Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier l’organisation spatiale de loci génomiques spécifiques dans des cellules uniques de manière robuste. Ceci est réalisé en générant d’abord des sondes marquées par fluorescence pour finalement se lier et mettre en évidence la région génomique d’intérêt. Les étapes suivantes consistent à coller, fixer et perméer les cellules d’intérêt sur une lame afin de permettre l’accès à la sonde.

Ensuite, une dénaturation thermique simultanée de la sonde et de l’ADN cellulaire est suivie d’étapes de lavage d’hybridation de sonde pendant la nuit pour éliminer la sonde non spécifiquement liée et contrer avec dpi. Pour visualiser le noyau cellulaire, les résultats obtenus par microscopie à fluorescence révéleront finalement la position nucléaire occupée par des régions génomiques spécifiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’organisation nucléaire, telles que la détermination des interactions fonctionnelles entre les gènes.

Le principal avantage de ce protocole DNA FISH particulier est qu’il est rapide, robuste et polyvalent. Bien que nous démontrions cette méthode à l’aide de cellules E Es, elle peut également être appliquée à de nombreux autres types de cellules, des sondes directement étiquetées fabriquées à partir de dos de 100 à 250. Les kilobases produisent constamment des signaux lumineux si des sondes plus petites sont nécessaires.

Utilisez des smids de 40 à 50 kilobases, voire des plasmides contenant des inserts de cinq à 10 kilobases. Identifiez les clones arrière ou smid correspondant à des gènes spécifiques à l’aide des navigateurs de génome d’ensemble ou UCSC. Pour préparer un ADN de retour de haute qualité, utilisez soit des précipitations répétées, soit un kit disponible dans le commerce, la propreté de la préparation est proportionnelle au volume de sonde requis.

Effectuez l’étiquetage en deux étapes. Tout d’abord, utilisez la traduction NIC pour introduire l’allèle aminé, DUTP. Deuxièmement, utilisez le couplage chimique pour fixer un colorant réactif moyen AM.

Cela vaut la peine d’investir du temps dans la fabrication de sondes lumineuses, car celles-ci sont essentielles pour les signaux forts des poissons. Cette procédure peut être effectuée en parallèle du traitement des cellules et n’a pas besoin d’être effectuée au début de la journée. Mélangez d’abord 10 à 20 nanogrammes de sonde directement marquée avec six microlitres de CO 1D NA pour six microgrammes.

Ajoutez ensuite un microlitre d’ADN simple brin de testicules de saumon pour 9,7 microgrammes. Ajustez le volume du mélange à 100 microlitres avec de l’eau. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires et 275 microlitres d’éthanol et mélangez par vortex.

Laissez le mélange précipiter pendant au moins une heure à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, faites tourner les précipitations dans une micro-fuge à vitesse maximale pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez le granulé avec de l’éthanol à 70 % et faites-le tourner à nouveau pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, séchez le granulé à l’air. Puis réanimation. Suspendez-le en cinq microlitres de forme désionisée.

Amide à 37 degrés Celsius tout en secouant à 1000 tr/min, vous faites pivoter pour le protéger de la lumière. Après 30 minutes, ajoutez cinq microlitres de mélange de sulfate de dextrine et continuez l’incubation en agitant. Pendant 10 minutes de plus, la propension des cellules à adhérer à Slide varie considérablement selon le type de cellule.

Pour chaque type de cellule, déterminez le temps de stabilisation optimal et la densité cellulaire de manière empirique. Pour des résultats cohérents, les cellules doivent être dans une suspension unicellulaire Pour faire adhérer les cellules ES de souris sur une lame. Commencez par entourer la zone de la lame où les cellules seront repérées.

À l’aide d’un stylo hydrophobe, préparez une suspension de 20 à 50 000 cellules par 80 à 100 microlitres dans un milieu de culture normal, ajoutez la suspension cellulaire dans le cercle et laissez les cellules se fixer pendant environ trois heures dans un incubateur humidifié. Après la fixation de la lame, fixez les cellules en immergeant doucement la lame dans 4 % de PFA pendant 10 minutes. La diapositive doit être à plat dans un plateau comme une boîte à pourboires.

Utilisation de réactifs à température ambiante dans des bocaux coplan. Trempez d’abord les cellules avec du chlorure de tris pendant 10 minutes. Deuxièmement, perméez les cellules à l’aide d’un mélange de sapin et de triton X 100 pendant 10 minutes.

Maintenant, lavez les cellules deux fois dans du PBS pendant cinq minutes par lavage. Après les lavages, incubez les cellules dans 20 % de glycérol pendant au moins 20 minutes. À ce stade, les lames peuvent être stockées dans du glycérol à 50 % à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines.

Le stockage pendant un jour ou plus devrait augmenter la force du signal. Assurez-vous d’équilibrer les cellules à température ambiante avec 20 % de glycérol dans du PBS avant de continuer. Maintenant, congelez et dégelez la lame trois fois avec de l’azote liquide.

Une diapositive à la fois lorsque le crépitement s’arrête. Après quelques secondes, retirez la diapositive sur une serviette en papier pour la décongeler, attendez que le glycérol gelé opaque disparaisse avant de congeler à nouveau la lame, jusqu’à 15 lames peuvent être faites confortablement en rotation pour trois cycles de congélation et de décongélation. Lavez maintenant les lames deux fois dans PBS pendant cinq minutes par lavage.

Ensuite, incubez les lames dans de l’acide chlorhydrique 0,1 molaire pendant 30 minutes. Suivez le traitement à l’acide chlorhydrique avec un autre lavage de cinq minutes au PBS. Maintenant, permétez à nouveau les cellules avec un sapin plus fort et mélangez Triton X 100 pendant 30 minutes pour laver les tensioactifs des lames, utilisez deux lavages PBS de cinq minutes.

Les lames sont maintenant prêtes à s’équilibrer à 50 % sous forme de XSSC. Cela devait durer au moins 10 minutes pendant l’équilibrage, récupérer la sonde pipetée de haut en bas à quelques reprises, puis transférer 10 microlitres par tache cellulaire sur une lamelle de la taille appropriée. Retirez une lame de la forme amide et séchez tout excès de liquide autour des cellules avec une serviette en papier, mais ne laissez pas la tache cellulaire se dessécher.

Maintenant, retournez le couvercle. Glissez-le sur la glissière au-dessus des cellules. Scellez la lamelle de recouvrement sur la lame avec de la colle en caoutchouc.

Laissez le ciment sécher complètement et gardez la diapositive à l’abri de la lumière. Ensuite, chauffez les lames à 78 degrés Celsius pendant précisément deux minutes sur une plaque chauffante. C’est essentiel pour fonctionner correctement.

Une couverture doit protéger les cellules de la lumière lors de cette étape afin de préserver au maximum la morphologie nucléaire. Il est essentiel de ne pas laisser les cellules se dessécher et de s’assurer que le foyer thermique a la bonne température. Ensuite, placez les lames dans une boîte étanche légère avec des serviettes en papier humides pour fournir de l’humidité et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Commencez cette procédure en décollant le ciment en caoutchouc autour des lamelles. Placez ensuite chaque glissière dans X excès de SC jusqu’à ce que les glissières du couvercle se desserrent et glissent. Ensuite, lavez les lames à 50 % d’amide en deux fois l’excès de SC pendant 15 minutes à 45 degrés Celsius.

Gardez un couvercle sur le bain-marie pour les protéger de la lumière. Lavez ensuite les lames dans 0,2 XSSC pendant 15 minutes à 63 degrés Celsius. Puis deux XSSC pendant cinq minutes à 45 degrés Celsius, et enfin un excès de SE à température ambiante pendant cinq minutes.

Les étapes restantes sont toutes à température ambiante, en commençant par un lavage de cinq minutes et PBS colore maintenant les lames avec du dappy pendant deux minutes, puis retient les lames avec du PBS pendant cinq minutes. Pour monter la lamelle, appliquez 10 microlitres de support de montage par tache cellulaire sur la lamelle de la bonne taille. Séchez ensuite l’excès de PBS autour de la tache cellulaire sans laisser les cellules se dessécher.

Retournez le couvercle, glissez-le sur une lame et scellez-le avec du vernis à ongles en utilisant le protocole de préparation de la sonde à poisson. Après la traduction de la NIC, une tache d’ADN devrait être visible, la majeure partie des fragments se situant entre 150 et 700 paires de bases. Après couplage chimique, l’incorporation du colorant fluorescent peut être mesurée par analyse spectroscopique du passage de la sonde.

Ces étapes de contrôle de la qualité pour juger de la qualité de la sonde sont essentielles lors de l’utilisation d’une telle sonde. L’imagerie automatisée avec un microscope à épifluorescence était réalisable. Cela nécessite des signaux de poisson nets, facilement identifiables et avec peu d’arrière-plan.

Il s’agit d’une image brute du champ de vision. Les images suivantes représentent des noyaux qui ont été identifiés et analysés automatiquement. Diverses distances interalléliques et inter-locus sont indiquées en haut à droite et de chaque côté sous chaque noyau.

Dans cet agrandissement, les taches blanches représentent les noyaux identifiés par champ de vision. Ces histogrammes montrent les distances interalléliques maximales entre les signaux verts au-dessus et les signaux rouges en dessous. Toutes les données proviennent de cellules germinales P 20 avec des sondes situées sur différents chromosomes couvrant les gènes HBB et HBA et un groupe d’histones.

Ce sont des exemples de noyaux hépatiques fœtaux colorés avec des sondes arrière couvrant les gènes mic et KC et Q1. À partir de ces images, les coordonnées nucléaires des signaux des poissons peuvent être obtenues et les relations spatiales des régions génomiques peuvent être calculées. Les distances interalléliques sont tracées comme une fraction du rayon du noyau.

Les sondes rouges étaient significativement plus proches les unes des autres que les sondes vertes dans ces données. La microscopie confocale, qui nécessite des signaux plus intenses, était également réalisable. Des piles d’images ont été utilisées pour la modélisation 3D des signaux des poissons dans leurs territoires chromosomiques.

Ces deux sondes en rouge et blanc sont proches de chaque extrémité du chromosome sept de la souris, la peinture du chromosome entier est représentée en vert. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’ADN des poissons afin d’étudier le positionnement spatial de loci génomiques spécifiques dans des cellules uniques. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que tout traitement peut affecter l’architecture nucléaire et il est important d’inclure des éléments appropriés.

D’autres méthodes, comme l’immuno-poisson, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les relations spatiales entre les gènes et les protéines.