de incorporation peuvent donner des signaux de poissons faibles. Vous pouvez également exécuter 5 pi sur un gel d&#39;agarose à 2% sans tache d&#39;ADN et vérifier l&#39;incorporation du colorant fluorescent à l&#39;aide d&#39;un phosphoimager. Diffusez-tacher le gel avec du bromure d&#39;éthidium ou alternatives de coloration de l&#39;ADN et comparer ADN marqué à l&#39;ADN total. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. FISH d&#39;ADN Par l&#39;intermédiaire des étapes suivantes, les cellules d&#39;intérêt sont fixés à des lames et perméabilisées. L&#39;ADN cellulaire et les sondes directement marquées sont ensuite dénaturés ensemble sur une plaque chauffante et hybrides pendant la nuit dans une chambre humidifiée étanche à la lumière. 2.1. Jour 1 <ol><li> Sonde Précipitations Note: les sondes de précipiter à un certain moment durant le jour 1. Cela peut confortablement être effectuées en parallèle au traitement des cellules et ne pas avoir à faire au début de la journée. <ol><li> Mélanger 10-20 ng de la sonde directement étiqueté, 6 pi 0 C t-1 DNA (6 mg), 1 pl ADN simple brin à partir de testicules de saumon (9,7 ug) et ajuster le volume à 100 pi avec de l&#39;eau. </li><li> Ajouter 10 ul NaOAc 3 M et 275 ul EtOH, et mélanger au vortex. Précipiter pendant au moins 1 heure à -20 ° C. </li><li> Tournez à centrifuger à vitesse maximale pendant 30 min à 4 ° C. Lavez culot avec 70% EtOH et tourner à nouveau. Granulés secset remettre en suspension dans 5 pi formamide désionisée. Remettre en suspension pendant 30 min à 37 ° C tout en agitant à 1000 rpm abri de la lumière (lieu feuille sur le thermomixer). </li><li> Ajouter 5 ul de sulfate de dextran mélange et agiter pendant encore 10 min à 37 ° C à nouveau abri de la lumière. Introduire à la pipette de haut en bas, juste avant le pipetage sur lamelle. Note: Pour la peinture des chromosomes combiné avec des sondes BAC, entiers sondes de peinture chromosomiques qui sont fournis dans le prêt-à-utiliser mélange d&#39;hybridation sont une option pratique. Remettre en suspension précipitée BAC sonde (avec C 0 t1 ADN et l&#39;ADN simple brin à partir de testicules de saumon) dans 10 ul mélange de peinture chromosomique par aspiration et refoulement. Incuber à 37 ° C tout en agitant à 300-500 rpm pendant 10 min. Utilisez 10 pl du chromosome peinture / BAC sonde mélange par spot. </li></ol></li><li> Fixation des cellules aux diapositives Note: Les cellules propension à adhérer aux diapositives varie considérablement selon le type de cellule. Pour chaque type de cellule, déterminer l&#39;optimale du temps et de la densité des cellules de décantation de façon empirique. Pour obtenir des résultats cohérents, les cellules doivent être en suspension cellulaire unique. Pour plus de convivialité cercle de la zone des cellules sera repéré sur avec un stylo hydrophobe, bien que pour les cellules remises en suspension dans PBS ce n&#39;est pas strictement nécessaire. Une barrière hydrophobe empêche la suspension de la diffusion sur la diapositive, conserve jusqu&#39;à trois échantillons par lame bien séparées et permet l&#39;utilisation de très petits volumes de solution d&#39;anticorps en immuno-FISH. En outre, la zone spotting peut être réduit au minimum si le nombre de cellules est faible. </li><li> cellules de foie foetal de souris <ol><li> Recueillir chaque foie fœtal de souris E13.5 dans environ 1,5 ml de PBS et remettre en suspension par pipetage de haut en bas. Tournez à centrifuger à 3000 rpm pendant 2 min. Répétez les lave trois fois. Lors des dernières lavage, cellules souches à travers un tamis de 70. Reprendre les cellules d&#39;un foie dans 160 pi de PBS et utiliser 50 μ par spot. Laisser les cellules sédimenter pendant 2 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Mouse cellules ES 1. Cellules ES de souris ne collent pas facilement à la diapositive. Dans une diapositive, encerclez le domaine des cellules sera repéré sur avec un stylo hydrophobe. Préparer une suspension de cellules par 20,000-50,000 80-100 ul dans un milieu de culture normale, pipette en cercle et laisser attacher pendant environ 3 heures dans un incubateur humidifié. Remarque: Alternativement, les cellules ES peuvent être cultivées sur des lames, mais constituera alors colonies qui pourraient entraver imagerie automatisée. </li><li> Les cellules fixes 1. Certaines expériences nécessitent l&#39;utilisation de cellules fixes qui ne s&#39;attachent pas à des diapositives par eux-mêmes. Filature douce à 300 rpm pendant 3 minutes en utilisant un cytocentrifugeuse préserve la structure tridimensionnelle des cellules et assure que les cellules ne tombent pas. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Type de cellule </td><td> Suspension en </td><td> Temps de stabilisation </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> Sourisfoie fœtal </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Sur le banc </td></tr><tr><td> Souris ES </td><td> DMEM avec des suppléments </td><td> 4 heures </td><td> 37 ° C en incubateur humidifié </td></tr><tr><td> lymphocytes de souris </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Sur le banc </td></tr><tr><td> Souris P20 cellules germinales </td><td> Correction en solution </td><td> Cytospin </td><td> Sur le banc </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Pour fixer les cellules, doucement submerger diaporamas dans 4% PFA (ATTENTION: effectuer dans la hotte) pendant 10 min. Fixer les cellules avec la lame à plat dans un tiroir pour une meilleure rétention des cellules (par exemple 50 ml 4% PFA dans le couvercle d&#39;une boîte de pointe). Remarque: Cette étape ne s&#39;applique pas aux cellules fixées avant la fixation des lames. </li></ol> Pour toutes les étapes ultérieures, utiliser 50 ml ou 100 ml jarres de Coplin. Prenez soin de ne pas égratigner les cellules lorsque vous déplacez des diapositives entre pots. <ol start="4"><li> Étancher dans 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Perméabiliser cellules dans 0,1% saponin/0.1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver deux fois dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Incuber pendant au moins 20 min dans 20% de glycérol / PBS à température ambiante. Remarque: À ce stade, les lames peuvent être stockées dans 50% de glycérol / PBS à -20 ° C pendant au moins plusieurs semaines. Il a été observé que le stockage d&#39;au moins une journée en résulte une augmentation de la puissance du signal 9. Recalibrer la température ambiante de 20% de glycérol / PBS avant de procéder. Note: Ceci est un point commode de commencer la précipitation des sondes (voir 2.1.1). </li><li> 3x gel / dégel dans l&#39;azote liquide. Immerger une diapositive à la fois dans de l&#39;azote liquide à l&#39;aide d&#39;un petit vase de Dewar. Retirer au bout de quelques secondes et un claquement caractéristique, et placer sur une serviette en papier pour le dégivrage. Attendez que le glycérol congelés opaque à disparaître ensuite geler à nouveau. Diapositives jusqu&#39;à 15 peuvent être réalisées confortablement en rotation pendant trois cycles de gel / dégel. </li><li> WAsh deux fois dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Incuber dans HCl 0,1 M pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Perméabiliser à 0,5% saponin/0.5% X-100/PBS Triton pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver deux fois dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Amener à 50% formamide/2x SSC pendant au moins 10 min à température ambiante. </li><li> Sonde pipette sur une lamelle. Sortir les lames du pot et sécher tout excès de liquide autour de la place de la cellule (s) avec une serviette en papier. En séchant rapidement formamide, prenez soin de ne pas se dessécher cellules. Pour les diapositives avec deux ou trois points de la cellule, appliquez 10 pi de sonde par spot sur un 22 mm x 50 mm lamelle correspondant à repérer emplacement de la diapositive. Inversez lamelle sur la glissière sur place (s). Sceller avec du ciment de caoutchouc et Laisser sécher complètement. Protéger de la lumière à toutes les étapes ultérieures. </li><li> Chauffer les lames à 78 ° C pendant exactement 2 minutes sur une plaque chauffante (par exemple un bloc de chauffage inversé, étape cruciale: voir Discussion). Placez un couvercle (boîte en carton ou sim<html> ILAR) sur la plaque chauffante à l&#39;abri de la lumière pendant la dénaturation. </li><li> Incuber une nuit à 37 ° C dans une chambre humidifiée étanche à la lumière. Pour humidifier, placer des serviettes en papier dans une boîte étanche à la lumière et humidifier avec de l&#39;eau. </li></ol> 2.2 Jour 2 <ol><li> Préparer des jarres de Coplin avec des solutions à la bonne température pour les étapes de lavage ultérieures. Protéger les diapositives de la lumière autant que possible au cours de toutes les étapes ultérieures. Un café peut fait un bon couvercle étanche à la lumière pour les bocaux Coplin. </li><li> Décollez la colle de caoutchouc et le lieu diapositive dans 2x SSC jusqu&#39;à lamelles desserrer et glisser. </li><li> Laver à 50% formamide/2x SSC pendant 15 min à 45 ° C. Placer le couvercle sur bain-marie à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Laver à 0,2 x SSC pendant 15 min à 63 ° C. </li><li> Laver à 2x SSC pendant 5 min à 45 ° C. </li><li> Laver à 2x SSC pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Laver dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Colorer avec DAPI (5 ug / ml dans du SSC 2x) pendant 2 min dans un bac à coloration à température ambiante. </li></ol>contenu &quot;&gt; Note: solution DAPI peut être conservé à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 2 mois. <ol start="9"><li> Décolorer dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Pour monter la lamelle, pipette milieu de montage sur une lamelle. Utilisez 10 pi par endroit de la cellule, en utilisant 22 mm x 22 mm lamelles pour un seul endroit, et de 22 mm x 50 mm lamelles pendant deux à trois points. Séchez PBS autour de la place de la cellule, autant que possible, mais attention à ne pas assécher les cellules. Inversez lamelle sur la glissière, et sceller avec du vernis à ongles. </li></ol>

<ol><li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+transcription%3A+shaping+the+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li>
<li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+%283D-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li>
<li>Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22FISH%3A+A+Practical+Approach%22">FISH: A Practical Approach</a>. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).</li>
<li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983(2012).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).</li>
</ol>

La production de cet article a été partiellement financé par Carl Zeiss et METASYSTEMS.

FISH 3D DNA est devenu un outil largement reconnu pour analyser les arrangements spatiaux dans le noyau. Alors que le poisson fournit des résultats visuels et direct, comme avec toutes les techniques, il faut être conscient de ses limites. FISH d&#39;ADN est confronté au problème inhérent que les traitements relativement sévères sont nécessaires pour rendre la chromatine accessible pour les sondes FISH qui finalement perturbe nucléaire structure la chose qui doit être analysé. Plusieurs stratégies ont été poursuivis pour jongler avec l&#39;accessibilité et la préservation de la structure. Dans le protocole décrit ici, l&#39;ADN chromosomique est rendue accessible par gel-dégel perméabilisation des cellules et la dénaturation thermique avant l&#39;hybridation de la sonde. Solovei, et al., (2002) a analysé les changements structurels après un traitement similaire et a constaté que le déplacement moyen de domaines chromatine était de 300 nm, ce qui limite la résolution de l&#39;analyse structurelle à environ 1 Mb régions dans le génome 8. Si ce n&#39;est pas haute résolution, ilest une échelle raisonnable pour analyse de la situation nucléaire. Un examen plus pratique pour l&#39;analyse FISH est que l&#39;acquisition de l&#39;image et des mesures de distances nucléaires sont des processus chronophages qui limitent le nombre de germes qui peuvent être analysés. Afin d&#39;étudier les événements rares nous avons cherché à faire l&#39;imagerie automatisé à haut débit. Puis, avec des contrôles appropriés en place, en nombre suffisant peuvent être comparés pour permettre une analyse statistique robuste des relations spatiales. Nous analysons régulièrement 600 noyaux par point de données pour lequel nous déterminons les coordonnées 3D de tous les signaux de pêcher dans le volume nucléaire. Ces données nécessitent très peu d&#39;espace de stockage et permettent une analyse de distances inter-et intra-allélique, ou des positions radiales en tout point plus tard. En outre, le traitement automatisé peut être fait d&#39;une manière aveugle des chercheurs qui réduit considérablement la probabilité de préjugés inconscients. Pour permettre ce genre d&#39;analys haut débitest, notre objectif était d&#39;établir un moyen rapide et efficace d&#39;effectuer FISH d&#39;ADN. Nous avons trouvé le protocole décrit ici pour être extrêmement robuste, produisant régulièrement des signaux lumineux avec faible bruit de fond. Il a travaillé pour tous les types de cellules, nous avons essayé à condition que nous adaptons l&#39;étape de fixation des cellules sur la lame. En outre, à une exception près, tous les taux d&#39;alcoolémie, nous avons utilisé pourraient être transformés en des sondes vives. Nous avons également réussi à détecter un certain nombre de protéines nucléaires par coloration des anticorps après FISH d&#39;ADN. Alors que pour certaines protéines Cela fonctionne bien, nous recommandons comparaison avec immunofluorescence traditionnel (IF) pour assurer la cohérence du modèle de coloration des anticorps entre SI et de l&#39;ADN immuno FISH (cf. 11). En règle générale, nous avons constaté que des sondes marquées de différentes couleurs produit les mêmes résultats. Toutefois, les aspects suivants devraient être considérés lors du choix du colorant de marquage. Tout d&#39;abord, la couleur du fluorophore doit être bien détecté par le microscope used. D&#39;autre part, la longueur d&#39;onde de la lumière émise par les fluorophores doit être suffisamment différente pour éviter que l&#39;encre à travers dans l&#39;autre canal. Cela dépendra des filtres dans le microscope. Et troisièmement, au moins dans nos mains, certaines couleurs produisent des signaux lumineux plus uniforme que d&#39;autres. Nous avons toujours utilisé DAPI (bleu) comme contre qui rend Alexa Fluor 555 (rouge), 488 (vert) et 647 (rouge lointain) de bons choix pour l&#39;étiquetage des sondes. Grâce à notre système d&#39;imagerie, nous avons trouvé Alexa Fluor 555 (rouge) pour produire les signaux brillants, suivis par Alexa Fluor 488 (vert). Alexa Fluor 647 (rouge lointain) présente l&#39;inconvénient qu&#39;il ne peut pas être détectée par l&#39;œil humain et donc aucun signal peut être vu quand on regarde vers le bas le microscope. Ainsi, si cela FISH deux couleurs, nous recommandons la combinaison de colorants rouges et vertes. Deux problèmes principaux peuvent se présenter: cellules de rincer les lames et les signaux faibles. Comment les cellules adhèrent bien à la diapositive est entr extrêmement variablestypes de cellules een, et le meilleur protocole pour régler / ensemencer les cellules doivent être déterminées. Nous avons utilisé avec succès soit chargé positivement ou lames recouvertes de poly-L-lysine (acheté prêt à l&#39;emploi), mais on a découvert les cellules adhèrent globalement mieux lames recouvertes de poly-L-lysine. Nous avons également constaté que lorsque les cellules étaient des zones entières trop denses serait décoller comme une feuille, alors que l&#39;imagerie automatisée a été entravée si les cellules étaient trop rares. Ainsi, si l&#39;échantillon n&#39;est pas trop précieux, des numéros de portables doivent être ensemencées pour déterminer la densité idéale. Si les cellules sont particulièrement sujettes à laver, un stylo barrière hydrophobe peut être utilisé, et pas de poisson peut être effectuée par pipetage soigneusement solutions directement sur la lame. Pipetage également réduit considérablement les volumes de réactifs nécessaires, mais prend beaucoup plus de temps lorsque vous faites plusieurs diapositives. Les signaux faibles sont généralement dues à des sondes pauvres, et c&#39;est bien la peine d&#39;investir du temps dans la prise de bonnes. ADN BAC propre devrait être utiliserd comme matériau qui peut être obtenu par précipitation ou répétée des kits disponibles dans le commerce de départ. La contamination par de l&#39;ADN génomique bactérienne affecte négativement la qualité de la sonde et une manutention prudente lors de la lyse cellulaire et de filtrage du lysat cellulaire est nécessaire pour le garder à un minimum. , Il est cependant pas nécessaire d&#39;utiliser une étape de exonuclease à digérer l&#39;ADN linéaire, car cela réduit considérablement le rendement. Marquage efficace de la sonde est crucial. Le contrôle de la qualité la plus importante pour cette étape est de vérifier la taille des fragments après translation de coupure (voir résultats représentatifs). Un «bon» frottis sera presque toujours dans une sonde de couleur vive. Cependant, nous avons constaté que de temps en temps un certain taux d&#39;alcoolémie ne peut être traitée dans une bonne sonde, et un autre taux d&#39;alcoolémie doit être choisi. Une autre étape importante est la dénaturation thermique. Si la température est trop basse, l&#39;ADN ne sera que partiellement dénaturé et l&#39;hybridation de la sonde sera compromise. Si la température est trop élevée, la structure nucléaire will être perturbé plus que nécessaire. Dans nos mains, 78 ° C sur un bloc chaud inversé est le compromis idéal, mais cela peut varier selon le bloc chaud respectif utilisé. Nous avons eu de bons résultats en utilisant un milieu de montage Vectashield, mais a constaté que SlowFade or a moins d&#39;arrière-plan et préserve le signal fluorescent pour plus longtemps. Nous ne recommandons pas l&#39;utilisation d&#39;un milieu de montage hard-set car nous avons trouvé que cela influe sur la structure 3D et de former des bulles d&#39;air au fil du temps. En conclusion, vive sondes fluorescentes directement marqués ainsi que le protocole de FISH d&#39;ADN décrites ici offrent une solution efficace pour l&#39;analyse robuste et rapide de l&#39;architecture nucléaire qui est applicable à une grande variété de questions biologiques.

ADN hybridation in situ fluorescente (FISH d&#39;ADN) permet la visualisation en trois dimensions de locus de gènes individuels, des domaines sous-chromosomique et des chromosomes entiers, même au cours de toutes les phases du cycle cellulaire. FISH 2D est utilisée pour des études métaphase tandis que les poissons 3D a été largement utilisé pour sonder la relation entre l&#39;organisation spatiale du génome et sa fonction durant l&#39;interphase (1,2 et références citées). Historiquement, les études de co-association ont été réalisées en enquêtant sur des dizaines à des centaines de loci individuels par les poissons. Plus récemment puissant techniques 3C basés à haut débit tels que les 4C et Salut-C ont été développés 3, permettant à l&#39;enquête de la biologie moléculaire diaphonie entre des milliers de différents loci. Bien que les techniques 3C basés et les poissons d&#39;ADN peuvent être des méthodes complémentaires, ils ne répondent pas nécessairement aux mêmes questions. Méthodes basées 3C offrent une lecture de l&#39;ensemble des populations de cellules mixtes, ce qui entraîne une probabilitélité pour les co-associations. En revanche, si faible débit, les techniques de base de POISSONS offrent la possibilité d&#39;analyser les dispositions spatiales des lieux ou des chromosomes dans les cellules individuelles en fonction de leurs différentes étapes du cycle de développement ou de la cellule. Par conséquent, FISH continuera d&#39;être un important outil pour sonder les relations structure-fonction nucléaires. Il ya deux considérations majeures dans la réalisation d&#39;expériences de 3D Fish succès. Ce sont: 1. l&#39;obtention des sondes marquées de manière optimale et 2. choix des traitements cellulaires, y compris la fixation, les étapes de pré-et de post-hybridation, pour préserver la morphologie nucléaire autant que possible tout en faisant ADN suffisamment accessible pour l&#39;hybridation de la sonde. L&#39;étiquetage de la sonde efficace est d&#39;une importance cruciale pour les poissons. Traditionnellement, translation de coupure a été utilisé pour introduire soit haptène ou nucléotides fluorophore conjugué à 4. De même, les kits pseudo-traduction commerciaux sont disponibles pour haptène directe ou l&#39;incorporation des fluorophores, but aussi pour les deux étapes en utilisant l&#39;étiquetage nucléotides aminoallyl et des colorants réactifs aux amines. Ce dernier rend incorporation colorant plus efficace en donnant l&#39;ADN polymérase une molécule moins encombrant pour travailler avec. Plus récemment, des kits pour l&#39;étiquetage non enzymatique de l&#39;ADN ont été développés qui exploitent liaison de coordination de platine aux acides nucléiques. sondes FISH peuvent même être achetés déjà marqué 5. Alors que les kits et les sondes fabriquées commercialement sans doute donner la facilité d&#39;utilisation, ils sont nettement plus cher que d&#39;acheter les composants individuels et la production de sondes en interne. Nous avons optimisé un protocole à faible coût nick de traduction afin de marquer directement plusieurs sondes BAC en plusieurs couleurs. Nous avons découvert que l&#39;obtention d&#39;ADN de BAC très pur est essentiel et se traduit par une exigence pour seulement 10-20 ng de la sonde par diapositive FISH, comparativement à 10 - 20 fois plus lors de la matrice ADN impur est utilisé, résultant en majeure coût et du temps économies. L&#39;utilisation d&#39;amino-allyldUTP permet étiquetage flexiblesondes à disposition colorants amine réactifs (par exemple Alexa Fluor ou Cy-colorants) ou haptènes (par exemple, la biotine, la digoxigénine). Sondes haptène marqués sont détectés par des anticorps conjugué à un fluorophore ou la streptavidine pour amplifier et visualiser le signal. Lumineux sondes directement marquées montrent généralement moins fond coloration et éviter la sur-amplification de signaux, d&#39;où résulte une représentation plus précise de la localisation nucléaire et la morphologie du locus. Il existe plusieurs techniques de poissons qui utilisent différents fixateurs, les pré-traitements et lavages post-hybridation mais ceux-ci tombent généralement dans les catégories suivantes: fixation de glutaraldéhyde avec NaOH dénaturation, la fixation de formaldéhyde avec HCl dénaturation, et la fixation de formaldéhyde avec dénaturation thermique 6-9 . Chacun d&#39;entre eux présente des avantages et des inconvénients. Glutaraldehyde résultats de fixation en bon état de conservation structurelle nucléaire, mais nécessite un traitement avec des agents réducteurs de minimiserl&#39;auto-fluorescence qui en résulte, et traitement à la soude doit être soigneusement contrôlée pour équilibrer suffisante dénaturation de l&#39;ADN et les dommages potentiels à la structure nucléaire 6. fixation de formaldéhyde est moins forte, ce qui donne une probabilité accrue de perturbations de l&#39;architecture nucléaire, mais aussi généralement de donner des signaux forts et plus fiables et les plus faibles autofluorescence 9. Traitement HCl depurinates ADN et supprime les protéines, offrant un bon accès à l&#39;ADN pour les sondes, mais peut aussi introduire des cassures de l&#39;ADN. Chauffage sépare physiquement les deux brins d&#39;ADN résultant de bonne hybridation de la cible et des signaux forts, mais peut provoquer une certaine perturbation de la structure nucléaire 8. La mesure dans laquelle chacune de ces techniques affecte épitopes des protéines varie largement 6,9, ce qui entraîne l&#39;obligation de déterminer expérimentalement pour chaque protéine de protocole optimal à utiliser dans les expériences d&#39;immuno-FISH. Bien qu&#39;il n&#39;existe pas «parfait» DNA FISH technique, ils peuvent tous être utile si elle est bien maîtrisée. Notre objectif était d&#39;optimiser un protocole robuste et reproductible FISH d&#39;ADN pour étudier le positionnement spatial de plusieurs loci dans une variété de types de cellules 10, en se concentrant sur ​​la méthode de chauffage pour la plupart des signaux fiables. Avec cela et l&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;imagerie automatisée nous avons cherché à augmenter le débit pour l&#39;analyse cellulaire unique des arrangements nucléaires.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>NTB</td><td></td><td></td><td>buffer Step 1.1.1 (Voir la liste 'Tampons FISH' ci-dessous)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>Étape 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>Étape 1.1.1 (Voir la liste 'Tampons FISH' ci-dessous)</td></tr><tr><td>Aminoallyl-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>Étape 1.1.1</td></tr><tr><td>ADN polymérase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>Étape 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I RNase recombinante libre</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Étape 1.1.1</td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purification</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Étape 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>Étape 1.1.5, étape 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Étape 1.2.1</td></tr><tr><td>Décapacks de colorant réactif au fluor Alexa pour les applications de microréseaux</td><td>Invitrogen (sondes moléculaires)</td><td>A32750, A32756, A32757</td><td>Étape 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (anhydre) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>Étape 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR Coloration sûre au gel d’ADN</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Étape 1.2.4 (alternative au bromure d’éthidium)</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>Étape 2.1.1.1 (L’ADN Cot-1 peut être fabriqué à la maison en grande quantité et fonctionne tout aussi bien)</td></tr><tr><td>ADN simple brin de testicules de saumon </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>Étape 2.1.1.1</td></tr><tr><td>Formamide désionisé</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>Étape 2.1.1.3 (Danger pour la santé)</td></tr><tr><td>Sulfate de dextran</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>Étape 2.1.1.4 (Voir la liste « Tampons FISH et mélanges réactionnels » ci-dessous)</td></tr><tr><td>Sondes de peinture XMP</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>Étape 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>Lames recouvertes de poly-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>Étape 2.1.2</td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Étape 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu ; m tamis (Souris f&#8211 ; cellules hépatiques uniquement)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>Étape 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Étape 2.1.3 (Inflammable, corrosif, toxicité aiguë, danger pour la santé) (Voir la liste 'Tampons FISH et mélanges réactionnels' ci-dessous)</td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Étape 2.1.3 (Voir la liste 'Tampons FISH et mélanges réactionnels' ci-dessous)</td></tr><tr><td>Saponine de l’écorce de Quillaja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Etape 2.1.4, 2.1.11 (Toxicité aiguë), (Voir la liste « Tampons FISH et mélanges réactionnels » ci-dessous)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Etape 2.1.4, 2.1.11 (Toxicité aiguë, danger pour l’environnement)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Etape 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Etape 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>Étape 2.1.9 (Toxicité aiguë, corrosive)</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td>Étape 2.1.14, 2.2.3 (Danger pour la santé)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>Étape 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Voir la liste « Tampons FISH et mélanges réactionnels » ci-dessous)</td></tr><tr><td>Lamelles 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>Étape 2.1.15</td></tr><tr><td>Lamelles 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>Étape 2.1.15</td></tr><tr><td>Ciment pour caoutchouc</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>Étape 2.1.15 (Inflammable, dangereux pour la santé, danger pour l’environnement)</td></tr><tr>Sondes moléculaires <td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Étape 2.2.8 (Danger pour la santé)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Étape 2.2.10 (support de montage)</td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>N’importe quel fournisseur</td><td></td><td>Étape 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Étape 1.1.6, 1.2.4 (spectroscopie microvolume)</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>Étape 1.2.4</td></tr><tr><td>Bocaux Coplin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td><td>Étape 2.1.3 et ultérieure</td></tr><tr><td>Dewar d’azote liquide </td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Étape 2.1.7</td></tr><tr><td>Base avec couvercle noir (chambre étanche à la lumière)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Étape 2.1.17</td></tr><tr><td>Thermomixeur confort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Étape 2.2.3 (ou utiliser un shaker dans un 37 &deg ; C room)</td></tr><tr><td colspan="4">Imagerie et traitement d’images</td></tr><tr><td>Metafer - Plateforme d’automatisation de l’imagerie</td><td>Logiciel d’imagerie automatisée</td><td>MetaCyte</td><td></td></tr><tr><td>- Analyse FISH interphase automatisée MetaSystems</td><td></td><td></td><td>Logiciel d’imagerie automatisé</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 microscope à</td> épifluorescence <td>Zeiss</td><td></td> droit <td>utilisé avec l’imagerie automatisée</td></tr><tr><td>Microscope confocal IX81 (FV1000)</td><td>Microscope confocal</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane, version 7.3</td><td>Logiciel d’analyse d’images et de modélisation 3D</td><td>Imaris</td><td></td></tr><tr><td>Imagerie volumique scientifique, version 4.1</td><td>Logiciel d’analyse et de déconvolution d’images</td> <td>Huygens</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4"> FISH tampons et mélanges de réaction <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name</td> <td>Composition</td> <td>Comments</td> <> <tr> <td> 10 x tampon NTB</td> <td>0,5 M Tris-HCl, pH 7,5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <> <td></td> <td>0,5 mg/ml BSA</td> <td></td> </tr> <tr> <td>dNTP Mix</td> <td>0,5 mM dGTP</td> <td>Store 50 &mu ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mM dATP</td> <td></td> <tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mM dCTP</td> <td></td> <> <tr> <td><td> <td>0,125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td>4 % PFA</td> <td>Peser 4 g/100 ml de PFA dans du PBS et chauffer à 62 °C. Ajuster le pH avec du NaOH à 7,0 pour dissoudre le PFA restant.</td> <td>Stocker 50 ml d’aliquotes à -20 °C ; C, ne pas recongeler</td> </tr> <tr> <td>solution de saponine à 2 %</td> <td>Dissoudre 2 g de saponine par 100 ml de PBS en agitant étiotherme. Dissoudre et ajuster le pH à 7,0 avec du NaOH. Porter à 1 l avec ddH20 et autoclave. </td> <td>Stocker 5 ml d’aliquotes à -20 &d° ; C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>Peser 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium et ajouter à 80 ml de jj20 . Dissoudre et ajuster le pH à 7,0 avec du NaOH. Porter à 1 l avec ddH20 et autoclave.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>Mélange de sulfate de dextran</td> <td>20 % de sulfate de dextran dans 2 x tampon SSC ; Solution vortex et mélange sur une bascule pendant la nuit.</td> <td>Store 500 &mu ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

robuste fish 3d dna utilisation des sondes directement marquées

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

FISH 3D DNA est devenu un outil important pour analyser organisation tridimensionnelle du noyau, et plusieurs variantes de la technique ont été publiés. Dans cet article, nous décrivons un protocole qui a été optimisé pour la robustesse, la reproductibilité et la facilité d&#39;utilisation. Vives fluorescentes sondes directement marqués sont générés par translation de coupure avec des amino-allyldUTP suivie d&#39;un couplage chimique du colorant. FISH d&#39;ADN 3D s&#39;effectue à l&#39;aide d&#39;une étape de congélation-décongélation pour la perméabilisation de cellules et une étape de chauffage pour la dénaturation simultanée de la sonde et de l&#39;ADN nucléaire. Le protocole est applicable à toute une gamme de types de cellules et une variété de sondes (BAC, plasmides, fosmides, ou des peintures chromosomiques entiers) et permet une imagerie automatisé à haut débit. Avec cette méthode, nous étudions systématiquement localisation nucléaire de trois régions chromosomiques.

Le protocole décrit ici (Figure 1 pour un aperçu) a été utilisé à bon escient pour combiner FISH d&#39;ADN avec capture d&#39;image haut débit pour l&#39;analyse de l&#39;organisation génomique. La génération de sondes de bonne qualité est essentiel à la réussite (voir la discussion). Figure 2 montre deux contrôles de qualité importants pour les sondes FISH. Après translation de coupure, un test d&#39;ADN devrait être visible avec la majeure partie des fragments fonctionnant entre 150 et 700 pb (figure 2A). Après couplage chimique, l&#39;incorporation du colorant fluorescent peut être mesuré par analyse spectroscopique de la sonde (figure 2B). Lors de l&#39;utilisation de bonnes sondes, suivant le protocole de FISH d&#39;ADN se traduit généralement par signaux FISH d&#39;ADN lumineux sur un fond de basses. Nous avons utilisé avec succès ce protocole sur une variété de différents types de cellules et à celles des microscopes épi-fluorescence ou confocal. Imagerie automatisée en utilisant un épi-fluorescence microscope nécessite pointus, signaux FISH facilement identifiables avec peu de fond (figure 3), tandis que la microscopie confocale nécessite des signaux plus intenses. figure 4A montre des images traitées représentatives. Coordonnées nucléaires de signaux FISH peuvent être obtenus, et les relations spatiales des régions génomiques peuvent être calculées (pour un exemple, voir la figure 4B). Nous avons également utilisé des piles d&#39;images obtenues par microscopie confocale pour la modélisation 3D des signaux FISH au sein de leurs territoires chromosomiques (Film 1). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Figure 1. Flux de travail pour l&#39;étiquetage de la sonde et les poissons d&#39;ADN. Préparation de la sonde est représentée en bleu. procédure FISH d&#39;ADN est représenté en noir avec détails donnés dans le vert. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Figure 2. Marquage des sondes par translation de coupure et de contrôle de la qualité de sondes marquées. A) Gel montrant frottis idéal avant de chauffer à inactiver DNase I (piste 1: échelle d&#39;ADN, piste 2 et 3: taux d&#39;alcoolémie après le pseudo-traduction). Fragments devraient être dans la gamme 150-700 pb. Un frottis supplémentaire à ~ 1 kb est fréquemment observée avec succès réactions pseudo-traduction. B) l&#39;analyse du spectre complet Microvolume de sondes marquées. Un pic d&#39;ADN à 260 nm est observée avec un second pic correspondant à la longueur d&#39;onde d&#39;absorption du fluorophore de la sonde est marquée avec: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Indiqués sont les trois sondes ayant une bonne incorporation: pics d&#39;absorption des fluorophores sont d&#39;une hauteur supérieure ou les pics d&#39;ADN similaire. Alexa Fluor 647 a généralement absorbance supérieureque Alexa Fluor 555, qui à son tour a une absorbance supérieure à Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorbe également la lumière à 260 nm, d&#39;où le premier pic pour cette sonde est plus élevé que les autres. Sondes à faible incorporation spectacle absorbance de fluorophore 2-3 fois plus faible que l&#39;absorption de l&#39;ADN. Sondes avec un plus de 2 fois pic de fluorophore supérieur ADN pic contiennent généralement colorant non conjugué qui peut causer fond dans le poisson. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Figure 3. Capture d&#39;écran du logiciel d&#39;imagerie 3D Fish MetaCyte montrant une expérience typique de poisson trois couleurs. L&#39;écran est divisé en plusieurs parties. A) champ de vision (FOV) Raw image capturée par la Metafer / système de numérisation de diapositives MetaCyte. B) Galerie des images de noyaux qui ont identifié l&#39;ONUtraitement d&#39;image dergone et segmentation des signaux de poissons. Différents types de données peuvent être affichées sur chaque image de la galerie. Dans cet exemple, le nombre de cellules est indiqué en haut à gauche avec divers allélique et interlocus distances en haut à droite et de chaque côté en dessous de chaque image. C) nom de la diapositive avec le nombre de noyaux identifiés dans l&#39;analyse. D) Représentation de la lame avec la zone balayée par l&#39; système. E) L&#39;élargissement de la zone numérisée. Des taches blanches représentent des noyaux identifiés par FOV. F) Les données traitées. Dans cet exemple allélique distances maximales entre les signaux verts (en haut) et les signaux rouges (en bas) sont affichés. Les données présentées proviennent de souris P20 cellules germinales. Les sondes sont situés sur des chromosomes différents, couvrant Hbb et les gènes HBA et un cluster histone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Dans les pages = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Figure 4. Exemples d&#39;images traitées et les données de position dérivés. A images) transformés pour E13.5 souris des cellules de foie foetal colorées avec des sondes BAC situés sur différents chromosomes couvrant Myc et KCNQ1 gènes (appelées myc et KvDMR, rouge et vert, respectivement). B) Tukey parcelles boîte à moustaches représentant la distance allélique la distribution, pour les mêmes loci dans 600 noyaux. La distance allélique est tracée en une fraction du rayon du noyau (distance / rayon) pour tenir compte des variations dans la taille nucléaire. les noyaux des cellules ES ont un rayon de l&#39;ordre de 5 um. Sondes rouges sont beaucoup plus rapprochés que les sondes vertes (***: p &lt;0,01, test t apparié). Les données de 10. Film 1. La modélisation en 3D de deux loci dans leur chromosome territory. Deux sondes BAC situés à proximité de chaque extrémité du chromosome de la souris 7 ont été marqués (rouge et rouge lointain, (blanc pseudo-couleur)) et hybridés avec toute une peinture chromosomique (vert) pour les cellules ES de souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

Nous décrivons un protocole robuste et polyvalent pour l&#39;analyse de l&#39;architecture nucléaire par FISH d&#39;ADN 3D à l&#39;aide de sondes fluorescentes directement marqués.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier de manière robuste l'organisation spatiale de loci génomiques spécifiques dans des cellules individuelles. Cela est réalisé en premier lieu en générant des sondes marquées par un fluorochrome destinées à se lier et à mettre en évidence la région génomique d'intérêt. Les étapes suivantes consistent à adhérer, fixer et rendre perméables les cellules d'intérêt sur une lame afin de permettre l'accès des sondes.Ensuite, une dénaturation thermique simultanée de la sonde et de l'ADN cellulaire est suivie par des étapes de lavage d'hybridation de la sonde effectuées pendant la nuit afin d'éliminer la sonde liée de manière non spécifique et de réaliser une contre-marque avec dpi. Pour visualiser le noyau cellulaire, les résultats obtenus par microscopie à fluorescence révéleront finalement la position nucléaire occupée par des régions génomiques spécifiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'organisation nucléaire, telles que la détermination des interactions fonctionnelles entre gènes.L'avantage principal de ce protocole particulier de FISH ADN est qu'il est rapide, robuste et polyvalent. Bien que nous démontrions cette méthode en utilisant des cellules souches E Es, elle peut également être appliquée à de nombreux autres types cellulaires. Des sondes marquées directement, fabriquées à partir de fragments de 100 à 250 kilobases, produisent systématiquement des signaux intenses si des sondes plus petites sont nécessaires.Utilisez des smid de 40 à 50 kilobases, ou même des plasmides contenant des inserts de cinq à 10 kilobases. Identifiez les clones BAC ou smid correspondant à des gènes spécifiques à l’aide des navigateurs génomiques Ensemble ou UCSC. Pour préparer de l’ADN BAC de haute qualité, utilisez soit une précipitation répétée, soit un kit disponible commercialement ; la propreté de la préparation est proportionnelle au volume de sonde requis.Réalisez le marquage en deux étapes. Premièrement, utilisez la traduction NIC pour introduire l'aminonucléotide DUTP. Deuxièmement, utilisez un couplage chimique pour fixer un colorant réactif de type AM.Il est conseillé d'investir du temps dans la préparation de sondes fluorescentes intenses, car elles sont essentielles pour obtenir de forts signaux FISH. Cette procédure peut être réalisée en parallèle du traitement des cellules et n'a pas besoin d'être effectuée en début de journée. Mélangez d'abord 10 à 20 nanogrammes de sonde directement marquée avec six microlitres de CO 1D NA pour six microgrammes.Ensuite, ajouter un microlitre d'ADN simple brin provenant de testicules de saumon pour 9,7 microgrammes. Ajuster le volume du mélange à 100 microlitres avec de l'eau. Puis, ajouter 10 microlitres d'acétate de sodium trois molaire et 275 microlitres d'éthanol, et mélanger par vortexage.Laisser précipiter le mélange pendant au moins une heure à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger le précipité dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Puis laver le culot avec de l'éthanol à 70 % et centrifuger à nouveau pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, séchez le culot à l'air. Puis resuspendez-le dans cinq microlitres de forme désionisée.Incubez l'amide à 37 degrés Celsius tout en agitant à 1000 tr/min, en le protégeant de la lumière avec du papier d'aluminium. Après 30 minutes, ajoutez cinq microlitres de sulfate de dextrine, mélangez et poursuivez l'incubation avec agitation. Pendant encore 10 minutes, la propension des cellules à adhérer à la lamelle varie fortement selon le type cellulaire.Pour chaque type cellulaire, déterminez empiriquement le temps de décantation optimal et la densité cellulaire. Pour des résultats reproductibles, les cellules doivent être en suspension monocellulaire afin d'adhérer les cellules souches embryonnaires de souris sur une lame. Commencez par dessiner un cercle sur la lame délimitant la zone où les cellules seront déposées.À l’aide d’un stylo hydrophobe, préparer une suspension de 20 à 50 000 cellules par 80 à 100 microlitres dans un milieu de culture normal, ajouter la suspension cellulaire dans le cercle et laisser les cellules s’attacher pendant environ trois heures dans un incubateur humidifié. Après l’attachement sur la lame, fixer les cellules en immergeant délicatement la lame dans du PFA à 4 % pendant 10 minutes. La lame doit être placée à plat dans un récipient, comme une boîte à pointes.Utilisation de réactifs à température ambiante dans des bocaux coplan. Commencez par éteindre les cellules avec du chlorure de tris pendant 10 minutes. Ensuite, perméabilisez les cellules à l'aide d'un mélange de sapin et de Triton X-100 pendant 10 minutes.Effectuez maintenant deux lavages des cellules dans le PBS, chaque lavage durant cinq minutes. Après les lavages, incubez les cellules dans du glycérol à 20 % pendant au moins 20 minutes. À ce stade, les lames peuvent être conservées dans du glycérol à 50 % à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines.Un entreposage d'une journée ou plus devrait augmenter l'intensité du signal. Veillez à équilibrer les cellules à température ambiante dans du PBS contenant 20 % de glycérol avant de poursuivre. Ensuite, congeler et décongeler la lame trois fois à l'aide d'azote liquide.Un porte-à-porte à la fois, lorsque le bruit de crépitement cesse. Après quelques secondes, retirez le porte-à-porte sur une serviette en papier pour le décongeler ; attendez que le glycérol congelé opaque disparaisse avant de recongeler le porte-à-porte. Jusqu'à 15 porte-à-porte peuvent être traités confortablement en rotation pendant trois cycles de congélation-décongélation. Lavez maintenant les porte-à-porte deux fois dans le PBS, cinq minutes par lavage.Incubez ensuite les lames dans de l'acide chlorhydrique 0,1 M pendant 30 minutes. Après le traitement à l'acide chlorhydrique, effectuez un autre lavage de cinq minutes dans du PBS. Perméabilisez à nouveau les cellules avec un mélange plus concentré de sapin et de Triton X-100 pendant 30 minutes ; pour éliminer les agents tensioactifs des lames, effectuez deux lavages de cinq minutes au PBS.Les lames sont maintenant prêtes à équilibrer dans du formamide à 50 % dans du XSSC. Cette étape doit durer au moins 10 minutes. Pendant l'équilibration, récupérez la sonde en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis transférez 10 microlitres par point de cellules sur un coverslip de taille appropriée. Retirez une lame du formamide et essuyez tout excès de liquide autour des cellules avec une serviette en papier, mais veillez à ce que le point de cellules ne s'assèche pas.Retournez maintenant la lamelle. Faites-la glisser sur la lame au-dessus des cellules. Scellez la lamelle sur la lame à l’aide de colle caoutchouc.Laisser le ciment sécher complètement et protéger la lame de la lumière. Ensuite, chauffer les lames à 78 degrés Celsius pendant exactement deux minutes sur un bloc chauffant. Cette étape est cruciale et doit être effectuée correctement.Une couverture doit protéger les cellules de la lumière pendant cette étape afin de préserver la morphologie nucléaire le plus possible. Il est essentiel de ne pas laisser les cellules sécher et de s'assurer que le bloc chauffant a la température adéquate. Ensuite, placer les lames dans une boîte opaque à la lumière contenant des serviettes en papier humides pour assurer l'humidité, puis incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius.Commencez cette procédure en retirant le ciment caoutchouté autour des lamelles. Ensuite, placez chaque lame dans du SC en excès X jusqu'à ce que les lamelles se détachent et glissent. Puis, lavez les lames dans du formamide à 50 % dans du SC en deux fois l'excès pendant 15 minutes à 45 degrés Celsius.Gardez un couvercle sur le bain-marie pour les protéger de la lumière. Ensuite, lavez les lames dans du 0,2 XSSC pendant 15 minutes à 63 degrés Celsius. Puis dans du 2 XSSC pendant cinq minutes à 45 degrés Celsius, et enfin à l’eau SE en excès à température ambiante pendant cinq minutes.Les étapes restantes s'effectuent toutes à température ambiante, en commençant par un lavage de cinq minutes dans du PBS, puis en colorant les lames avec du DAPI pendant deux minutes, avant de rincer les lames dans du PBS pendant cinq minutes. Pour monter la lame couvre-objet, appliquer 10 microlitres de milieu de montage par spot cellulaire sur une lame couvre-objet de taille appropriée. Ensuite, sécher l'excès de PBS autour du spot cellulaire sans laisser les cellules sécher.Retournez la lamelle, faites-la glisser sur une lame et scellez-la avec du vernis à ongles en suivant le protocole de préparation de la sonde à poisson. Après la traduction NIC, une traînée d'ADN doit être visible, la majorité des fragments migrant entre 150 et 700 paires de bases. Après couplage chimique, l'incorporation du colorant fluorescent peut être évaluée par analyse spectroscopique du passage de la sonde.Ces étapes de contrôle qualité pour évaluer la qualité de la sonde sont essentielles lorsqu'une telle sonde est utilisée. L'imagerie automatisée à l'aide d'un microscope à fluorescence en épifluorescence était faisable. Cela nécessite des signaux de poisson nets et facilement identifiables, avec un fond faible.Il s'agit d'une image brute du champ d'observation. Les images suivantes représentent des noyaux qui ont été identifiés et analysés automatiquement. Diverses distances interalléliques et interlocus sont indiquées en haut à droite et de chaque côté, sous chaque noyau.Dans cet agrandissement, les taches blanches représentent les noyaux identifiés par champ. Ces histogrammes montrent les distances interalléliques maximales entre les signaux verts ci-dessus et les signaux rouges ci-dessous. Toutes les données proviennent de cellules germinales P 20 avec des sondes situées sur différents chromosomes couvrant les gènes HBB et HBA ainsi qu'un regroupement d'histones.Il s'agit d'exemples de noyaux de foie fœtal marqués avec des sondes arrière ciblant les gènes mic, KC et Q1. À partir de ces images, les coordonnées nucléaires des signaux FISH peuvent être obtenues et les relations spatiales des régions génomiques peuvent être calculées. Les distances interalléliques sont représentées en fraction du rayon du noyau.Les sondes rouges étaient significativement plus rapprochées que les sondes vertes dans ces données. La microscopie confocale, qui nécessite des signaux plus intenses, était également réalisable. Des séries d'images ont été utilisées pour la modélisation 3D des signaux des poissons au sein de leurs territoires chromosomiques.Ces deux sondes en rouge et blanc se trouvent près de chaque extrémité du chromosome sept entier de la souris, dont la coloration totale est montrée en vert. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un caryotype FISH afin d'étudier la position spatiale de loci génomiques spécifiques dans des cellules individuelles. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que tous les traitements peuvent affecter l'architecture nucléaire, et il est essentiel d'inclure des contrôles appropriés en suivant cette procédure.D'autres méthodes, comme l'hybridation in situ immunocytochimique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les relations spatiales entre les gènes et les protéines.

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette publication décrit comment utiliser le poisson Espèces d'Agilent Système d'identification d'identifier les espèces de poisson en extrayant de l'ADN et la PCR et effectuer l'analyse RFLP.

Basées sur l&#39;ADN des espèces de poissons protocole d&#39;identification

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

L’isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) à partir du sang des patients cancéreux sont un type de biopsie liquide non invasive associée à la rechute et à la progression de la maladie. Cette vidéo décrit la technique d’hybridation par fluorescence in situ de l’ADN (DNA FISH) sur des CTC capturés sur un fil médical, pour étudier un gène d’intérêt spécifique.

3D DNA FISH : une technique pour localiser un gène spécifique sur un chromosome

Nous décrivons ici un ensemble de montage...

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).

Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3D

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et...

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

PCR combinée à l'analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Poisson zèbre ont été utilisés comme des organismes modèle génétique fiable dans la recherche biomédicale, en particulier avec l’avènement des techniques de modification génétique. Lorsque les larves phénotypes sont supposés, identification de l’ADN d’extraction et de génotype peut être difficile. Ici, nous décrivons une procédure efficace de génotypage pour les larves de poisson zèbre, par coupure de queue, dès 72 h après la fécondation.

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

3D multicolor DNA FISH représente un outil pour visualiser les loci génomiques multiples dans les noyaux préservés 3D, définissant sans ambiguïté leurs interactions réciproques et leur localisation dans l'espace nucléaire à un seul niveau cellulaire. Ici, un protocole étape par étape est décrit pour un large éventail de cellules primaires humaines.

3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

Découvrez une méthode robuste de FISH 3D ADN utilisant des sondes directement marquées pour analyser l'architecture nucléaire et l'organisation spatiale des loci génomiques dans des cellules uniques.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

Explorer plus de vidéos