Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’assembler et d’utiliser une plate-forme microfluidique semi-automatisée pour cultiver et stimuler de petites populations de cellules et récupérer des lysats cellulaires pour des analyses moléculaires. Ceci est accompli en établissant d’abord des cultures cellulaires à l’échelle microscopique dans des microcapillaires recouverts de fibronectine appelés chambres de perfusion cellulaire. La deuxième étape consiste à connecter les chambres de perfusion à un module de microfluidique numérique ou DMF, qui fournit un moyen flexible par lequel les réactifs sont acheminés vers et depuis les cultures cellulaires à l’échelle microdimensionnelle.

Ensuite, le module DMF délivre le stimulus d’intérêt aux chambres de perfusion et les cellules sont incubées avec le stimulus pendant une durée d’exposition prédéterminée. Enfin, les cellules sont lysées par des moyens chimiques et les lysats sont récupérés sur le module DMF pour une analyse moléculaire. Les lysats récupérés sont ensuite analysés à l’aide de R-T-P-C-R quantitatifs afin de caractériser la réponse transcriptionnelle de la population cellulaire au stimulus.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes conventionnelles de culture cellulaire, il est possible avec cette technique de faire des études de stimulation cellulaire en utilisant de petites quantités de cellules, et également d’utiliser de petites quantités de réactifs. Nos recherches ont démontré que la manipulation précise des cellules et des réactifs à l’échelle microscopique minimise la variabilité d’une expérience à l’autre. La plate-forme est également très polyvalente.

Le module numérique de microflux peut acheminer les cellules et les réactifs vers et depuis les chambres de perfusion avec une grande flexibilité, de sorte que les expériences peuvent être personnalisées et reconfigurées rapidement et facilement. Pour commencer, préparez une solution stérile de 50 microgrammes par millilitre de fibronectine et utilisez un pousse-seringue multivoies pour aspirer 30 microlitres de la solution dans chaque microcapillaire afin d’accélérer le revêtement des surfaces internes des microcapillaires. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis retirer et jeter la solution de fibronectine et laisser sécher les microcapillaires à température ambiante pendant six heures.

Ensuite, connectez les micro-capillaires ou les chambres de perfusion recouverts de fibre nin à un tube en polycarbonate et le tube au pousse-seringue à l’aide de raccords de capite. La configuration illustrée ici utilise un pousse-seringue à orifice d’aide prenant en charge six chambres de perfusion. À l’aide de ruban adhésif, fixez le corps de chaque chambre de perfusion à un bloc chauffant et réglez la température des blocs chauffants à 37 degrés Celsius.

Plongez ensuite les extrémités ouvertes des chambres de perfusion dans un réservoir contenant des cellules, en suspension dans une croissance fraîche, un milieu uniformément dispersé à une concentration de 1 million de cellules par millilitre. Demandez au pousse-seringue d’aspirer 10 microlitres de suspension cellulaire dans chaque chambre de perfusion. Retirez ensuite les extrémités ouvertes des chambres de perfusion de la suspension cellulaire et demandez à la pompe à seringue d’aspirer suffisamment d’air pour déplacer les bouchons de liquide dans les sections fixées au bloc de chaleur.

Laissez les cellules adhérer aux surfaces intérieures recouvertes de fibronectine des chambres de perfusion en les incubant à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Pendant ce temps, transférez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion dans un nouveau réservoir contenant du milieu de croissance frais. Après la période d’adhérence, demandez à la pompe à seringue d’envoyer les bouchons de liquide aux déchets, puis tirez 10 microlitres de milieu frais dans chaque chambre de profusion, puis suffisamment d’air pour positionner le milieu frais sur les cellules collées.

Continuez à incuber les cellules à 37 degrés Celsius, en changeant le milieu toutes les deux heures jusqu’à ce que les cultures soient suffisamment équilibrées et dilatées. Modèle. La plaque inférieure du module DMF avec 46 électrodes d’oxyde d’indium et d’étain. À l’aide de techniques photolithographiques standard, on enduit la plaque inférieure du module DMF de cinq microns de Lene C par dépôt chimique en phase vapeur, puis on recouvre par centrifugation de 50 nanomètres de téflon af.

Ensuite, une couche de spin et un substrat en verre d’oxyde d’indium et d’étain non structuré avec 50 nanomètres de téflon AF à utiliser comme plaque supérieure. Utilisez des cadres de compression métalliques pour fixer les plaques dans un polymère moulé avec des évidements qui maintiennent un espacement de 400 microns entre les plaques. Cet espacement combiné à la taille de l’électrode d’actionnement de 2,5 millimètres carrés définit le volume des gouttelettes à 2,5 microlitres par électrode.

Insérez ensuite des micro-capillaires de transfert revêtus de téflon dans l’espace entre les plaques DMF. Positionnez chacun de manière à ce qu’il s’étende jusqu’au bord de son électrode d’actionnement apparentée à l’extrémité opposée de chaque transfert. Micro capillaire apposer un raccord capite.

Ensuite, engagez les connecteurs électriques pour fournir la tension aux électrodes d’oxyde d’indium 10. Les séquences d’activation des électrodes sont automatisées à l’aide d’une interface électronique contrôlée par ordinateur exécutant des scripts prédéterminés. Remplissez ensuite les modules DMF à bord des réservoirs avec les réactifs appropriés pour la stimulation, le lavage et la lyse des cellules.

Dans certains cas, il est préférable de charger le stimulus lui-même à une étape ultérieure, juste avant son utilisation, en puisant dans les réservoirs embarqués chargés, en distribuant des micro-gouttelettes sur le module DMF. Test, actionnement des micro gouttelettes, y compris leur transport entre le module DMF et les micro capillaires de transfert. Blais. Tout d’abord, préparez le stimulus dans un milieu frais avec 0,1 % de F1 27 onique à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre.

Chargez ensuite 80 à 100 microlitres du stimulus dans son réservoir embarqué désigné. Ensuite, retirez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion du réservoir de fluide et insérez-les dans les raccords de capite fixés aux extrémités des microcapillaires de transfert, puis demandez à la pompe à seringue d’envoyer les bouchons de liquide à l’intérieur des chambres de perfusion vers le conteneur à déchets. Ensuite, demandez au module DMF de générer des gouttelettes de 10 microlitres de stimulus et de les délivrer dans les chambres de perfusion via les microcapillaires de transfert.

Incuber les cellules avec le stimulus à 37 degrés Celsius pendant une à quatre heures si nécessaire. Échangez contre de nouveaux stimuli à intervalles réguliers après la période de stimulation. Demandez à la pompe à seringue d’envoyer le stimulus dans le conteneur à déchets et au module DMF de délivrer une gouttelette de 10 microlitres de tampon de lavage dans chaque chambre de perfusion.

Incuber les cellules avec le tampon de lavage pendant cinq minutes. Remplacez ensuite le tampon de lavage par 10 microlitres de solution de lyse et incubez pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, demandez au pousse-seringue d’envoyer chaque lysat cellulaire au module DMF.

Retirez la plaque supérieure du module DMF en prenant soin de ne pas incliner la plaque sur le côté car cela peut entraîner une contamination croisée entre les gouttelettes. Enfin, collectez les lysats du module DMF ouvert à l’aide d’un lanceur pour l’analyse hors plateforme, comme l’expression des gènes, le profilage par R-T-P-C-R quantitatif afin de préparer la plateforme pour la prochaine expérience. Tout d’abord, plongez les micro-capillaires de transfert, les raccords CAPITE et les plaques du module DMF dans de l’eau de Javel à 10 % pendant 10 minutes à température ambiante, les plaques du module DMF sont rincées à l’isopropanol puis séchées à l’eau déminéralisée et séchées à l’azote gazeux, puis cuites à 160 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Les méthodes d’ensemencement décrites dans ce protocole ont permis d’obtenir l’adhérence d’environ 500 macrophages mirens par chambre de perfusion. Après avoir incubé les cellules avec un milieu de croissance à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, la taille de la population a doublé pour atteindre environ 1000 cellules par chambre de perfusion. Voici les résultats de l’analyse quantitative R-T-P-C-R de quatre gènes connus pour jouer un rôle important dans les réponses immunitaires innées aux bactéries.

Les macrophages ont été cultivés dans des cultures conventionnelles ou à l’échelle microscopique et stimulés avec des bioparticules d’e coli pendant une ou quatre heures. Les barres bleues indiquent l’augmentation moyenne de l’expression génique lors de la stimulation de cellules cultivées de manière conventionnelle, tandis que les barres rouges indiquent l’expression induite dans les cellules cultivées et stimulées. Dans les cultures à l’échelle microscopique, les barres d’erreur indiquent les écarts-types entre les répétitions biologiques de trois expériences indépendantes.

Les résultats du profilage de l’expression génique étaient très similaires, même si les cultures conventionnelles utilisaient des plaques de 96 puits avec environ 50 000 cellules par puits, tandis que les cultures à micro-échelle utilisaient des micro-capillaires avec environ 1000 cellules par chambre de perfusion. Réduction de la consommation de cellules par cinq et réduction de la consommation de réactifs de trois à 50 fois. Par rapport aux expériences conventionnelles.

La méthode pourrait être utilisée pour cultiver pratiquement n’importe quel type de cellule d’adhérence, dans certains cas en utilisant un composant ou une croissance de matrice extracellulaire différent. Les types de cellules de non-observance moyenne peuvent être difficiles, mais les stratégies de connexion cellulaire se sont révélées efficaces dans des contextes similaires. L’approche décrite ici prend en charge la culture à l’échelle microscopique jusqu’à 24 heures.

La plate-forme comprend également toutes les fonctions permettant de faire une culture à long terme, mais un protocole de transmission cellulaire doit être développé. Des modules supplémentaires peuvent être intégrés dans le cub microfluidique numérique via les interconnexions microcapillaires. De cette façon, le DMF sert de hub central pour connecter les modules périphériques afin d’effectuer des flux de travail complexes.

Nous nous sommes principalement concentrés sur la caractérisation des réponses transcriptionnelles de l’hôte aux agents infectieux, mais la plateforme est conçue pour être extrêmement polyvalente et devrait donc prendre en charge une grande variété d’applications de recherche.