Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire

L'objectif général de cette procédure est de concevoir et d'utiliser une plateforme basée sur la microfluidique semi-automatisée afin de cultiver et de stimuler de petites populations cellulaires, puis de récupérer des lysats cellulaires pour des analyses moléculaires. Cette approche consiste d'abord à établir des cultures cellulaires à l'échelle microscopique dans des microcapillaires revêtus de fibronectine, appelés chambres de perfusion cellulaire. La deuxième étape consiste à connecter ces chambres de perfusion à un module de microfluidique numérique ou DMF, qui offre un moyen souple d'acheminer les réactifs vers les cultures cellulaires à l'échelle microscopique et de les en retirer.

Ensuite, le module DMF délivre le stimulus d'intérêt aux chambres de perfusion et les cellules sont incubées avec le stimulus pendant une durée d'exposition prédéterminée. Enfin, les cellules sont lysées par voie chimique et les lysats sont récupérés sur le module DMF pour une analyse moléculaire. Les lysats récupérés sont ensuite analysés par RT-PCR quantitative afin de caractériser la réponse transcriptionnelle de la population cellulaire au stimulus.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes classiques de culture cellulaire réside dans la possibilité d'effectuer des études de stimulation cellulaire en utilisant de faibles quantités de cellules, ainsi que de faibles volumes de réactifs. Nos recherches ont démontré que la manipulation précise des cellules et des réactifs à l'échelle microscopique par la plateforme minimise la variabilité d'un essai à l'autre. La plateforme est également très polyvalente.

Le module numérique de microécoulement peut diriger les cellules et les réactifs vers et depuis les chambres de perfusion avec une grande flexibilité, permettant de personnaliser et de reconfigurer rapidement et facilement les expériences. Pour commencer, préparez une solution stérile de 50 microgrammes par millilitre de fibronectine et utilisez une pompe à seringue multiporte pour aspirer 30 microlitres de la solution dans chaque microcapillaire afin d'accélérer le revêtement des surfaces internes des microcapillaires. Incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis retirez et jetez la solution de fibronectine et laissez les microcapillaires sécher à température ambiante pendant six heures.

Ensuite, reliez les microcapillaires ou chambres de perfusion revêtus de fibre nin à un tube en polycarbonate, puis connectez le tube à la pompe à seringue à l'aide de raccords capite. Le dispositif illustré ici utilise une pompe à seringue à port d'appoint permettant de supporter six chambres de perfusion. À l'aide de ruban adhésif, fixez le corps de chaque chambre de perfusion sur un bloc chauffant et réglez la température du bloc chauffant à 37 degrés Celsius.

Ensuite, immergez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion dans un réservoir contenant des cellules, suspendues dans un milieu de croissance frais, réparties uniformément à une concentration d'un million de cellules par millilitre. Instruisez la pompe à seringue de prélever 10 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque chambre de perfusion. Puis retirez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion de la suspension cellulaire et ordonnez à la pompe à seringue de prélever suffisamment d'air pour déplacer les bouchons liquides vers les sections fixées au bloc chauffant.

Laisser les cellules adhérer aux surfaces intérieures revêtues de fibronectine des chambres de perfusion en les incubant à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Pendant ce temps, transférer les extrémités ouvertes des chambres de perfusion vers un nouveau réservoir contenant un milieu de croissance frais. Après la période d'adhérence, programmer la pompe à seringue pour envoyer les bouchons liquides vers le déchet, puis aspirer 10 microlitres de milieu frais dans chaque chambre de perfusion, suivis d'assez d'air pour positionner le milieu frais au-dessus des cellules adhérentes.

Poursuivre l'incubation des cellules à 37 degrés Celsius, en renouvelant le milieu toutes les deux heures jusqu'à ce que les cultures soient suffisamment équilibrées et étendues. Motif. La plaque inférieure du module DMF avec 46 électrodes en oxyde d'indium-étain. À l'aide de techniques photolithographiques standard, recouvrir la plaque inférieure du module DMF de cinq micromètres de Lene C par dépôt chimique en phase vapeur, puis appliquer une couche de 50 nanomètres de Teflon af par centrifugation.

Ensuite, appliquez par centrifugation une couche de 50 nanomètres de Teflon AF sur un substrat en verre d'oxyde d'indium-étain non gravé, qui servira de plaque supérieure. Utilisez des cadres métalliques de compression pour fixer les plaques dans une empreinte polymère comportant des évidements qui maintiennent un espacement de 400 micromètres entre les plaques. Cet espacement, combiné à la taille de l'électrode d'activation de 2,5 millimètres carrés, définit le volume de la goutte à 2,5 microlitres par électrode.

Insérez ensuite des microcapillaires de transfert revêtus de téflon dans l'espace entre les plaques de DMF. Positionnez chacun de manière à ce qu'il s'étende du bord de son électrode d'activation respective jusqu'à l'extrémité opposée de chaque transfert. Fixez un raccord capite sur le microcapillaire.

Ensuite, connectez les connecteurs électriques afin d'appliquer une tension aux électrodes d'oxyde d'indium 10. Les séquences d'activation des électrodes sont automatisées à l'aide d'une interface électronique contrôlée par ordinateur exécutant des scripts prédéfinis. Puis, remplissez les réservoirs embarqués des modules DMF avec les réactifs appropriés pour la stimulation cellulaire, le lavage et la lyse.

Dans certains cas, il est préférable de charger le stimulus lui-même à une étape ultérieure, juste avant son utilisation, en puisant dans les réservoirs embarqués chargés, pour distribuer de microgouttelettes sur le module DMF. Testez l'activation des microgouttelettes, y compris leur transport entre le module DMF et les microcapillaires de transfert. Blais. Préparez d'abord le stimulus dans un milieu frais contenant 0,1 % de Pluronic F127 à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre.

Ensuite, chargez de 80 à 100 microlitres du stimulus dans son réservoir embarqué désigné. Puis, retirez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion du réservoir de milieu et insérez-les dans les raccords capillaires fixés aux extrémités des microcapillaires de transfert ; ensuite, commandez la pompe à seringue pour envoyer les bouchons liquides présents dans les chambres de perfusion vers le récipient de déchets. Ensuite, ordonnez au module DMF de générer des gouttelettes de 10 microlitres de stimulus et de les acheminer vers les chambres de perfusion via les microcapillaires de transfert.

Incuber les cellules avec le stimulus à 37 degrés Celsius pendant une à quatre heures, si nécessaire. Remplacer par du stimulus frais à intervalles réguliers après la période de stimulation. Indiquer à la pompe à seringue d'envoyer le stimulus vers le récipient de déchets et ordonner au module DMF de délivrer une goutte de 10 microlitres de tampon de lavage dans chaque chambre de perfusion.

Incubez les cellules avec la solution de lavage pendant cinq minutes. Ensuite, remplacez la solution de lavage par 10 microlitres de solution de lyse et incubez pendant cinq minutes supplémentaires. Puis, programmez la pompe à seringue pour envoyer chaque lysat cellulaire vers le module DMF.

Retirez la plaque supérieure du module DMF en prenant soin de ne pas incliner la plaque sur le côté, car cela pourrait entraîner une contamination croisée entre les gouttelettes. Enfin, récupérez les lysats à partir du module DMF ouvert à l’aide d’un pipeteur manuel pour une analyse hors plateforme, telle que l’expression génique, le profilage par R-T-P-C-R quantitatif afin de préparer la plateforme pour la prochaine expérience. Commencez par immerger les microcapillaires de transfert, les raccords CAPITE et les plaques du module DMF dans une solution d’eau de Javel à 10 % pendant 10 minutes à température ambiante, puis rincez les plaques du module DMF avec de l’isopropanol, suivi d’eau déionisée, séchez-les à l’aide d’azote gazeux, et procédez ensuite à une cuisson à 160 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Les méthodes d'ensemencement décrites dans ce protocole ont entraîné l'adhérence d'environ 500 macrophages miren par chambre de perfusion. Après incubation des cellules avec le milieu de croissance à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, la taille de la population a doublé pour atteindre environ 1000 cellules par chambre de perfusion. Les résultats présentés ici proviennent d'une analyse par R-T-P-C-R quantitative de quatre gènes connus pour jouer des rôles importants dans les réponses immunitaires innées aux bactéries.

Les macrophages ont été cultivés dans des cultures conventionnelles ou microscopiques et stimulés par des particules biologiques d’E. coli pendant une heure ou quatre heures. Les barres bleues indiquent l'augmentation moyenne du taux d'expression génique après stimulation des cellules cultivées de manière conventionnelle, tandis que les barres rouges indiquent l'expression induite dans les cellules cultivées et stimulées. Dans les cultures microscopiques, les barres d'erreur représentent les écarts types entre des réplicats biologiques provenant de trois expériences indépendantes.

Les résultats du profilage de l'expression génique étaient très similaires, bien que les cultures conventionnelles aient utilisé des plaques de 96 puits avec environ 50 000 cellules par puits, tandis que les cultures à micro-échelle utilisaient des microcapillaires avec environ 1 000 cellules par chambre de perfusion. La variabilité d'expérience à expérience était au moins comparable, et souvent réduite dans les cultures à micro-échelle, comme l'indiquent les barres d'erreur plus courtes, en travaillant à la micro-échelle. Consommation cellulaire réduite d'un facteur cinq et consommation de réactifs réduite d'un facteur trois à cinquante, par rapport aux expériences conventionnelles.

La méthode pourrait être utilisée pour cultiver pratiquement tout type de cellule adhérente, dans certains cas en utilisant un composant différent de la matrice extracellulaire ou un milieu de croissance différent. Les types cellulaires non adhérents peuvent poser des difficultés, mais des stratégies d’ancrage des cellules se sont révélées efficaces dans des contextes similaires. L’approche décrite ici permet une culture à l’échelle microscopique pendant jusqu’à 24 heures.

La plateforme intègre toutes les fonctions nécessaires pour effectuer également une culture à long terme, mais un protocole de repiquage cellulaire doit être développé. Des modules supplémentaires peuvent être intégrés au cube microfluidique numérique par l'intermédiaire des interconnexions capillaires microscopiques. Ainsi, le DMF sert de centre névralgique permettant de relier les modules périphériques afin d'exécuter des flux de travail complexes.

Nous nous sommes principalement concentrés sur la caractérisation des réponses transcriptionnelles de l'hôte aux agents infectieux, mais la plateforme est conçue pour être extrêmement polyvalente et devrait donc prendre en charge une grande variété d'applications de recherche.